MS436   中文名称: MS436 抑制剂

BRD4 bromodomain (Ki = 30-50 nM)

MS436 通过一系列水介导的相互作用，具有低纳摩尔亲和力（估计 Ki 为 30-50 nM），并且优先选择第一个溴结构域而不是第二个。 MS436 可有效抑制小鼠巨噬细胞中 NF-κB 引导的 NO 和促炎细胞因子白细胞介素 6 生成中的 BRD4 活性。 MS436 代表了一类新型的溴结构域抑制剂，将允许进一步探索 BRD4 的两个溴结构域在基因表达中的生物学功能。 MS436 对 BRD4 BrD1 表现出高亲和力，估计 Ki=30-50 nM，选择性比 BrD2 高 10 倍，这是通过一系列独特的水介导的分子间相互作用实现的[1]。

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值得注意的是，MS436（化合物27）是这组重氮苯化合物中最有效的化合物，在体外荧光各向异性测定中，BRD4 BrD1的Ki优于85 nM（受测定探针结合亲和力的限制；估计Ki为30-50 nM），BrD1的选择性约为BRD4 BrD2的10倍（表2）。据我们所知，这是第一个报道的低纳摩尔亲和力BrD抑制剂，在BRD4的这两种BrD之间具有明显的选择性MS436对BRD4 BrD1的效力是模型化合物MS435的十倍。有趣的是，MS267（化合物28）是一种结合了MS435和MS436关键特征的“杂交”化合物，其效力比MS436降低了约2倍，尽管它仍然比MS435好得多。此外，在另一种杂化化合物MS363（化合物29）中，将Cl置于a环中羟基的邻位，显示出BRD4对两个BrD的结合亲和力降低了2倍。然而，MS267和MS363都保持了BRD4 BrD1对BrD2的选择性。值得注意的是，MS436中R3处的甲基变为甲氧基（30）导致与BRD4 BrD1或BrD2的结合亲和力下降了15倍。这解释了该甲基在模拟生物配体中乙酰赖氨酸甲基中的重要性。最后，我们在A环中使用杂环的努力没有成功。将氮原子引入a环芳香体系导致亲和力下降3倍（31和32 vs.MS435）。[1]

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重氮苯化合物对溴胺的活性[1]
我们针对代表人类溴结构域家族不同亚群的一组溴结构域，分析了四种基于重氮苯的铅BET BrD抑制剂MS435、MS436、MS267和MS363（表3）。所有四种抑制剂都优先与BRD4和BRD3的BrDs结合，而不是与其他受试BrDs结合。值得注意的是，MS436对CBP BrD的活性是初始化合物MS120的四倍。值得一提的是，这些重氮苯化合物与基于地西泮的BrD抑制剂如JQ1、MS417和I-BET具有不同的溴结构域活性特征。具体来说，MS267对BRD7、BPTF和BAZ2b的BrD分别显示出结合亲和力Ki<1.43µM、<1.70µM和2.26µM。MS435显示SMARCA4 BrD的Ki小于6.56µM。这些独特的活性特征使它们成为研究这些非BET BrDs的潜在有用探针。

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重氮苯类化合物在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中的活性[1]
这四种铅重氮苯溴结构域抑制剂对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的MTT试验表明，它们对细胞生长和增殖几乎没有可观察到的细胞毒性。如MTT研究所示，这些溴结构域抑制剂在浓度高达100µM时，细胞存活率相当稳定（图3A）。接下来，我们评估了这些溴结构域抑制剂在阻断BRD4基因转录功能方面的细胞功效。一氧化氮合酶（NOS）催化细胞中L-精氨酸化学计量产生一氧化氮（NO）。巨噬细胞中NO的产生是由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导的，iNOS受NF-κB通路的调节。如我们最近的研究所示，NF-κB对靶基因激活的转录活性取决于其赖氨酸乙酰化介导的与BRD4的相互作用，BRD4通过与二乙酰化组蛋白H4，特别是H4K5ac/K8ac结合，将活化的NF-κB招募到其靶基因位点。事实上，我们观察到，以剂量依赖的方式用重氮苯化合物治疗阻断了LPS刺激下RAW264.7细胞中NF-κB引导的NO产生（图3B）。与它们对BRD4 BrD1的体外结合亲和力一致，MS436对NO产生的抑制活性比MS435更为显著。与BET蛋白对巨噬细胞炎症反应的功能至关重要这一事实相一致，这些重氮苯溴结构域抑制剂有效地阻断了LPS诱导的巨噬细胞中促炎细胞因子白细胞介素-6的表达，如ELISA测定所示（图3C），其中MS436和MS363显示出最深刻的抑制活性，与它们在NO抑制研究中的活性相似。综上所述，这些结果表明，这些铅重氮苯溴结构域抑制剂，特别是MS436，可以有效地调节BRD4在细胞基因转录激活中的功能。

荧光各向异性结合分析[1]
如前所述，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的MS417作为测定探针，在荧光各向异性竞争测定中评估了新合成的重氮苯化合物对各种溴代胺的结合亲和力10。使用BrD蛋白（0.25–1µM）和荧光探针（80 nM）进行竞争实验，并在PBS缓冲液（pH 7.4）中增加未标记竞争配体的浓度，总体积为80µL。在25°C下用Safire 2酶标仪（Tecan）将荧光配体和蛋白质温育1小时后进行测量。在竞争结合试验中，荧光配体浓度≤2Kd，蛋白质浓度设定为50-80%的荧光配体结合。通过修正Nicolovska-Coleska及其同事引入的Cheng-Prussoff方程，计算了竞争配体的离解常数。假设一个位点竞争性结合模型，用于根据使用Prism拟合数据得到的IC50值计算Ki的方程为： 其中[I50]是50%抑制时的游离抑制剂浓度，[L50]是在50%抑制时游离标记配体的浓度，[P0]是在0%抑制时游离蛋白质的浓度。请注意，每个蛋白质探针对的Kd是竞争分析中可分辨Ki的极限。

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蛋白质结晶、X射线衍射数据收集和结构测定[1]
将纯化的BRD4-BrD1蛋白（14mg/mL）与重氮苯BrD抑制剂以蛋白：配体的1:10摩尔比混合。在20°C下，通过将1µL蛋白质溶液与1µL含有15-30%PEG 4000、0.2 M MgCl2、0.1 M Tris-HCl pH 8.5的储层溶液混合，使用坐滴蒸汽扩散法使复合物结晶。在液氮中冷冻之前，将晶体浸泡在添加了20%乙烯甘油作为冷冻保护剂的相应母液中。X射线衍射数据是在布鲁克海文国家实验室的国家同步辐射光源（NSLS）的光束线X6A在100K下收集的。数据使用HKL-2000套件进行处理。使用MOLREP程序通过分子置换求解BRD4-BD1结构，并使用Refmac程序进行结构细化。图形程序COOT用于模型构建和可视化。晶体衍射数据和结构的细化统计数据显示在补充表S2中（见补充信息）。

小鼠巨噬细胞的细胞活性研究[1]
将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞以每孔1×104个细胞的密度铺在96孔板上，在37°C下孵育18小时。然后用高达100µM的重氮苯溴结构域抑制剂处理细胞24小时。在24小时孵育结束时，向每个孔中加入10µL MTT溶液（4 mg/ml），在37°C下孵育4小时。然后去除上清液，将细胞溶解在100µL 100%DMSO中。首先将重氮苯化合物溶解在DMSO中，然后用培养基稀释至0.28至50000 nM的浓度。将DMSO的终浓度调节至0.05%（v/v）。使用EnVison 2104 Multilabel Reader通过570/630nm处的吸光度测量减少的程度。

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LPS诱导小鼠巨噬细胞IL-6和一氧化氮水平的评估 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞在37°C、5%CO2的加湿气氛中在添加了10%FBS的DMEM中培养。用重氮苯铅抑制剂处理96孔板（0.1 mL，3×105个细胞/mL）中的细胞。30分钟后，去除所有上清液，用LPS（1µg/mL）和重氮苯铅抑制剂处理细胞。24小时后，收集上清液，并使用小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒进行测量。铅重氮苯溴结构域抑制剂首先溶解在DMSO中，然后用培养基稀释至0.28至50000 nM的浓度。将DMSO的终浓度调节至0.05%（v/v）。使用EnVison 2104多标记阅读器在570nm处通过吸收读数测量该测定。为了评估LPS诱导的一氧化氮释放，使用EnVison 2104 Multilabel Reader在520 nm下通过分光光度法测量亚硝酸盐的产生。每个实验进行三次，并使用Prism 5.0绘制。使用的曲线拟合方程是“对数（抑制剂）与反应-可变斜率（四个参数）”。

顶级重氮苯溴结构域抑制剂的理化性质 [1]
我们评估了四种顶级重氮苯溴结构域抑制剂 MS435、MS436、MS267 和 MS363 的理化性质，包括 CLogP、配体效率 (LE) 和亲脂性配体效率 (LLE)，以进一步了解它们在细胞研究中的潜力。其中，MS436 表现出最佳的理化性质（表 4）。正如近期毒理学研究表明，CLogP < 3 的化合物在体内具有更低的潜在不良反应。MS436 的 CLogP 为 2.65，因此属于低风险类别。MS436 的配体效率也高于近期报道的 3,5-二甲氧基异噁唑类溴结构域抑制剂，在亲脂性和效力之间取得了极佳的平衡。 MS436 的亲脂性配体效率 (LLE = 3.42) 也远高于其他重氮苯类似物，并且与最近对成功药物分子的统计分析中报道的最可能的 LLE 分布 (2–4) 一致。

[1]. Structure-Guided Design of Potent Diazobenzene Inhibitors for the BET Bromodomains. J Med Chem. 2013 Nov 27;56(22):9251-64.

BRD4由两个乙酰赖氨酸结合溴结构域和一个末端外结构域（ET结构域）组成，是染色质的关键组织者，它通过募集转录因子、组装增强子以及解除RNA聚合酶II复合物的暂停以促进转录延伸，从而指导染色质中的基因激活。BRD4最近已被证实是癌症和炎症的新型表观遗传药物靶点。然而，我们目前对BRD4两个溴结构域的功能差异了解有限，且缺乏选择性抑制剂。本文报道了我们基于结构导向开发的重氮苯基系小分子抑制剂，这些抑制剂针对的是BRD4溴结构域，且在乙酰赖氨酸结合位点具有超过90%的序列同一性。我们的先导化合物MS436通过一系列水介导的相互作用，表现出低纳摩尔级的亲和力（估计Ki值为30-50 nM），并且对第一个溴结构域的亲和力高于第二个。我们证实，MS436 能有效抑制小鼠巨噬细胞中 NF-κB 介导的一氧化氮和促炎细胞因子白细胞介素-6 的生成，从而抑制 BRD4 的活性。MS436 代表了一类新型溴结构域抑制剂，将有助于进一步研究 BRD4 两个溴结构域在基因表达中的生物学功能。[1] 在本研究中，我们报道了基于结构的新型 BET 溴结构域重氮苯类小分子抑制剂的开发。MS436 是我们结合药物化学和构效关系研究进行广泛先导化合物优化后得到的最佳抑制剂。我们将重氮苯类化合物对 BRD4 BrD1 的亲和力提高了 100 倍以上。MS436 对 BRD4 BrD1 的 Ki 值估计为 30–50 nM，对 BrD2 的选择性高 10 倍。这些先导重氮苯化合物具有优异的类药性质。我们进一步证实了四种先导重氮苯溴结构域抑制剂在抑制LPS激活的小鼠巨噬细胞RAW264.7中NK-κB介导的一氧化氮和促炎细胞因子IL-6的产生过程中BRD4转录活性的细胞效力。据我们所知，MS436是首个低纳摩尔级的小分子溴结构域抑制剂，能够选择性地抑制BRD4的两个结构高度相似的溴结构域。与其他近期报道的BRD4溴结构域抑制剂（例如3,4-二氢-3-甲基-2(1H)-喹唑啉酮和3,5-二甲氧基异噁唑）相比，MS436具有显著优势，因为后者对BRD4的两个溴结构域没有选择性。[1]

C18H17N5O3S

383.424281835556

383.105

C, 56.39; H, 4.47; N, 18.27; O, 12.52; S, 8.36

1395084-25-9

135566899

Pink to red solid powder

1.4±0.1 g/cm3

673.7±65.0 °C at 760 mmHg

361.3±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.686

1.78

134.92

3

8

5

27

601

0

S(C1C=CC(=CC=1)/N=N/C1C=C(C)C(=CC=1N)O)(NC1C=CC=CN=1)(=O)=O

DZTGIRNXWSZBIM-QURGRASLSA-N

InChI=1S/C18H17N5O3S/c1-12-10-16(15(19)11-17(12)24)22-21-13-5-7-14(8-6-13)27(25,26)23-18-4-2-3-9-20-18/h2-11,24H,19H2,1H3,(H,20,23)/b22-21+

(E)-4-[2-(2-Amino-4-hydroxy-5-methylphenyl)diazenyl]-N-2-pyridinylbenzenesulfonamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。