MSA-2

STING/stimulator of interferon genes

MSA-2在干扰素-β分泌的化学诱导物的表型筛选中被鉴定。在无细胞测定中，MSA-2结合人和小鼠STING。

当通过 PO 或 SC 方案施用 MSA-2 时，获得了肿瘤和血浆中相当的暴露量。此外，当通过 IT、SC 或 PO 途径给药时，MSA-2 显示出剂量依赖性抗肿瘤活性。根据既定的给药方案，80% 至 100% 的治疗动物肿瘤总体消退 [1]。 MSA-2（PO：60 mg/kg 或 SC：50 mg/kg；单剂量）通过抑制肿瘤生长，显着增加肿瘤中的 TNF-α、白介素-6 (IL-6) 和 IFN-β。 1.]。

生物化学和生物物理方法[1]
在饱和结合实验中，表达全长STING的昆虫微粒体与连续稀释的氚化MSA-2在25°C下孵育18小时。通过过滤终止反应，并通过TopCount NXT仪器测量过滤器结合的放射性。在cGAMP（20µM）存在下测定非特异性结合。在同源竞争结合实验中，将表达hSTING WT或mSTING的昆虫微粒体与连续稀释的未标记MSA-2（含或不含100µM cGAMP）在固定浓度的氚化MSA-2（0.16µM）下孵育16小时（25°C）。如上所述测定STING结合的氚化MSA-2的水平。将N-末端标记的重组胞质结构域STING构建体克隆到pET47b质粒中，在大肠杆菌中表达，并通过亲和和排阻色谱进行纯化。去除用于晶体学和蛋白质NMR的蛋白质的亲和标签。用于SPR实验的STING使用BirA生物素蛋白连接酶本体反应试剂盒进行生物素化。NMR实验中使用的STING是使用含有[15N]-硫酸铵的表达介质产生的。在晶体学方面，与MSA-2或共价二聚体复合的hSTING HAQ的共晶是通过在18°C下进行挂滴蒸汽扩散和条纹晶种制备的。样品是通过在浸入液氮之前冲洗全氟聚醚冷冻油来制备用于同步加速器数据收集的。使用PDB ID 4KSY作为探针通过分子置换来解决结构。蛋白质NMR实验（1D 1H甲基和2D 1H-15N SOFAST-HMQC）使用15N标记的STING（50µM）在30°C下在配备有TCI 5-mm CryoProbe（自动调谐和匹配）的800 MHz Bruker Ascend四通道AVANCE III HD NMR光谱仪上进行。在25°C下，在Varian VNMRS 600 MHz仪器上收集质子（1H）NMR实验以确定MSA-2或化合物2的二聚化性质。对于SPR实验，将生物素化的胞质结构域STING变体（1-3µM，分子量~31 kDa）捕获在链亲和素芯片上，达到~3100个共振单位的最终水平。在含有1mM二硫苏糖醇和3%v/v二甲基亚砜的HBS-EP+缓冲液中，使用单循环注射模式以50µl/min的流速分析连续稀释的化合物溶液。对于ALIS实验，在注射到ALIS系统中之前，将人STING（5µM）与MSA-2和/或化合物2预孵育30分钟。通过使用专有的尺寸排阻色谱柱将蛋白质和蛋白质-配体复合物从未结合的配体中分离出来，随后将其导向用0.2%甲酸水溶液平衡的反相C18柱（40°C）。使用溶剂梯度（0至95%乙腈，2.5分钟）解析解离的配体，并直接洗脱到高分辨率Exactive质谱仪中。

干扰素基因刺激因子（STING）受体配体作为癌症治疗的佐剂正在研究中。已经描述了多种作用，包括诱导免疫原性细胞死亡和增强CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫。然而，STING配体对肿瘤反应性人类γδT细胞活化和效应功能的潜在影响尚未得到研究。我们观察到环状二核苷酸以及新的非二核苷酸STING配体diABZI和MSA-2共同刺激外周血单核细胞内Vδ2 T细胞的细胞因子诱导，但同时抑制其对氨基二膦酸唑来膦酸盐和γδT细胞特异性磷酸抗原的增殖扩增。在纯化的γδT细胞中，STING配体共同刺激细胞因子诱导，但需要单核细胞的存在。STING配体强烈刺激单核细胞分泌IL-1β和TNF-α，并在短期扩增的Vδ2γδT细胞系中共同刺激细胞因子诱导。同时，在两个细胞群中都触发了大量细胞死亡。通过TBK1/IRF3磷酸化和IP-10分泌揭示的STING的激活在表达STING的肿瘤细胞中是不同的。根据肿瘤靶点和时间进程动力学，STING配体在不同程度上调节Vδ2 T细胞对肿瘤细胞的杀伤。我们的研究揭示了STING配体在体外对人γδT细胞的复杂调节作用[3]。

Animal/Disease Models: MC38 tumor-bearing C57BL6 mice [1]
Doses: 60 mg/kg
Route of Administration: Po; subcutaneous injection (50 mg/kg); single dose
Experimental Results: oral or subcutaneous injection of MSA-2 dose can effectively inhibit tumor growth , inducing significant increases in IFN-β, interleukin 6 (IL-6), and TNF-α in tumors.

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All animal experimental procedures were performed according to the guidelines approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, following the guidance of the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. C57BL/6J and NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice were obtained from The Jackson Laboratory, whereas BALB/c and nude NCr mice were obtained from Taconic Biosciences (Germantown, NY). Tumor cells were inoculated subcutaneously into the lower flank. MSA-2 or vehicle was dosed by IT injection, SC injection, or PO gavage. Tumor and body-weight measurements were performed twice per week using calipers and a weigh scale, respectively. Mice were euthanized when tumor volume approached ~2000 mm3, weight loss exceeded 20%, or tumors ulcerated. When necessary, plasma and tumor samples were collected at specific time points and frozen for pharmacokinetics and pharmacodynamics studies. MSA-2 concentration was then determined by liquid chromatography and mass spectroscopy. IFN-β was measured by ELISA, and IL-6 and TNF-α were measured using a Meso Scale kit (custom U-plex kit, Meso Scale Discovery, Rockland, MD). Tumor pH was measured using a bevel-needle–tipped combination microelectrode (Orion 9863BN Micro pH Electrode) inserted up to 1.3 cm into the center of the tumor.

[1]. Pan BS, et al. An orally available non-nucleotide STING agonist with antitumor activity. Science. 2020;369(6506):eaba6098.
[2]. Liu J, et al. Identification of MSA-2: An oral antitumor non-nucleotide STING agonist. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):18. Published 2021 Jan 12.
[3]. Stimulatory and inhibitory activity of STING ligands on tumor-reactive human gamma/delta T cells. Oncoimmunology. 2022; 11(1): 2030021.

C14H14O5S

294.321

294.06

C, 57.13; H, 4.79; O, 27.18; S, 10.89

129425-81-6

Light yellow to brown solid

2.3

101Ų

S1C(C(CCC(=O)O)=O)=CC2=CC(=C(C=C12)OC)OC

APCLRHPWFCQIMG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H14O5S/c1-18-10-5-8-6-13(9(15)3-4-14(16)17)20-12(8)7-11(10)19-2/h5-7H,3-4H2,1-2H3,(H,16,17)

4-(5,6-dimethoxybenzo[b]thiophen-2-yl)-4-oxobutanoic acid

MSA2; MSA 2; MSA-2

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Note: This product requires protection from light (avoid light exposure) during transportation and storage.

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~169.88 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 5 mg/mL (16.99 mM) in 1% (w/v) carboxymethylcellulose (CMC) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。