MT-802

BTK (DC50 = 1 nM); E3 ligase; PROTAC degrader

MT-802 以 9.1 nM 的 DC50 降解 BTK，达到 250 nM 的最大降解阈值[1]。 MT-802是BTK的强效快速降解剂[1]
在初步表征实验中，发现MT-802降解BTK的DC50为9.1 nM，最大降解量为250 nM。由于PROTAC是通过三元复合物驱动机制起作用的，因此许多PROTAC的一个常见观察结果是“钩效应”，即二元物种（BTK-PROTAC和PROTAC-cereblon）在足够高的PROTAC浓度下可以占主导地位，从而降低降解水平。然而，在用≤2.5μM MT-802处理的细胞中，我们没有观察到BTK水平的任何显著反弹（即“钩”）（图S2）。由于非生产性二元复合物的存在减少，预计诱导具有显著正协同作用的三元配合物的PROTAC在其最大作用的浓度范围内会扩大。缺乏可观察到的钩效应表明MT-802诱导了一种具有显著正协同作用的高亲和力三元复合物。接下来，我们合成了SJF-6625，这是一种MT-802的非活性版本，由于泊马度胺部分的戊二酰亚胺环的甲基化，它不能与cereblon结合（图1A）。正如预期的那样，伊布替尼和SJF-6625都不能诱导BTK的降解（图1B），这表明MT-802的作用机制需要与cereblon结合。[1]
因为MT-802可以在250 nM下引发完全的BTK敲除，我们决定在后续的表征实验中使用这种浓度的化合物。在这个浓度下，我们发现MT-802早在4小时就完全降解了BTK，大约50分钟后，总BTK的一半降解了（图1C和图S3A）。用蛋白酶体抑制剂环氧霉素预处理，然后用MT-802处理，没有导致BTK降解，表明蛋白酶体功能是BTK敲除所必需的。在用MLN-4924预处理后也观察到了同样的情况，MLN-4923是一种NEDD8激活酶的抑制剂，它能使奈达酰化，从而激活许多cullin-RING连接酶，包括基于cullin-4A的脑白蛋白复合物。通过用过量的伊布替尼或泊马度胺预处理细胞，表明了直接结合BTK和脑白质的必要性，每种药物都能缓解MT-802对BTK水平的影响（图1D和图S3B）。这些检测表明，MT-802直接与BTK和cereblon结合，以蛋白酶体依赖的方式产生敲除。

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MT-802比伊布替尼增强激酶选择性[1]
在证明MT-802能够有效降解BTK并建立其机制的真实性后，想评估MT-802在激酶内结合的特异性。总的来说，团队和其他人已经证明，当接头和E3靶向部分附着在母体弹头上时，体外激酶结合的效力会降低。众所周知，伊布替尼显示出对其他激酶的脱靶抑制作用，特别是那些与BTK中C481同源的半胱氨酸激酶。由于MT-802缺乏结合C481的丙烯酰胺部分，推断PROTAC可能比伊布替尼结合更少的脱靶激酶。如果得到证实，这一发现将与开发更特异的BTK靶向药物的努力有关，这些药物没有伊布替尼的负面副作用，包括不良心脏、胃肠道和皮肤事件。为了解决这个问题，我们使用了DiscoverX提供的高通量、基于竞争的结合分析服务KINOMEscan。该测定报告结合为“对照百分比”，其中较低的值表示较高水平的激酶结合。使用该测定法，我们在1.0μM下对468种人类激酶平行筛选伊布替尼和MT-802（图S4A、B）。先前收集的伊布替尼激酶范围抑制的数据集与我们自己的数据集显示出合理的相关性（图S4C）。正如预期的那样，BTK是这两种化合物结合最多的激酶之一（伊布替尼和MT-802分别为对照的0.0%和0.25%）。在Tec家族中，唯一同时与ibrutinib和MT-802结合的激酶是Tec（分别为对照的1.9%和3.6%）（图2A）。BMX显示与伊布替尼和MT-802的结合较弱，虽然TXK可以被伊布替尼强结合，但MT-802显示出较弱的结合（分别为对照的3.8%和63%）（表S2）。值得注意的是，在KINOMEscan数据集中，MT-802与ERBB3的结合同样良好（MT-802和伊布替尼均为对照的0.0%），但在OVCAR8细胞中测试时，这种结合没有导致ERBB3降解（图S5）。这个例子强调了之前的观察，即有效的靶点参与并不总是与靶点降解相关，其他因素，如三元复合物亲和力和赖氨酸可及性也可能相关。

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MT-802降解野生型和C481S突变体BTK[1]
虽然没有观察到ERBB3的显著降解，ERBB3在与半胱氨酸481同源的位置上具有丝氨酸，但很高兴看到MT-802仍然保留了与这种取代的激酶的结合。这表明MT-802有可能保留与BTK C481S突变体的相互作用，这在对伊鲁替尼治疗复发的CLL患者中已有报道。建议复发是因为共价受体位点的缺失，这使得激酶仅对伊布替尼提供的可逆抑制敏感，伊布替尼在体外的效力至少低40倍（图3A）。在已经观察到野生型BTK的有效降解后，提出，伊布替尼共价受体位置的丧失对MT-802降解BTK的能力无关紧要，因为PROTAC只需要短暂的结合来诱导泛素化和敲除。因此，C481S抗性背景可以作为一个例子，在这个例子中，PROTAC的事件驱动范式可能会逃避因抑制剂占用范式而产生的抗性机制。

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MT-802在C481S原发性CLL患者样本中的表现优于伊布替尼[1]
为了将PROTAC与其他BTK靶向部分进行比较，研究了患者细胞对MT-802的一系列剂量和暴露时间。从CLL患者的血液中分离出治疗初期的B淋巴细胞。与对永生化细胞系的实验一致，我们观察到所有受试患者的B淋巴细胞中BTK的有效敲除（图S9）。为了研究BTK在多个剂量和时间点上的降解趋势，将混合效应模型应用于对数转换数据，以估计相对于载体或无治疗的差异。比较的p值已使用Dunnett–Hsu方法进行了调整（用于与车辆控制进行比较）。剂量反应研究表明，低至0.1μM PROTAC时，观察到统计学上显著的降解（图4A）。时间过程实验表明，在4至12小时之间观察到最大降解，仅在处理2小时时就出现了统计学上显著降解的第一个迹象（图4B）。然而，采用与在NAMALWA的实验类似的理论基础，我们选择1.0μM PROTAC进行后续实验，因为它能够在12小时内诱导BTK的完全敲除。综上所述，这些实验证实了PROTAC在分离的患者B细胞中降解BTK的能力。

激酶扫描谱和体外激酶竞争性结合分析[1]
伊布替尼和MT-802作为纯DMSO中的1 mM储备溶液提交给DiscoverX用于scanMAX服务，该服务筛选化合物与468种激酶的结合。这两种化合物在1.0μM的测定浓度下进行了筛选。分析原理和设计之前已有报道。对于KdELECT实验，DiscoverX使用了与scanMAX服务相同的平台，仅在11个浓度点上进行了两次扩展。对于KdELECT实验，所用化合物的最高浓度为3.0μM。
Reaction Biology Corp.进行了测量与野生型和C481S BTK结合的体外竞争试验。IC50值是通过拟合从10μM（MT-802）或1μM（伊布替尼和化合物1）开始连续3倍稀释产生的10点剂量-反应曲线来确定的。该测定测量激酶在化合物存在下直接磷酸化底物的能力。所有竞争性结合曲线均在10μM ATP存在下生成。

细胞处理和免疫印迹[1]
对于永生化细胞系，每种PROTAC处理条件下收集2×10~6个细胞，用冰冷的PBS洗涤一次，然后在含有20 mM Tris（pH 8.0）、0.25%脱氧胆酸钠和1%Triton X-100的缓冲液中裂解，并补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（10 mM NaF、2 mM Na3VO4、10 mMβ-甘油磷酸和10 mM焦磷酸钠）。将裂解物在4°C下以15000g离心10分钟，并使用皮尔斯BCA蛋白测定法对上清液中的总蛋白含量进行定量。将30微克蛋白质装载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上，转移到硝化纤维膜上，在4°C下在含有5%脱脂牛奶的1×TBS-Tween（TBS吐温）中摇动，用指定的一抗检测过夜。将HRP偶联的二抗与膜在室温下以1:10000的比例在1×TBS-T的5%脱脂牛奶中孵育1小时。使用ECL Prime化学发光蛋白质印迹检测试剂进行成像，然后使用Bio-Rad ChemiDoc成像仪器进行可视化。随后使用附带的Bio-Rad Image Lab软件对所有蛋白质印迹进行处理和定量。使用了以下一抗：抗肌动蛋白抗体和抗BTK、抗pBTK、抗ITK、抗GAPDH、抗IKZF1和抗IKZF3抗体。除非供应商规范中另有说明，否则所有抗体均以1:1000的稀释度在1×TBS-T的5%脱脂牛奶中使用。
在剂量反应实验中研究的患者原代细胞在每种情况下以1×107个细胞的密度处理24小时。从ACD冷冻瓶中收集基线和复发患者样本，解冻，并在裂解前24小时用1μMMT-802治疗，在裂解前2小时用1微米伊布替尼治疗（然后用1小时的培养基冲洗以模拟体内药物代谢）。所有主要患者样本在裂解前15分钟用抗-IgM刺激。如前所述制备原代细胞裂解物。将细胞悬浮液置于冰上，每10分钟搅拌30分钟，然后在4°C下离心10分钟。使用BCA测定法对每种上清液进行蛋白质定量；将每个样品的50微克装载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。蛋白质的转移和膜的阻断如前所述进行。
使用以下抗体检测蛋白质：抗磷酸化BTK、抗BTK和抗GAPDH。使用的抗体在Blotto阻断剂中稀释1:1000，并在4°C下保持12-72小时，同时不断搅拌。用1×TBS-T洗涤印迹三次，每次10分钟，同时不断搅动，然后在4°℃下与HRP偶联的二抗一起孵育2小时，HRP偶联二抗在1×TB-T的5%脱脂乳中稀释1:5000，同时不断摇动。在显影之前，将印迹再次用1×TBS-T洗涤三次，每次10分钟，同时不断搅拌。印迹是使用两种化学发光试剂之一开发的：WesternBright或SuperSignal。使用计算机密度测定法进行定量。

[1]. Targeting the C481S Ibrutinib-Resistance Mutation in Bruton's Tyrosine Kinase Using PROTAC-Mediated Degradation. Biochemistry. 2018 Jul 3;57(26):3564-3575.

使用不可逆抑制剂伊布替尼抑制布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 已成为治疗慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和其他 B 细胞恶性肿瘤的变革性治疗选择，然而，超过 80% 的 CLL 患者由于伊布替尼共价结合位点的半胱氨酸到丝氨酸突变 (C481S) 而产生耐药性。目前，尚无针对伊布替尼耐药复发的 C481S 患者的有效治疗方案，这些患者的预后较差。为了解决这一问题，我们开发了一种蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，该嵌合体可诱导野生型和 C481S 突变型 BTK 的降解。我们从多个候选 PROTAC 中筛选出先导化合物 MT-802，其主要依据是 MT-802 能够有效诱导 BTK 敲低。 MT-802 可将 BTK 募集至 cereblon E3 泛素连接酶复合物，从而触发 BTK 的泛素化并通过蛋白酶体途径降解。与伊布替尼相比，MT-802 结合的非靶向激酶更少，并且对野生型和 C481S BTK 均保持着相当的效力（纳摩尔浓度下降解率 >99%）。在从携带 C481S 突变的 CLL 患者分离的细胞中，MT-802 能够减少活性磷酸化 BTK 的数量，而伊布替尼则不能。综上所述，这些数据为进一步开展 BTK PROTAC 的临床前研究奠定了基础，使其成为治疗 C481S 突变型 CLL 的一种新策略。[1]

C41H41N9O8

787.8197

787.307

C, 62.51; H, 5.25; N, 16.00; O, 16.25

2231744-29-7

2231744-29-7

138108326

White to off-white solid

2.3

213

3

13

14

58

1470

0

C, 62.51; H, 5.25; N, 16.00; O, 16.25

AJTLGUJXIKEZCQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C41H41N9O8/c42-37-35-36(25-6-9-29(10-7-25)58-28-4-2-1-3-5-28)47-50(38(35)44-24-43-37)27-14-16-48(17-15-27)18-19-56-20-21-57-23-34(52)45-26-8-11-30-31(22-26)41(55)49(40(30)54)32-12-13-33(51)46-39(32)53/h1-11,22,24,27,32H,12-21,23H2,(H,45,52)(H2,42,43,44)(H,46,51,53)

2-[2-[2-[4-[4-amino-3-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]piperidin-1-yl]ethoxy]ethoxy]-N-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-5-yl]acetamide

MT802; MT 802; MT-802; 2231744-29-7; 2-(2-(2-(4-(4-Amino-3-(4-phenoxyphenyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl)piperidin-1-yl)ethoxy)ethoxy)-N-(2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-5-yl)acetamide; 2-[2-[2-[4-[4-amino-3-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]piperidin-1-yl]ethoxy]ethoxy]-N-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-5-yl]acetamide; 2-[2-(2-{4-[4-amino-3-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]piperidin-1-yl}ethoxy)ethoxy]-N-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-5-yl]acetamide; CHEMBL4441907; SCHEMBL21331502; MT-802

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~126.9 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。