NCT-503

PHGDH/3-phosphoglycerate dehydrogenase (IC50 = 2.5 µM)[1]
NCT-503 targets 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), a key enzyme in the serine biosynthesis pathway. PHGDH catalyzes the oxidation of 3-phosphoglycerate to 3-phosphohydroxypyruvate, the first and rate-limiting step in glucose-derived serine synthesis. By inhibiting PHGDH, NCT-503 reduces the production of glucose-derived serine in cells. This leads to G1/S cell cycle arrest in PHGDH-dependent cancer cells. The compound shows minimal cross-reactivity against a panel of 168 GPCRs.

NCT-503 是一种 PHGDH（3-磷酸甘油酸脱氢酶）抑制剂，可阻止细胞以丝氨酸方式合成 3-磷酸甘油酸（IC50=2.5 μM）。NCT-503 与 168 种 GPCR 受体的交叉反应性极低，且对其他脱氢酶无活性。在 NCT-503 的竞争性抑制实验中，发现其对 3-磷酸甘油酸 (3-PG) 和 NAD+ 辅底物的抑制机制为非竞争性抑制。 NCT-503 对 PHGDH 表达细胞系的 EC50 值为 8–16 μM，对 MDA-MB-231 细胞的 EC50 值高 6–10 倍，且对其他 PHGDH 表达阴性细胞系无毒性 [1]。体外实验表明，NCT-503 可抑制 PHGDH，IC₅₀ 值为 2.5 μM。它对其他一系列脱氢酶无活性。该化合物可降低细胞内葡萄糖衍生的丝氨酸生成。它可抑制体外培养的 PHGDH 依赖性癌细胞的生长。在 MDA-MB-468 乳腺癌细胞中，NCT-503 可诱导 G1/S 期细胞周期阻滞。该化合物在 PHGDH 依赖性癌症模型中表现出抗肿瘤活性。详细的体外实验数据可在相关文献中找到。

NCT-503 具有良好的代谢、排泄、折叠和吸收 (ADME) 特性。腹腔注射后，NCT-503 分布广泛，吸收良好，半衰期为 2.5 小时，在腹部达到 Cmax 为 20 μM。NCT-503 治疗可降低 PHGDH 依赖性 MDA-MB-468 异种移植瘤的生长和重量，而对 PHGDH 非依赖性 MDA-MB-231 异种移植瘤的生长和重量无影响 [1]。体内实验表明，NCT-503 可抑制原位异种移植瘤中 PHGDH 依赖性癌细胞的生长。它具有抗肿瘤活性，并能抑制 PHGDH 依赖性肿瘤的生长。该化合物的作用机制涉及减少葡萄糖衍生的丝氨酸的生成，而丝氨酸是 PHGDH 依赖性癌症中核苷酸合成和细胞增殖所必需的。 NCT-503 是研究癌症代谢中丝氨酸生物合成的宝贵工具。

酶活性测定[1]
PHGDH 测定缓冲液包含 50 mM TEA（pH 8.0）、10 mM MgCl2、0.05% BSA 和 0.01% Tween-20。PHGDH 酶缓冲液由测定缓冲液、20 nM PHGDH 和 0.2 mg/mL 二氢黄酶组成。PHGDH 底物缓冲液包含 0.3 mM NAD+、1.25 mM 谷氨酸、0.1 mM 3-磷酸甘油酸、0.2 mM 刃天青、1 µM PSAT1 和 1 µM PSPH。qHTS 在 1536 孔板中进行，使用 BioRAPTR FRD 分液器。每个孔包含等体积的底物缓冲液和测定缓冲液。使用 ViewLux uHTS 微孔板成像仪在室温下分别于 0 分钟和 20 分钟读取孔板。后续实验在黑色384孔板中进行，每孔加入20 µL酶缓冲液，使用HP D300数字分液器按剂量反应顺序加入化合物，随后加入20 µL底物缓冲液。将孔板在室温（25 °C）下孵育，并在0分钟和20分钟时使用Spectramax M5酶标仪在荧光强度模式下读取结果，激发波长λex=550 nm，发射波长λem=600 nm（发射截止波长590 nm）。使用DynaFit 33软件确定抑制模型。酶浓度固定为10 nM，Km、Ki和Vmax允许变化。数据拟合到复杂平衡的竞争性、非竞争性、非竞争性以及混合抑制模型。 Km 值未受到显著影响，F 检验表明，非竞争性模型的拟合概率高于所有其他模型（3-PG 为 91.5%，NAD+ 为 84.6%）。
GAPDH 底物缓冲液包含 210 mM Tris pH 7.4、2.5 mM NaH2PO4 pH 7.4、2 mM DL-甘油醛-3-磷酸、1.75 mM MgCl2、0.01 mM NAD+、0.11 mM 刃天青、0.2 mg/mL BSA 和 0.01% Tween-20。 GAPDH酶缓冲液包含50 mM Tris（pH 7.4）、100 mM NaCl、0.02 mM TCEP、0.01 mM EDTA、0.1 mg/mL BSA、0.42 mg/mL二氢黄酶和2.5 nM GAPDH。GAPDH、GPD1和GPD1L的活性测定均在384孔板中进行，采用与PHGDH测定相同的实验方案和读数方法。GPD1底物缓冲液包含114 mM Tris（pH 7.4）、0.25 mM DHAP、1.14 mM MgCl₂、0.011 mM NADH、0.06 mg/mL BSA和0.011% Tween-20。 GPD1酶缓冲液包含50 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl、0.08 mM TCEP、0.4 mg/mL BSA、0.03 µM EDTA和0.8 nM GPD1。将70 µL底物缓冲液与10 µL酶缓冲液混合。
GPD1L底物缓冲液包含200 mM Tris pH 7.4、0.05 mM sn-G3-P、2 mM MgCl2、0.04 mM NAD+、0.11 mM刃天青、0.1 mg/mL BSA和0.02% Tween-20。 GPD1L酶缓冲液包含50 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl、0.02 mM TCEP、0.42 mg/mL二氢黄酶、0.1 mg/mL BSA、0.008 µM EDTA和16 nM GPD1L。将40 µL底物缓冲液与40 µL酶缓冲液混合。
GAPDH和GPD1L的测定采用与PHGDH测定相同的方案进行。 GPD1 检测采用 NADH 荧光强度降低法（激发波长 λex=340 nm，发射波长 λem=460 nm）。PHGDH 抑制数据分析方法为：计算 ΔRFU（T=0 至 T=30 分钟之间试卤灵荧光强度的增加值），并以 0× 和 1× PHGDH 酶对照组的 ΔRFU 值进行归一化，分别作为 100% 和 0% 的 PHGDH 抑制率。每个 1536 孔板的 32 个孔分别用于设置 0× 和 1× PHGDH 对照组。使用 GraphPad Prism 软件绘制这些归一化的剂量反应曲线，并采用 S 型剂量反应（可变斜率）方程进行拟合。将每个重复实验的IC50值取平均值，以确定平均IC50值及其标准偏差。

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差示扫描荧光法测定在10 µL反应体系中进行，反应体系包含20 mM TEA（pH 8）、100 mM NaCl、1× SYPRO Orange和2 µM PHGDH。使用LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪（λex=465 nm，λem=580 nm）在20至85°C的线性梯度下监测化合物的展开情况。化合物使用HP D300数字分液器进行分液，所有样品中DMSO浓度均标准化为1%。荧光强度一阶导数与温度的关系图在LightCycler软件中生成。

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高通量PAMPA方案[1]
采用搅拌双池PAMPA法测定化合物通过PAMPA被动扩散的渗透性。该人工膜包含一种专有的脂质混合物和十二烷，经优化可预测胃肠道 (GIT) 的被动扩散渗透性。将膜固定在96孔“供体”滤板的塑料基质上，该滤板置于96孔“受体”滤板之上。“供体”孔和“受体”孔均使用pH 7.0的溶液。将10 mM的化合物DMSO储备液用pH 7.4的水性缓冲液稀释至0.05 mM，DMSO的最终浓度为0.5。在室温下进行30分钟的渗透实验期间，“供体”隔室中的测试样品被搅拌。使用紫外酶标仪（Nano Quant，Infinite® 200 PRO，Tecan Inc.，瑞士曼内多夫）测量“供体”隔室和“受体”隔室中的化合物浓度。使用 Pion 公司软件进行渗透性计算，结果以 10⁻⁶ cm/s 为单位。所有样品均进行重复测试，每次测试均包含对照化合物（雷尼替丁、地塞米松和维拉帕米）。

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高通量动力学溶解度测试方案[1]
采用 µSOL 法测定化合物的动力学溶解度，该方法将经典的饱和摇瓶溶解度法应用于 96 孔微孔板，并采用正丙醇共溶剂法。将测试化合物配制成 10 mM DMSO 溶液，用共溶剂稀释后加入水溶液（pH 7.4）。水溶液中药物的最终浓度为 150 µM。样品在室温下孵育 6 小时，然后过滤以去除沉淀。滤液中的药物浓度通过直接紫外吸收法测定（λ：250–498 nm）。使用浓度为 17 µM 的参考药物溶液（溶于助溶剂）对滤液中未知药物的浓度进行定量。使用光谱纯正丙醇作为助溶剂，可抑制参考溶液中的沉淀。动力学溶解度（µg/mL）使用 µSOL Evolution 软件计算。所有样品均进行重复测试，每次运行均包含对照化合物（阿苯达唑、吩唑吡啶和呋塞米）。

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高通量大鼠肝微粒体稳定性测定方案[1]
在 96 孔板中，于单一时间点测定测试化合物的微粒体稳定性。化合物浓度通过 LC/MS/MS 测定，并用于计算体外半衰期。所有样品均进行重复测试，每次运行均测试六个标准对照：丁螺环酮和普萘洛尔（半衰期短）、洛哌丁胺和双氯芬酸（半衰期短至中等）以及卡马西平和安替比林（半衰期长）。检测孵育体系包含0.5 mg/mL微粒体蛋白、1.0 µM药物浓度和NADPH再生体系（含0.650 mM NADP+、1.65 mM葡萄糖-6-磷酸、1.65 mM MgCl2和0.2 U/mL G6PDH），溶于pH 7.4的100 mM磷酸盐缓冲液中。孵育在37 °C下进行15分钟，然后加入555 µL含有0.28 µM阿苯达唑（内标）的乙腈溶液（比例约为1:2）终止反应。在3000 rpm下离心20分钟后，取30 µL上清液转移至分析板，并用1:2 (v/v)乙腈/水稀释5倍，然后进行LC/MS-MS分析。
NCT-503的体外酶活性测定通常使用重组PHGDH酶和3-磷酸甘油酸作为底物。将化合物溶解于DMSO中，并用测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1 mM NAD⁺，1 mM DTT）稀释。加入底物启动反应，并在37°C下孵育30-60分钟。在340 nm处用分光光度计监测NADH的生成。IC₅₀值由剂量反应曲线计算得出。非竞争性抑制通过Lineweaver-Burk分析进行确认。对照组包括DMSO溶剂和已知的PHGDH抑制剂。选择性评估采用一系列脱氢酶。

细胞毒性实验[1]
将细胞以每孔2000个细胞（MDA-MB-468、BT-20、MT-3）或每孔1000个细胞（所有其他细胞系）的密度接种于白色96孔板中，并使其贴壁24小时。化合物溶于DMSO，并使用HP D300化合物分液器进行分装。处理4天后，使用Cell Titer-Glo试剂盒评估细胞活力，并使用SpectraMax M5酶标仪测量发光值。发光值以相同培养基中未处理的对照组进行标准化。在拯救实验中，RPMI培养基中添加了40 µM的腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷、脱氧腺苷、胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷，并每日更换培养基。

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耗氧量测定[1]
使用XF24细胞外代谢分析仪测定完整MDA-MB-468细胞的耗氧量。将85,000个细胞接种于RPMI培养基中，并暴露于浓度为10 µM和50 µM的化合物中。每次测量结果代表六个独立孔的平均值。

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代谢物分析：稳态和标记实验[1]
将细胞以每孔400,000个细胞的密度均匀接种于6孔板中，并使其贴壁24小时。在所有标记实验之前，细胞先用 10 µM 化合物或等体积的 DMSO 在 RPMI 培养基中预处理 1 小时。为了测定稳态代谢物浓度，在预处理前用 PBS 洗涤细胞，然后在不含丝氨酸和甘氨酸的 RPMI 培养基中处理。在标记实验中，用 U-13C-葡萄糖、U-13C-丝氨酸或 U-13C-甘氨酸替代相应的未标记 RPMI 成分。细胞用 4 °C 的 0.9% (w/v) NaCl 溶液（溶于 LCMS 级水中）洗涤，然后在 1 mL/孔的 80:20 (v/v) 甲醇:水溶液中提取，其中含有 0.01 ng/mL 的 Val-d8 和 Phe-d8 作为内标。提取溶剂在氮气下干燥，代谢物样品储存在 -80 °C 直至分析。将接种相同细胞并进行相同处理的三个重复孔进行胰蛋白酶消化，并使用库尔特多功能细胞计数器进行分析，以获得细胞计数和总细胞体积，用于标准化。
对于基于细胞的检测，将PHGDH依赖性癌细胞系（例如MDA-MB-468）培养于含10% FBS的DMEM培养基中。将细胞接种于96孔板中，并用不同浓度（0.1-100 μM）的NCT-503处理24-72小时。使用LC-MS/MS测定细胞培养基中的丝氨酸水平。使用MTT或CellTiter-Glo检测细胞活力。使用流式细胞术进行细胞周期分析。使用BrdU掺入法评估细胞增殖。所有处理均包含载体对照，并重复三次。

小鼠原位异种移植[1]
雌性NOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠，6-8周龄，购自Jackson Laboratories。实验期间所有动物均自由摄食。将动物随机分配至MDA-MB-231或MDA-MB-468肿瘤诱导组，肿瘤分组采用盲法。每只小鼠的第4乳腺脂肪垫注射50万个MDA-MB-231或MDA-MB-468细胞。30天后，肿瘤可触及，将小鼠按肿瘤类型分组，并随机分为两组，盲法分配至载体组或NCT-503治疗组。每组10只小鼠，共40只小鼠。 NCT-503 配制于 5% 乙醇、35% PEG 300 和 60% 30% 羟丙基-β-环糊精水溶液的溶剂中，每日腹腔注射一次。剂量根据小鼠体重调整，注射体积不超过 150 µL。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用修正的椭球体公式计算肿瘤体积：体积 = 0.5 × 宽度² × 长度。
为了定量坏死区域，将固定后的肿瘤组织包埋，并用苏木精-伊红染色切片。使用 Leica Aperio AT2 明场扫描仪扫描切片。使用Leica ImageScope软件手动勾勒并测量肿瘤和坏死横截面区域，以计算坏死百分比。

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小鼠葡萄糖输注[1]
在输注前3-4天，将慢性导管通过手术植入正常或荷瘤小鼠的颈静脉。所有动物禁食6小时（晨间禁食），并在下午1点对自由活动、清醒的动物进行输注，以最大程度地减少与昼夜节律相关的代谢变化。在给予载体或NCT-503（30 mg/kg）后，持续输注U-13C-葡萄糖（30 mg/kg/min），持续3小时。使用戊巴比妥钠对动物进行安乐死，并在5分钟内完整采集所有组织，以保持代谢状态。肿瘤及其邻近肺组织经仔细解剖后，使用BioSqueezer快速冷冻，以确保组织切片内代谢迅速终止。组织在-80℃下保存，并以与细胞相同的方式用80:20 (v/v)甲醇:水提取，之后进行LCMS分析。
在体内，NCT-503通常以口服方式给药于啮齿动物。该化合物配制于合适的载体中，例如0.5%甲基纤维素或PEG基溶液。对于原位异种移植模型，携带PHGDH依赖性肿瘤的小鼠按不同剂量方案（例如，10-50 mg/kg）给药。终点指标包括肿瘤体积测量、生存分析和生物标志物评估（丝氨酸水平、肿瘤组织中PHGDH抑制）。采集血液和组织样本进行药代动力学和药效学分析。所有操作均遵循机构动物护理指南。

NCT-503（分子量 408.48，C₂₀H₂₃F₃N₄S）是一种 PHGDH 抑制剂，IC₅₀ 为 2.5 μM。它是一种非竞争性抑制剂。公开资料中未见关于其详细药代动力学参数（生物利用度、半衰期、清除率）的广泛报道。该化合物对 168 种 GPCR 受体的交叉反应性极低。通常储存于 -20°C。需要进一步开展 ADME 研究以全面表征其药代动力学特征。

公开资料中关于NCT-503的毒理学数据有限。作为一种代谢酶抑制剂，应考虑其对正常丝氨酸生物合成的潜在影响。该化合物仅供研究使用，不适用于人类治疗。开发其治疗用途需进行标准的安全性药理学和毒理学研究。操作该化合物时应遵循标准的实验室安全防护措施。

[1]. A PHGDH inhibitor reveals coordination of serine synthesis and one-carbon unit fate. Nat Chem Biol. 2016 Jun;12(6):452-8.

丝氨酸是蛋白质合成必需的氨基酸，也是嘌呤和脱氧胸苷从头合成所需的一碳单位的来源。在经典的葡萄糖衍生丝氨酸合成途径中，人磷酸甘油酸脱氢酶 (PHGDH) 催化第一步反应，该步骤是限速步骤。即使存在外源丝氨酸，PHGDH 基因的缺失对过表达 PHGDH 的乳腺癌细胞系也具有毒性。本研究采用定量高通量筛选方法鉴定出小分子 PHGDH 抑制剂。这些化合物降低了细胞内葡萄糖衍生丝氨酸的生成，并抑制了体外培养和原位异种移植模型中 PHGDH 依赖性癌细胞的生长。令人惊讶的是，PHGDH 抑制降低了掺入核苷酸中的葡萄糖衍生和外源丝氨酸的一碳单位的数量。我们得出结论，糖酵解丝氨酸合成协调了核苷酸合成中内源性和外源性丝氨酸一碳单元的利用，并且我们认为一碳单元的浪费可能有助于PHGDH抑制剂在体外和体内的疗效。[1]
NCT-503是一种研究级化学探针，用于研究PHGDH功能和癌症代谢中的丝氨酸生物合成。其主要应用包括癌症研究、代谢和药物发现。该化合物尚未获准用于临床，也未进入临床试验。它仅供研究用途，可从多家化学品供应商处购买。其作用机制涉及对PHGDH的非竞争性抑制，从而减少葡萄糖衍生的丝氨酸生成并抑制PHGDH依赖性癌细胞生长。

C20H23F3N4S

408.4872

408.159

C, 58.81; H, 5.68; F, 13.95; N, 13.72; S, 7.85

1916571-90-8

1916571-90-8

118796328

Typically exists as off-white to light yellow solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

474.3±55.0 °C at 760 mmHg

240.6±31.5 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.611

2.61

63.5Ų

1

6

3

28

514

0

S=C(N([H])C1=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(C(F)(F)F)=C([H])C=2[H])C([H])([H])C1([H])[H]

PJNSZIQUFLWRLH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H23F3N4S/c1-14-11-15(2)24-18(12-14)25-19(28)27-9-7-26(8-10-27)13-16-3-5-17(6-4-16)20(21,22)23/h3-6,11-12H,7-10,13H2,1-2H3,(H,24,25,28)

N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-(4-(trifluoromethyl)benzyl)piperazine-1-carbothioamide

NCT-503; NCT 503; NCT-503; 1916571-90-8; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-(4-(trifluoromethyl)benzyl)piperazine-1-carbothioamide; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-[[4-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]piperazine-1-carbothioamide; NCGC00351958-05; N-(4,6-dimethylpyridin-2-yl)-4-{[4-(trifluoromethyl)phenyl]methyl}piperazine-1-carbothioamide; CHEMBL4099051; SCHEMBL17927258; NCT503.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~122.41 mM)
Ethanol : ~13.33 mg/mL (~32.63 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.12 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10 mg/mL (24.48 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2 mg/mL (4.90 mM) in 0.5% methylcellulose 0.2% Tween 80 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。