| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 10 mM * 1 mL in DMSO |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
RIP1 kinase (EC50 = 182 nM)
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| 体外研究 (In Vitro) |
Necrostatin-1 (1-100 μM) 可防止内源性和过度表达的 RIP1 自身磷酸化。已发现 Necrostatin-1 的抗坏死活性主要由 RIP1 介导。 [1] Necrostatin-1 可有效防止多种刺激诱导的一系列细胞类型的坏死性细胞死亡。 necrostatin-1（之前被鉴定为小分子坏死性凋亡抑制剂）的 EC50 为 490 nM，可阻断 Jurkat 细胞中 RIP 激酶和 TNF-α 诱导的坏死性凋亡。 [2]
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| 体内研究 (In Vivo) |
Necrostatin-1 （nec1）是受体相互作用蛋白激酶1 （RIPK1）的特异性小分子抑制剂，可特异性抑制RIPK1的磷酸化。RIPK1通过与受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）相互作用调节炎症和细胞死亡。我们假设Nec-1可能在骨关节炎（OA）患者中具有抗炎作用，因为OA的病理生理涉及炎症相关信号通路的激活和细胞凋亡。在这项研究中，我们探讨了Nec-1对白细胞介素(IL)-1β-诱导的小鼠软骨细胞炎症和不稳定的内侧半月板（DMM）小鼠模型的影响。用Nec-1抑制RIPK1在体内和体外均能显著抑制分解代谢，但不抑制软骨下骨的变化。Nec-1可抑制IL-1β诱导的基质金属蛋白酶（MMP）和ADAMTs5型金属肽酶（ADAMTs5）表达升高。然而，加入高迁移率组盒1 （HMGB1）部分消除了这一作用，表明HMGB1和Nec-1在保护原代软骨细胞中发挥了重要作用。此外，Nec-1降低toll样受体4 （TLR4）和基质细胞衍生因子-1 （SDF-1）的表达，减弱TLR4与HMGB1的相互作用。Western blot结果显示，Nec-1显著抑制il -1β-诱导的NF-κB转录活性，但对MAPK通路无明显抑制作用。在体内采用显微计算机断层扫描、免疫组织化学染色和Safranin O/Fast Green染色评估OA软骨的破坏程度。结果表明，NEC-1能显著降低OA软骨的破坏程度。因此，Nec-1可能是治疗OA的新候选药物[3]。
为了研究坏死性上睑垂在缺血性脑损伤中的作用，我们测定了Nec-1对小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血性损伤的影响。脑室内给予Nec-1显著（P < 0.05）减少MCAO后梗死面积，提示坏死下垂可能参与这种形式的病理性死亡（图6a）。为了进行更详细的分析，我们切换到7-Cl-Nec-1，它在体外显示出更大的活性。7-Cl-Nec-1也提供了显著（P < 0.05）的剂量依赖性梗死面积减少和MCAO后神经学评分的成比例改善（图6b） [2]。 Necrostatin-1 (Nec-1) 是受体相互作用蛋白激酶 1 (RIPK1) 的特异性小分子抑制剂，可阻止 RIPK1 的磷酸化。 |
| 酶活实验 |
体外激酶测定[1]
试验基本上按所述进行。采用标准的Ca3(PO4)2沉淀法，用pcDNA3-FLAG-RIP1载体、编码RIP1突变蛋白的载体或pcDNA3-RIP2-Myc和pcDNA3-FLAG-RIP3载体转染293T细胞。转染后6 h更换培养基，48 h后将细胞溶解在TL缓冲液中，该缓冲液由1% Triton X-100、150 mM NaCI、20 mM HEPES、pH 7.3、5 mM EDTA、5 mM NaF、0.2 mM NaVO3 （ortho）和完整的蛋白酶抑制剂混合物组成。用anti-FLAG M2琼脂糖珠在4℃下免疫沉淀16 h，然后用TL缓冲液洗涤3次，用20 mM HEPES洗涤2次，pH 7.3。在含有20 mM HEPES、pH 7.3、10 mM MnCl2和10 mM MgCl2的15 μl反应缓冲液中，在23-25℃下，不同浓度的坏死性他汀类药物存在下，培养15分钟。在这些试验中，在加入反应之前，将复合原液（在DMSO中）在DMSO中稀释到适当的浓度，以保持所有样品的DMSO最终浓度为3%。加入10 μM的冷ATP和1 mCi的[γ-32P] ATP引发激酶反应，在30℃下反应30 min。在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸停止反应，并进行8%的SDS-PAGE。在Storm 8200磷成像仪上分析显示了RIP1波段。除了小鼠单克隆RIP1抗体和蛋白磁珠或兔RIP1抗体偶联琼脂糖珠外，内源性RIP1激酶反应采用类似的方案。对于重组杆状病毒表达的RIP1，根据制造商的说明书在Sf9细胞中表达蛋白，并使用谷胱甘肽-sepharose bead纯化。蛋白在50 mM Tris-HCl中洗脱，pH 8.0，添加10 mM还原性谷胱甘肽，洗脱后的蛋白用于激酶反应，添加5 ×激酶反应缓冲液（100 mM HEPES, pH 7.3, 50 mM MnCl2, 50 mM MgCl2, 50 μM冷ATP和5 μCi的[γ-32P]ATP）。 RIP1 的磷酸化需要其激酶活性。 RIP1 激酶测定按照方法中的概述进行，在 [γ-32P]ATP 存在下在 30°C 下进行 30 分钟，使用 FLAG 标记的野生型 (WT) 或 RIP1 激酶失活点突变体 (K45M) 的表达构建体或带有 FLAG 标记的野生型 (WT) 或 K45M。 SDS-PAGE 后，对样品进行放射自显影以鉴定 RIP1 带。该放射自显影图以及所有其他放射自显影图显示了放射性谱带基于比率的相对强度。为了确保激酶反应中存在等量的蛋白质，使用抗 RIP1 抗体对珠子样本进行蛋白质印迹分析。 |
| 细胞实验 |
细胞活力测定[3]
采用CCK-8法（Boster）评估细胞增殖和活力。简单地说，原代软骨细胞以每孔10000个细胞的密度在96孔板中接种。第二天，每天加入含有DMSO（载体）或等体积Necrostatin-1 (Nec-1) (30 μmol/L)的培养基。24、48、72 h后更换100 μL含10% CCK-8溶液的培养基，37℃暗箱孵育1 h。用ELX800酶标仪在450 nm处测定吸光度。 细胞凋亡分析[3] 采用Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）试剂盒检测IL-1β (5 ng/mL)加或不加Necrostatin-1 (Nec-1) (30 μmol/L)对软骨细胞凋亡的影响。处理后收集软骨细胞，在冰冷的PBS中洗涤三次，并在结合缓冲液中重悬。然后，在缓冲液中加入5 μL PI和5 μL Annexin V，在4℃的黑暗条件下放置15 min。采用FACS Calibur流式细胞仪对早期和晚期凋亡细胞进行分析。 细胞EC50测定坏死性他汀类药物[1] 如前所述，用人TNFα处理fadd缺陷Jurkat细胞，测定EC50。简单地说，将细胞接种到96孔板中，在10 ng ml-1人TNFα存在和不存在的情况下，用一系列necrostatin浓度（30 nM至100 μM， 11个剂量点）处理24小时。对于这些和所有其他细胞实验，在加入细胞之前，将化合物原液（DMSO）稀释到DMSO的适当浓度，以保持所有样品的DMSO最终浓度为0.5%。采用CellTiter-Glo荧光细胞活力测定法测定细胞活力。计算化合物和tnf处理井与化合物处理井和未处理井的发光比（活力，%），并在GraphPad Prizm中通过非线性回归计算EC50。 |
| 动物实验 |
给药时，我们将7-氯-坏死抑制剂-1 (Nec-1) 或其他衍生物溶解于4%甲基-β-环糊精（Sigma）PBS溶液中，并在指定时间点进行脑室内给药。通常情况下，我们进行两次2 μl的4 mM储备液注射（除非另有说明）。对于闭塞前给药，我们在2小时MCAO闭塞开始前5分钟和闭塞结束后立即进行注射，即再灌注时。对于闭塞后给药，我们在MCAO 2小时后的再灌注时以及再灌注开始后2小时进行注射。对于持续输注，我们在30分钟内输注20 μl化合物。对于闭塞后6小时的注射，我们单次注射4 μl。对于 zVAD.fmk 给药，我们将其添加到坏死抑制剂-1 (Nec-1) 制剂中，总剂量为 160 ng。[2]
12 周龄雄性 C57BL/6 小鼠饲养于光照和温度可控的房间内，并喂以标准饲料。动物体重见补充表 I。根据先前发表的方案（Glasson 等，2007），在右膝建立不稳定内侧半月板 (DMM) 骨关节炎手术模型。将40只小鼠分为四组（每组n=10）：（1）假手术组：假手术小鼠注射15 μL溶剂（5% DMSO、45% PEG300和ddH2O）；（2）假手术+坏死抑制剂-1（Nec-1）组：假手术小鼠注射15 μL坏死抑制剂-1（Nec-1）（0.0468 mg/Kg）；（3）DMM组：DMM手术小鼠注射15 μL溶剂；（4）DMM+坏死抑制剂-1（Nec-1）组：DMM手术小鼠注射15 μL Nec-1。坏死抑制剂-1（Nec-1）溶液或溶剂每周两次关节内注射，持续8周，之后处死小鼠。[3] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫代亚甲基-4-咪唑烷酮是一种有机氮化合物和有机氧化合物，其功能与α-氨基酸相关。
坏死性凋亡是一种细胞坏死机制，由凋亡刺激物（如死亡结构域受体与其相应配体结合）在凋亡执行受阻的情况下诱导产生。尽管坏死性凋亡发生在受调控的条件下，但其形态学特征与不受调控的坏死性凋亡相同。本文报道，坏死抑制剂-1（一种先前发现的小分子坏死抑制剂）是体外死亡结构域受体相关衔接激酶RIP1的选择性变构抑制剂。我们发现RIP1是坏死抑制剂-1发挥抗坏死性凋亡活性的主要细胞靶点。此外，我们还发现另外两种坏死抑制剂，坏死抑制剂-3和坏死抑制剂-5，也靶向坏死性凋亡通路中的RIP1激酶步骤，但其作用机制与坏死抑制剂-1不同。总的来说，我们的数据证实坏死抑制剂是首个RIP1激酶抑制剂，RIP1激酶是参与坏死性凋亡激活的关键上游激酶。[1] 过去十年，细胞凋亡的机制已被广泛研究，但人们对其他形式的程序性细胞死亡知之甚少。尽管Fas/TNFR受体家族的激活会触发经典的“外源性”细胞凋亡通路，但我们证明，在缺乏细胞内凋亡信号的情况下，它能够激活一种常见的非凋亡性死亡通路，我们称之为坏死性凋亡。我们发现，坏死性凋亡的特征是坏死性细胞死亡形态和自噬的激活。我们鉴定了一种特异性强效的小分子坏死性凋亡抑制剂——坏死抑制剂-1 (necrostatin-1)，它能阻断坏死性凋亡的关键步骤。我们证实，坏死性凋亡通过一种不同于细胞凋亡的机制，在体内导致小鼠缺血性脑损伤的延迟发生，并为中风治疗提供了一个新的靶点，具有更长的神经保护窗口期。我们的研究揭示了一条此前未被描述的基本细胞死亡通路，该通路可能与人类疾病具有广泛的关联性。[2] 坏死抑制剂-1 (Nec-1) 是一种特异性的小分子受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1) 抑制剂，它能特异性地抑制RIPK1的磷酸化。RIPK1通过与受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3 (RIPK3) 相互作用来调节炎症和细胞死亡。我们假设Nec-1可能对骨关节炎（OA）患者具有抗炎作用，因为OA的病理生理机制涉及炎症相关信号通路的激活和细胞凋亡。在本研究中，我们探讨了Nec-1对小鼠软骨细胞中白细胞介素（IL）-1β诱导的炎症以及内侧半月板不稳定（DMM）小鼠模型的影响。Nec-1抑制RIPK1可显著抑制体内外的分解代谢，但并不抑制软骨下骨的变化。Nec-1可消除IL-1β诱导的基质金属蛋白酶（MMP）和具有血小板反应蛋白1型基序5的ADAM金属肽酶（ADAMTs5）表达的体外增加。然而，添加高迁移率族蛋白1 (HMGB1) 可部分消除这种效应，表明HMGB1和Nec-1在保护原代软骨细胞中发挥着关键作用。此外，Nec-1降低了Toll样受体4 (TLR4) 和基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 的表达，并减弱了TLR4与HMGB1之间的相互作用。Western blot结果表明，Nec-1显著抑制了IL-1β诱导的NF-κB转录活性，但对MAPK通路没有影响。采用微型计算机断层扫描、免疫组织化学染色和番红O/固绿染色等体内方法评估了OA软骨的破坏程度。结果显示，Nec-1可显著降低OA软骨的破坏程度。因此，Nec-1可能是一种治疗OA的新型候选药物。[3] |
| 分子式 |
C13H13N3OS
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|---|---|---|
| 分子量 |
259.33
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| 精确质量 |
259.077
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| 元素分析 |
C, 60.21; H, 5.05; N, 16.20; O, 6.17; S, 12.36
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| CAS号 |
4311-88-0
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| 相关CAS号 |
Necrostatin-1 (inactive control);64419-92-7
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| PubChem CID |
2828334
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| 外观&性状 |
Light yellow solid powder
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| 密度 |
1.4±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
441.9±37.0 °C at 760 mmHg
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| 熔点 |
151ºC
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| 闪点 |
221.1±26.5 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.1 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.738
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| LogP |
1.26
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| tPSA |
80.22
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| 氢键供体(HBD)数目 |
2
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| 氢键受体(HBA)数目 |
2
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| 可旋转键数目(RBC) |
2
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| 重原子数目 |
18
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| 分子复杂度/Complexity |
373
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
S=C1N(C([H])([H])[H])C(C([H])(C([H])([H])C2=C([H])N([H])C3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C23)N1[H])=O
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| InChi Key |
TXUWMXQFNYDOEZ-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C13H13N3OS/c1-16-12(17)11(15-13(16)18)6-8-7-14-10-5-3-2-4-9(8)10/h2-5,7,11,14H,6H2,1H3,(H,15,18)
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| 化学名 |
5-(1H-indol-3-ylmethyl)-3-methyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: 5% DMSO+45% PEG 300+ddH2O: 10mg/mL 配方 4 中的溶解度: 12.5 mg/mL (48.20 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 5 中的溶解度: 1.67 mg/mL (6.44 mM) in 10% (50% EtOH 50% Cremophor EL) 90% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.8561 mL | 19.2805 mL | 38.5609 mL | |
| 5 mM | 0.7712 mL | 3.8561 mL | 7.7122 mL | |
| 10 mM | 0.3856 mL | 1.9280 mL | 3.8561 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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沙利度胺
KR-33494
LY303511盐酸盐
(Rac)-Benpyrine
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