HER2 (IC50 = 59 nM); EGFR (IC50 = 92 nM)
Neratinib shows no action against tyrosine kinase c-Met[1], Akt, cyclin D1/cdk4, cyclin E/cdk2, cyclin B1/cdk1, IKK-2, MK-2, PDK1, c-Raf, and Tpl-2, among other serine-threonine kinases[1].
Neratinib is much less active in cell lines that express neither EGFR nor HER-2 (3T3, MDA-MB-435, and SW620), and it inhibits the proliferation of cell lines that exhibit high levels of HER-2 (3T3/neu, SK-Br-3, and BT474)[1].
Neratinib (0-2 nM, 12-16 h) arrests BT474 cell cycle at G1-S phase[1].
Neratinib causes cyclin D1 levels to be down-regulated, Akt and MAPK phosphorylation to be inhibited, and p27 to be induced[1].

体外活性：Neratinib 弱抑制酪氨酸激酶 KDR 和 Src，IC50 分别为 0.8 μM 和 1.4 μM，与 HER2 相比活性低 14 倍和 24 倍。 Neratinib 对其他丝氨酸-苏氨酸激酶没有活性，例如 Akt、细胞周期蛋白 D1/cdk4、细胞周期蛋白 E/cdk2、细胞周期蛋白 B1/cdk1、IKK-2、MK-2、PDK1、c-Raf 和 Tpl-2。如酪氨酸激酶 c-Met。 Neratinib 选择性抑制转染 HER2 (3T3/neu) 的 3T3 细胞以及另外两种 HER-2 过表达 SK-Br-3 和 BT474 细胞的增殖，IC50 值为 2-3 nM，显示 >230 倍与未转染的 3T3 细胞以及 EGFR 和 HER2 阴性的 MDA-MB-435 和 SW620 细胞相比，其效力较高。 Neratinib 还抑制 EGFR 依赖性 A431 细胞的增殖，IC50 为 81 nM。 Neratinib 可减少 BT474 细胞中 HER2 受体的自身磷酸化，IC50 为 5 nM，并减少 A431 细胞中 EGFR 的 EGF 依赖性磷酸化，IC50 为 3 nM。 Neratinib 阻断 HER-2 导致下游 MAPK 和 Akt 通路的抑制，IC50 为 2 nM，比曲妥珠单抗更有效。 Neratinib 抑制 BT474 细胞中细胞周期蛋白 D1 的表达和 Rb 易感基因产生的磷酸化，IC50 为 9 nM，导致 G1-S 停滞并最终降低细胞增殖。激酶测定：Neratinib 在 DMSO 中制备为 10 mg/mL 库存，并在 25 mM HEPES（pH 7.5；0.002 ng/mL-20 μg/mL）中稀释。将 HER2（氨基酸 676-1255）或表皮生长因子受体 (EGFR)（氨基酸 645-1186）的纯化重组 COOH 末端片段 [用 100 mM HEPES (pH 7.5) 和 50% 甘油稀释] 进行浓度递增的培养将 Neratinib 溶解在 4 mM HEPES (pH 7.5)、0.4 mM MnCl2、20 μM 钒酸钠和 0.2 mM DTT 中，在 96 孔 ELISA 板中室温反应 15 分钟。通过添加 40 μM ATP 和 20 mM MgCl2 启动激酶反应，并在室温下进行 1 小时。洗涤板，并使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体（15 ng/孔）检测磷酸化。洗涤和增强步骤后，使用 Victor2 荧光读数器（激发波长 340 nm，发射波长 615 nm）检测信号。根据抑制曲线计算抑制受体磷酸化 50% 的 Neratinib 浓度 (IC50)。细胞测定：将细胞（3T3、3T3/neu、A431、BT474、SK-Br-3、MDA-MB-435 和 SW480）暴露于不同浓度的 Neratinib 中 2 或 6 天。使用磺基罗丹明 B（一种蛋白质结合染料）测定细胞增殖。简而言之，用 10% 三氯乙酸固定细胞并用水充分洗涤。然后用 0.1% 磺基罗丹明 B 染色细胞并用 5% 乙酸洗涤。蛋白质相关染料溶解在 10 mM Tris 中，并在 450 nM 处测量吸光度。根据抑制曲线确定抑制细胞增殖 50% 的 Neratinib 浓度 (IC50)。

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Neratinib Maleate (HKI-272) 能有效抑制过表达HER-2的人乳腺癌细胞系BT474和SK-Br-3的增殖，IC50值为2 nM。它也能抑制HER-2转染的小鼠成纤维细胞3T3/neu的增殖 (IC50 = 3 nM)，相较于亲本3T3细胞 (IC50 = 700 nM) 显示出超过200倍的选择性。该化合物抑制过表达EGFR的A431细胞增殖的IC50为81 nM，但对缺乏HER-2和EGFR表达的MDA-MB-435和SW620细胞活性低得多 (IC50 ~690-960 nM)。
Neratinib Maleate (HKI-272) 抑制BT474细胞中配体非依赖性的HER-2自磷酸化以及A431细胞中EGF刺激的EGFR磷酸化，IC50值分别为5 nM和3 nM。
用 Neratinib Maleate (HKI-272) 处理BT474细胞导致下游信号通路被抑制，包括MAPK和Akt的磷酸化 (两者IC50均为2 nM)、细胞周期蛋白D1水平下调 (IC50 = 9 nM)、视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化减少以及p27诱导。这导致细胞周期停滞在G1-S期 (减少S期细胞的IC50 = 2 nM)，并在更高浓度下出现指示细胞凋亡的亚G1期细胞群增加。
Neratinib Maleate (HKI-272) 作为不可逆抑制剂发挥作用。去除化合物后，对受体磷酸化的抑制仍然持续。使用[14C]HKI-272证明了其与HER-2激酶结构域的直接共价结合。
相比之下，曲妥珠单抗 (高达30 µg/ml) 在BT474细胞中仅部分抑制HER-2磷酸化和下游信号传导。 [1]

口服 Neratinib 可显着抑制 3T3/neu 异种移植物的生长，剂量为 10、20、40 和 80 mg/kg/天时，抑制率分别为 34%、53%、98% 和 98%。与 40 mg/kg/天给药 1 小时内 HER-2 磷酸化抑制 84% 一致，Neratinib 在 5、10 剂量时抑制 BT474 异种移植物的生长 70-82%、67% 和 93%和 40 毫克/公斤/天，分别。 Neratinib 对 SK-OV-3 异种移植物也有效，5 mg/kg/天和 60 mg/kg/天的抑制率分别为 31% 和 85%。 Neratinib 对 EGFR 依赖性 A431 异种移植物的效力低于 HER-2 依赖性肿瘤，在 5 和 20 mg/kg/天时分别具有 32% 和 44% 的抑制作用。 Neratinib 对表达低水平 HER-2 和 EGFR 的 MCF-7 和 MX-1 异种移植物几乎没有活性，在 80 mg/kg/天时仅抑制 28%，表明 Neratinib 对表达 HER-2 或 EGFR 的细胞具有选择性活性。

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在裸鼠中，每日一次口服给予 Neratinib Maleate (HKI-272) 可抑制HER-2依赖性肿瘤异种移植物的生长。在3T3/neu模型中，20-80 mg/kg/天的剂量可产生53-98%的肿瘤生长抑制。
在BT474乳腺癌异种移植模型中，5-40 mg/kg/天的剂量可产生70-93%的肿瘤生长抑制。单次口服40 mg/kg的剂量，在给药后1小时和6小时分别抑制BT474肿瘤中HER-2磷酸化达84%和97%，24小时后抑制率仍维持在43%。
在SK-OV-3卵巢癌异种移植模型中，5-60 mg/kg/天的剂量可产生31-85%的抑制。
在EGFR依赖的A431异种移植模型中，Neratinib Maleate (HKI-272) 效力较低，40 mg/kg/天产生76%的抑制，效果弱于在HER-2模型中所见。
该化合物在HER-2/EGFR低表达的乳腺癌细胞系MCF-7的异种移植模型中活性极微 (80 mg/kg/天时抑制率为28%)。 [1]

将来那替尼在 DMSO 中制备成 10 mg/mL 储备液，在 25 mM HEPES（pH 7.5；0.002 ng/mL–20 μg/mL）中稀释。在 96 孔 ELISA 板中，将 HER2（氨基酸 676-1255）或表皮生长因子受体（EGFR）（氨基酸 645-1186）的纯化重组 COOH 末端片段稀释在 100 mM HEPES（pH 7.5）和 50% 中。甘油。然后将混合物与浓度递增的 Neratinib 在 4 mM HEPES (pH 7.5)、0.4 mM MnCl2、20 μM 钒酸钠和 0.2 mM DTT 中在室温下孵育 15 分钟。添加 40 μM ATP 和 20 mM MgCl2 以启动激酶反应，然后在室温下运行一小时。清洗板，然后使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体（15 ng/孔）检测磷酸化。使用 Victor2 荧光读数器（激发波长为 340 nm，发射波长为 615 nm），在洗涤和增强阶段后检测信号。抑制曲线用于确定受体磷酸化被抑制 50% 时 Neratinib 的浓度 (IC50)。

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HER-2和EGFR细胞质结构域的活性通过时间分辨荧光法的自磷酸化测定来测量。化合物在DMSO中制备为10mg/ml储备，并在25mm HEPES（pH 7.5；0.002ng/ml–20μg/ml）中稀释。酶[在100 mm HEPES（pH 7.5）和50%甘油中稀释]在96孔ELISA板中与4 mm HEPES中的抑制剂、0.4 mm MnCl2、20μm钒酸钠和0.2 mm DTT在室温下孵育15分钟。通过加入40μm ATP和20mm MgCl2引发激酶反应，并在室温下进行1小时。洗涤板，使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体（15ng/孔；Wallac）检测磷酸化。根据制造商的建议进行洗涤和增强步骤后，使用Victor2荧光阅读器（激发波长340nm，发射波长615nm）检测信号。根据抑制曲线计算抑制受体磷酸化50%的化合物浓度（IC50）。[1]

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使用在细菌、昆虫或人类细胞系中表达的重组酶进行其他激酶的检测。除c-Met、KDR、src（酪氨酸激酶）和MEK1（双特异性）外，所有使用的酶都是丝氨酸-苏氨酸激酶。使用的底物是肽（Akt、IKK-2、MK2、PDK1、src和Tpl2）、蛋白质（细胞周期蛋白D1/CDK4、细胞周期蛋白E/CDK2、细胞周期素B1/CDK1和c-Raf）、聚谷氨酸4酪氨酸（KDR）或激酶本身（自磷酸化；c-met）。使用TMB过氧化物酶底物测量细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶（cdk）的磷酸化，使用LabChip测量MK-2，或使用DELPHIA/LANCE 测量所有其他激酶的磷酸化。

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HER-2和EGFR的胞质结构域，以重组His标签蛋白的形式在昆虫细胞中表达，并通过镍亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE评估，纯度>80%。
激酶活性测定中，酶与抑制剂在含有HEPES、MnCl2、钒酸钠和DTT的缓冲液中于室温孵育15分钟。通过加入ATP和MgCl2启动激酶反应，并在室温下进行1小时。使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体，通过时间分辨荧光法 (DELFIA) 检测受体自磷酸化。根据抑制曲线计算IC50值。 [1]

将不同浓度的 Neratinib 应用于细胞（3T3、3T3/neu、A431、BT474、SK-Br-3、MDA-MB-435 和 SW480），持续两天或六天。一种称为磺基罗丹明 B 的蛋白质结合染料用于测量细胞增殖。总之，细胞用10%三氯乙酸固定后用水彻底清洗。用 0.1% 磺基罗丹明 B 染色细胞后，用 5% 乙酸冲洗。将蛋白质相关染料溶解在 10 mM Tris 中后，在 450 nM 处计算吸光度。抑制曲线用于计算neratinib抑制50%细胞增殖的浓度（IC50）。

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细胞增殖实验中，细胞接种于96孔板。次日，加入化合物的系列稀释液。培养2天 (BT474细胞为6天) 后，使用磺基罗丹明B (SRB) 蛋白结合染料评估细胞增殖。细胞用三氯乙酸固定，SRB染色，溶解后的染料通过分光光度法测定。根据抑制曲线确定IC50值。
用于分析受体及信号蛋白磷酸化或表达时，细胞用化合物处理指定时间 (例如，检测受体磷酸化处理3小时，检测下游标志物处理过夜)。随后裂解细胞，蛋白质经SDS-PAGE分离，转印至硝酸纤维素膜，通过特定抗体和增强化学发光法进行免疫印迹检测。
结合研究中，将重组的HER-2胞质结构域或完整的BT474细胞与[14C]HKI-272在存在或不存在过量未标记化合物的情况下孵育。样品变性后，经SDS-PAGE分离，并通过荧光自显影分析。
细胞周期分析中，用化合物处理过夜的BT474细胞用溴脱氧尿苷 (BrdUrd) 进行脉冲标记。细胞固定、变性后，用抗BrdUrd-FITC抗体和碘化丙啶染色，通过流式细胞术分析以确定处于不同细胞周期阶段的细胞百分比。 [1]

雌性无胸腺（裸鼠）肿瘤异种移植[1]
10、20、40、60 或 80 mg/kg/天
灌胃，42 天

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肿瘤异种移植研究[1]
将肿瘤细胞（在组织培养中维持）或肿瘤碎片皮下植入雌性无胸腺（裸鼠）侧腹。对于雌激素依赖性细胞系（BT474、MCF-7 和 SK-OV-3），在肿瘤植入前 1 周，将激素缓释片（0.72 mg 17-β 雌二醇，60 天释放）植入动物体内。此外，将 SK-OV-3 细胞悬浮于 Matrigel 基底膜基质中进行植入。在肿瘤大小达到 90–200 mg 后开始治疗，并将动物随机分配到不同的治疗组（分期，第 0 天）。对于 3T3/neu 异种移植瘤，治疗于肿瘤植入后第二天（第 0 天）开始。HKI-272 配制于 0.5% 甲基纤维素-0.4% 聚山梨醇酯-80（吐温 80）溶液中，每日通过灌胃法口服给药。每 7 天测定一次肿瘤质量 [(长 × 宽²)/2]。除 3T3/neu 外，所有异种移植瘤研究中的肿瘤生长均以相对肿瘤生长表示：即平均肿瘤质量与第 0 天平均肿瘤质量的比值。肿瘤生长抑制率以载体对照组为参照进行计算。对数据进行对数转换后，采用单尾 Student's t 检验（方差相等）来验证抑制作用的统计学意义。[1]

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异种移植瘤中 HER-2 磷酸化。[1]
将 BT474 肿瘤碎片（约 30 mm³）皮下植入无胸腺雌性裸鼠（每组 5 只）。当肿瘤体积达到 200–300 mg 时，给予动物单次口服剂量（40 mg/kg）的 HKI-272（溶于 pH 2.0 的水中）。分别于 1、3、6 和 24 小时切除对照组和治疗组动物的肿瘤并切碎。将肿瘤组织块悬浮于含有 10 mM Tris（pH 7.5）、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、1 mM PMSF、10 μg/ml 胃蛋白酶抑制剂、10 μg/ml 亮抑蛋白酶肽、10 μg/ml 抑蛋白酶、2 mM 钒酸钠和 100 mM 氟化钠的溶液中，并在冰上用匀浆器进行匀浆裂解。离心澄清后，使用 Bio-Rad DC 蛋白测定试剂盒测定裂解液中的蛋白浓度。将每组 60 μg 裂解液混合，进行 SDS-PAGE 电泳和磷酸酪氨酸特异性抗体的免疫印迹分析。同时，将混合提取物与 4 μg 抗 HER-2 抗体在 4°C 下孵育 1 小时进行免疫沉淀。免疫复合物收集于蛋白A琼脂糖上，洗涤后，使用磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹分析。分析单个肿瘤的提取物以确定动物间的差异。

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将肿瘤细胞或肿瘤碎片皮下植入雌性无胸腺（裸鼠）体内。对于雌激素依赖性细胞系（BT474、MCF-7、SK-OV-3），在肿瘤植入前一周，将雌二醇缓释片植入动物体内。除快速生长的3T3/neu肿瘤外，当肿瘤达到预定大小（90-200 mg）时开始治疗；对于快速生长的3T3/neu肿瘤，治疗在植入后第二天开始。
马来酸奈拉替尼（HKI-272）配制于含0.5%甲基纤维素和0.4%吐温80的水溶液中，根据研究需要，每日灌胃一次，持续10-20天。定期测量肿瘤大小并计算肿瘤质量。肿瘤生长抑制率是相对于载体对照组计算的。
为了评估异种移植瘤中HER-2的磷酸化水平，给携带BT474肿瘤的小鼠单次口服该化合物。在不同时间点切除肿瘤，匀浆，并通过免疫印迹分析裂解液中磷酸酪氨酸和HER-2的表达。[1]

裸鼠单次口服马来酸奈拉替尼（HKI-272，20 mg/kg）后，其终末半衰期约为4小时。[1]

妊娠期和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于奈拉替尼在哺乳期临床应用的信息。由于奈拉替尼及其代谢物与血浆蛋白的结合率超过99%，因此其在乳汁中的含量可能很低。生产商建议在奈拉替尼治疗期间停止母乳喂养。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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在已进行的异种移植研究中，马来酸奈拉替尼 (HKI-272)在测试剂量（最高达80 mg/kg/天）下耐受性良好。未观察到体重减轻或其他与药物相关的毒性。[1]

[1]. Antitumor activity of HKI-272, an orally active, irreversible inhibitor of the HER-2 tyrosine kinase. Cancer Res, 2004, 64(11), 3958-3965.

马来酸奈拉替尼是奈拉替尼的马来酸盐形式，奈拉替尼是一种口服的喹唑啉类不可逆受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，可抑制人表皮生长因子受体2（HER2；ERBB2）和人表皮生长因子受体（EGFR），具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，奈拉替尼靶向并共价结合HER2和EGFR的ATP结合口袋中的半胱氨酸残基。这抑制了它们的活性，导致下游信号转导事件的抑制，诱导细胞周期阻滞和凋亡，最终降低表达HER2和EGFR的肿瘤细胞的增殖。 EGFR 和 HER2 是 RTK，在多种肿瘤细胞类型中发生突变或过度激活，它们在肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成中发挥关键作用。
另见：奈拉替尼（含有活性成分）。

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药物适应症
奈拉替尼适用于早期激素受体阳性、HER2 过表达/扩增的乳腺癌成年患者的延长辅助治疗，这些患者既往接受过曲妥珠单抗辅助治疗，但距完成治疗不足一年。

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马来酸奈拉替尼 (HKI-272) 是一种口服有效的 HER-2 酪氨酸激酶不可逆抑制剂，其设计基于 EGFR 抑制剂 EKB-569 的化学骨架，但经过修饰以提高 HER-2 活性。它含有一个迈克尔受体基团，该基团与HER-2 ATP结合口袋中保守的半胱氨酸残基（Cys-805）共价结合，从而实现持续抑制。
其作用机制包括直接抑制HER-2和EGFR激酶活性，进而阻断下游MAPK和Akt信号通路，下调细胞周期调节因子（细胞周期蛋白D1、磷酸化Rb），诱导p27表达，使细胞周期停滞于G1-S期，最终导致细胞增殖减少和细胞凋亡。
该研究表明，马来酸奈拉替尼（HKI-272）有望成为治疗HER-2依赖性癌症（如乳腺癌和卵巢癌）的候选药物，并可能用于治疗HER-2和EGFR双过表达的肿瘤。[1]

C34H33CLN6O7

673.11

672.209

C, 60.67; H, 4.94; Cl, 5.27; N, 12.49; O, 16.64

915942-22-2

Neratinib;698387-09-6

67307512

White to off-white solid powder

187

4

12

13

48

1000

0

C(/C(=O)O)=C/C(=O)O.N(C1C=CC(OCC2N=CC=CC=2)=C(Cl)C=1)C1=C(C#N)C=NC2=CC(=C(C=C12)NC(=O)/C=C/CN(C)C)OCC

VXZCUHNJXSIJIM-MEBGWEOYSA-N

InChI=1S/C30H29ClN6O3.C4H4O4/c1-4-39-28-16-25-23(15-26(28)36-29(38)9-7-13-37(2)3)30(20(17-32)18-34-25)35-21-10-11-27(24(31)14-21)40-19-22-8-5-6-12-33-22;5-3(6)1-2-4(7)8/h5-12,14-16,18H,4,13,19H2,1-3H3,(H,34,35)(H,36,38);1-2H,(H,5,6)(H,7,8)/b9-7+;2-1-

(Z)-but-2-enedioic acid;(E)-N-[4-[3-chloro-4-(pyridin-2-ylmethoxy)anilino]-3-cyano-7-ethoxyquinolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide

HKI-272 maleate or PB272; HKI272; 915942-22-2; hki-272 maleate; Nerlynx; Neratinib maleate [MI]; UNII-9RM7XY23ZS; 9RM7XY23ZS; Neratinib (maleate); HKI 272; PB 272; PB-272 maleate

2934.99.9001

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