Acyl-coenzyme A: cholesterol O-acyltransferase 1 (ACAT1) [1].
EC₅₀: 9 nM (for human ACAT1) [1].
EC₅₀: 368 nM (for human ACAT2) [1].
Nevanimibe HCl targets acyl-coenzyme A: cholesterol O-acyltransferase 1 (ACAT1), an enzyme that catalyzes the esterification of cholesterol. It is a selective inhibitor with an EC50 of 9 nM for ACAT1 and weaker activity on ACAT2 (EC50 = 368 nM). By inhibiting ACAT1, the compound disrupts cholesterol esterification, which is particularly important in adrenal steroidogenesis.

在基于细胞的荧光测定胆固醇酯化反应中，与ACAT2（EC₅₀为368 nM）相比，奈凡尼米贝能高效且选择性地抑制人ACAT1，其EC₅₀为9 nM，表明其对ACAT1的选择性约为ACAT2的40倍[1]。
在H295R人肾上腺皮质癌细胞中，在存在外源性胆固醇（45 μg/mL）的情况下，用奈凡尼米贝（9 nM）处理5小时后，细胞内游离胆固醇水平升高约70%，胆固醇酯生成减少，这与ACAT1抑制作用一致。游离胆固醇与胆固醇酯的比例从1.4:1（单独胆固醇）变为5:1（ATR-101 + 胆固醇）。细胞内总胆固醇含量未发生变化[1]。
在H295R细胞中，在胆固醇（45 μg/mL）存在下，奈凡尼米贝（30 nM）可诱导细胞凋亡，表现为caspase-3/7活性增加（约3倍）以及5-16小时后TUNEL阳性细胞数量增加。在没有外源性胆固醇的情况下，浓度高达3 μM的奈凡尼米贝未显示毒性；仅在 30 μM 浓度下，24 小时后细胞活力才降低约 40% [1]。
与外源性胆固醇 (45-60 μg/mL) 共孵育可显著增强 H295R 细胞对奈凡尼米贝的敏感性，3 nM ATR-101 加 60 μg/mL 胆固醇可使细胞活力在 24 小时后降低约 60% [1]。
胆固醇转运抑制剂 U18666A (100 nM) 可阻止奈凡尼米贝 (30 nM) 诱导的 caspase-3/7 活化，表明胆固醇转运至内质网是细胞毒性所必需的 [1]。
奈凡尼米贝可诱导 H295R 细胞发生未折叠蛋白反应 (UPR)。经 5 小时处理（30 nM ATR-101 + 45 μg/mL 胆固醇）后，观察到以下现象：XBP-1 mRNA 剪接（XBP-1s）、PERK 磷酸化（Western blot 迁移率改变）以及 CHOP mRNA 表达增加（约 2.5 倍）[1]。
内质网钙释放抑制剂（Xestospongin C，10 μM；2-APB，100 μM）、线粒体钙摄取抑制剂（钌红，15 μM）和线粒体膜通透性抑制剂（环孢素 A，10 μM）均能阻断奈凡尼米贝诱导的 H295R 细胞中 caspase-3/7 的激活[1]。
奈凡尼米贝（30 nM + 胆固醇）降低了线粒体膜电位（TMRE 荧光强度降低约 0.5）。与对照组相比，ACAT1 表达降低 50%（ACAT1 表达降低 80%），这种效应可被环孢素 A 逆转 [1]。
在 HAC15 肾上腺皮质细胞中通过 shRNA 敲低 ACAT1（ACAT1 表达降低 80%）模拟了奈凡尼贝的作用：游离胆固醇增加（FC:CE 比值约为 4:1，而对照组为 1:1），24 小时和 72 小时后细胞活力降低，以及在存在外源性胆固醇（60 μg/mL）的情况下 caspase-3/7 活性增加（约 3-4 倍）。这些效应可被 U18666A、钌红和环孢素 A 阻断 [1]。

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当同时使用奈凡尼贝盐酸盐（PD-132301 盐酸盐；ATR101 盐酸盐；3 nM-30 μM）和胆固醇时，脾脏频率降低了 60%。毒性呈剂量依赖性增加，3 nM 的奈凡尼贝在 60 μg 剂量下即可产生毒性。²⁴ 在胆固醇存在的情况下，所有剂量的奈凡尼贝（3 nM–30 μM）均引起细胞毒性，而单独使用胆固醇处理则对细胞活力无影响。^[1] 奈凡尼贝盐酸盐可诱导细胞凋亡，具有治疗肾上腺皮质癌的潜力。体外实验表明，当奈凡尼贝盐酸盐（3 nM–30 μM）与胆固醇同时耗竭时，脾细胞频率降低了 60%。细胞毒性呈剂量依赖性增加，3 nM 的奈凡尼贝在 60 μg 剂量下即可产生毒性。在胆固醇存在的情况下，所有剂量（3 nM–30 μM）均引起细胞毒性，而单独使用胆固醇处理则对细胞活力无影响。在 H295R 和 HAC15 人类 ACC 细胞系中进行的细胞试验表明，3 nM-3 μM 无毒，而 30 μM 处理在 24 小时内使存活率降低了约 40%。

犬类研究（药效学和毒性）：三只雄性比格犬每日口服一次奈凡尼米贝，剂量为3 mg/kg/天，持续7天，随后剂量增至30 mg/kg/天，再持续7天。治疗14天后，肾上腺组织学检查显示皮质萎缩、空泡化、变性/坏死以及单核细胞浸润，主要累及束状带。每个代表性视野中约60%的皮质细胞TUNEL染色呈阳性，表明存在持续性细胞凋亡。肾上腺髓质未见异常[1]。
类固醇生成抑制：在相同的犬只中，与基线相比，ACTH刺激的皮质醇水平在3 mg/kg/天治疗7天后下降了62%，在30 mg/kg/天治疗14天后下降了71%。 ACTH刺激后皮质酮、17-羟孕酮、11-脱氧皮质醇和11-脱氧皮质酮的水平也显著降低。治疗14天后，ACTH刺激前肾上腺雄激素（雄烯二酮、DHEA-S）的水平显著降低[1]。
肾上腺胆固醇含量：与未治疗的犬（606 μg/mg蛋白）相比，治疗犬的肾上腺胆固醇酯含量显著降低（191 μg/mg蛋白），这与ACAT1抑制作用一致。游离胆固醇水平未发生变化（37 vs. 38 μg/mg蛋白）[1]。

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在体内，盐酸奈凡尼米贝已在肾上腺皮质癌的临床前模型中显示出疗效。作为一种口服有效的ACAT1抑制剂，它已在动物模型中评估了其降低肾上腺类固醇生成和抑制肿瘤生长的能力。该化合物的体内活性支持其在肾上腺皮质疾病方面的临床开发。

ACAT1/ACAT2荧光细胞检测：将表达人ACAT1或ACAT2的构建体转染至ACAT缺陷型中国仓鼠卵巢（AC29）细胞中。测定荧光胆固醇类似物（22-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-23,24-双去甲-5-胆烯-3-醇）的酯化反应。将细胞与递增浓度的奈凡尼米贝（Nevanimibe）孵育，测定酯化反应以计算EC₅₀值[1]。体外酶活性测定通常涉及测定微粒体制备物中的ACAT1活性。将酶与胆固醇和[¹⁴C]-油酰辅酶A在不同浓度的奈凡尼米贝盐酸盐（Nevanimibe HCl）存在下孵育。提取和薄层色谱分离后，通过闪烁计数测定[¹⁴C]-油酸胆固醇酯的生成量。 IC50 或 EC50 值由剂量反应曲线计算得出。

细胞毒性试验（MTT）：将 H295R 细胞接种于 96 孔板中，并在有或无水溶性胆固醇（胆固醇-甲基-β-环糊精复合物）的情况下用奈凡尼米贝处理 24 小时。加入 0.5 mg/mL 的 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）孵育 2 小时。用DMSO提取甲臜染料，并在570 nm处读取吸光度[1]。
结晶紫染色：细胞处理方法相同，用4%多聚甲醛固定，用0.4%结晶紫（溶于10%乙醇）染色，用1% SDS溶解后，在570 nm处测量吸光度[1]。
Caspase-3/7活性检测：细胞处理5小时后，使用基于发光法的试剂盒检测caspase-3/7活性。加入caspase检测试剂，并用发光仪测量发光值[1]。
TUNEL染色：将腔室载玻片上的细胞处理16小时后，使用荧光TUNEL系统进行TUNEL染色。细胞用DAPI复染，并采集图像[1]。
线粒体膜电位测定：细胞处理5小时后，加入2 μM的TMRE（四甲基罗丹明）孵育15分钟。使用酶标仪测定活细胞TMRE荧光强度[1]。
游离胆固醇和酯化胆固醇测定：细胞处理5小时后，用己烷/异丙醇（3:2）提取脂质，并使用荧光法测定游离胆固醇和总胆固醇。酯化胆固醇通过总胆固醇减去游离胆固醇计算得出[1]。
定量RT-PCR：提取RNA，进行逆转录，并使用SYBR Green PCR定量CHOP mRNA表达，以GAPDH为内参进行标准化。采用覆盖剪接位点的引物进行PCR检测XBP-1剪接[1]。
蛋白质印迹：采用抗PERK抗体进行免疫印迹检测PERK磷酸化。活化的PERK通过迁移率上移进行鉴定[1]。
ACAT1敲低：用靶向SOAT1（人ACAT1）的慢病毒shRNA转导HAC15细胞。用嘌呤霉素筛选稳定敲低细胞，并通过qPCR验证ACAT1表达（降低80%）[1]。

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细胞毒性试验[1]
细胞类型：H295R 和 HAC 克隆 15 (HAC15) 人肾上腺皮质癌细胞系
测试浓度：3 nM-30 μM
孵育时间：24 小时
实验结果：3 nM-3 μM 无毒性，而 30 μM 处理在 24 小时内使细胞存活率降低约 40%。

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细胞试验采用人肾上腺皮质癌细胞系，例如 H295R 和 HAC15。细胞用浓度范围为 3 nM 至 30 μM 的盐酸奈凡尼米贝处理 24 小时。使用 MTT 或 CellTiter-Glo 法评估细胞活力。还可以测量胆固醇酯化和类固醇激素生成（例如皮质醇）以确认 ACAT1 抑制。

犬类毒理学和药效学研究：三只雄性比格犬（体重约 10-12 公斤）每日口服一次奈凡尼米贝，剂量为 3 毫克/公斤/天，持续 7 天，随后剂量增加至 30 毫克/公斤/天，再持续 7 天。该化合物配制于 0.5% 羟丙基甲基纤维素中，给药体积为 5 毫升/公斤。在第-3、1、3、7、8、10和14天，分别于ACTH刺激（5 μg/kg，静脉注射）前和刺激后1小时采集血样，用于血清皮质醇和类固醇分析。第14天，处死动物，并采集肾上腺组织进行组织学检查（H&E染色和TUNEL染色）以及游离胆固醇和酯化胆固醇分析[1]。
犬组织分布研究：三只雌性比格犬（约19月龄，7-10 kg）每日口服一次奈凡尼米贝，剂量为3 mg/kg/天，连续7天，溶于0.5%羟丙甲纤维素溶液（5 mL/kg）。最后一天，于给药后4小时采集血样，随后处死动物。收集组织样本（肾上腺、肾脏、肝脏、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和脑脊液）用于通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定ATR-101含量[1]。体内研究在小鼠肾上腺皮质癌异种移植模型或肾上腺增生动物模型中进行。口服不同剂量的盐酸奈凡尼米贝。定期测量肿瘤体积，并检测血清类固醇激素水平（皮质醇、醛固酮）以评估药效学效应。评估肾上腺组织形态和脂质含量的变化。

犬组织分布：以3 mg/kg/天的剂量口服给药7天后，奈凡尼米贝优先分布于肾上腺。当浓度校正为血浆浓度时，仅肾上腺的浓度接近血浆浓度。其他组织的浓度均未超过血浆浓度的30%。脑脊液（CSF）中未检测到ATR-101[1]。
血浆浓度：据报道，以3 mg/kg/天和30 mg/kg/天的剂量给药后，奈凡尼米贝的血浆浓度与先前毒理学研究中观察到的浓度相近（数据见补充图1）[1]。

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盐酸奈凡尼米贝（分子量458.08，分子式C₂₇H₄₀ClN₃O）是一种小分子化合物。它是一种口服有效的抑制剂，LogP值为7.7。该化合物通常以固体粉末的形式在室温下储存。其理化性质有利于口服生物利用度。

犬肾上腺特异性毒性：口服奈凡尼米贝治疗14天后（前7天3 mg/kg/天，后7天30 mg/kg/天），组织学检查显示肾上腺皮质萎缩、空泡化、变性/坏死以及单核细胞浸润，主要位于束状带。约60%的皮质细胞TUNEL染色呈阳性。未观察到肾上腺髓质异常[1]。
对其他组织无影响：一项针对雄性犬的独立28天毒性研究表明，对睾丸或巨噬细胞无影响（数据未显示）[1]。
类固醇生成受损：奈凡尼米贝治疗导致ACTH刺激前后糖皮质激素、盐皮质激素和肾上腺雄激素水平逐渐降低，这与肾上腺功能下降和细胞死亡相一致[1]。
体外毒性：在H295R细胞中，在没有外源性胆固醇的情况下，奈凡尼米贝浓度高达3 μM时无毒性；仅在30 μM时，24小时后细胞活力才降低约40%[1]。

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临床前毒性研究已在动物模型中评估了奈凡尼米贝盐酸盐。作为一种ACAT1抑制剂，其毒性特征与胆固醇代谢紊乱和肾上腺功能障碍有关。该化合物已进入二期临床试验，表明其安全性可控。

[1]. ATR-101, a Selective and Potent Inhibitor of Acyl-CoA Acyltransferase 1, Induces Apoptosis in H295R Adrenocortical Cells and in the Adrenal Cortex of Dogs. Endocrinology. 2016 May;157(5):1775-88.

奈凡尼米贝（Nevanimibe，又名PD 132301-2）是一种选择性强效的酰基辅酶A：胆固醇O-酰基转移酶1 (ACAT1) 抑制剂。ACAT1是一种位于内质网的酶，催化游离胆固醇的酯化反应[1]。
该化合物最初是作为高胆固醇血症的潜在治疗药物开发的，但由于在动物模型中观察到肾上腺特异性毒性而被放弃。这种肾上腺特异性毒性促使其被重新用于治疗肾上腺皮质癌 (ACC)[1]。
其作用机制涉及抑制ACAT1，从而导致游离胆固醇在内质网中积累。这会触发内质网应激（未折叠蛋白反应）、内质网钙库释放、线粒体钙摄取、线粒体膜电位丧失，最终导致细胞凋亡[1]。
奈凡尼米贝目前正处于治疗肾上腺皮质癌的I期临床开发阶段[1]。
该化合物具有高度亲脂性，这可能有助于其选择性分布至肾上腺皮质，其机制可能是通过脂蛋白摄取或向心性肾上腺血流[1]。

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奈凡尼米贝盐酸盐（ATR-101）是一种选择性ACAT1抑制剂，已在肾上腺皮质癌、先天性肾上腺皮质增生症和库欣综合征的临床试验中进行研究。其作用机制是抑制ACAT1，从而破坏胆固醇酯化，减少肾上腺类固醇生成的胆固醇酯的可用性。该化合物已证明能够诱导肾上腺皮质癌细胞凋亡，并代表了一种治疗肾上腺疾病的潜在靶向疗法。

C27H40CLN3O

458.079006195068

457.286

C, 70.79; H, 8.80; Cl, 7.74; N, 9.17; O, 3.49

133825-81-7

Nevanimibe;133825-80-6

131678

White to off-white solid powder

528.1ºC at 760 mmHg

273.2ºC

3.05E-11mmHg at 25°C

7.712

47.86

3

2

7

32

543

0

Cl.O=C(NC1C(=CC=CC=1C(C)C)C(C)C)NCC1(C2C=CC(=CC=2)N(C)C)CCCC1

SDOOGTHIDFZUNM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H39N3O.ClH/c1-19(2)23-10-9-11-24(20(3)4)25(23)29-26(31)28-18-27(16-7-8-17-27)21-12-14-22(15-13-21)30(5)6;/h9-15,19-20H,7-8,16-18H2,1-6H3,(H2,28,29,31);1H

1-[[1-[4-(dimethylamino)phenyl]cyclopentyl]methyl]-3-[2,6-di(propan-2-yl)phenyl]urea;hydrochloride

PD-132301 hydrochloride; N-(2,6-bis(1-methylethyl)phenyl)-N'-((1-(4-(dimethylamino)phenyl)cyclopentyl)methyl)urea hydrochloride; RefChem:165610; Nevanimibe hydrochloride; 133825-81-7; ATR-101 HCl; PD132301 hydrochloride; PD 132301 hydrochloride; ATR-101 hydrochloride;ATR 101 hydrochloride;ATR101 hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~41.67 mg/mL (~90.97 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。