NMS-873

p97 ( IC50 = 30 nM ）

体外活性：NMS-873 降低 p97 对胰蛋白酶消化的敏感性，防止连接子 D2 结构域的降解。 NMS-873 作为 p97 抑制剂，在多种血液学和实体瘤系中产生抗增殖活性。机制研究表明，NMS-873 激活未折叠蛋白反应，干扰自噬，从而诱导癌细胞死亡。激酶测定：使用改进的NADH偶联测定，通过监测反应中ADP的形成来评估重组野生型VCP及其突变体的ATP酶活性和动力学参数。由于 ADP 和 NADH 是 VCP ATP 酶活性的 ATP 竞争性抑制剂，因此 NADH 偶联测定的标准方案被修改为两步程序。在第一部分中，ATP 再生系统（40 U/ml 丙酮酸激酶和 3 mM 磷酸烯醇丙酮酸）回收 VCP 活性产生的 ADP，保持底物浓度恒定（从而防止产物抑制）并积累化学计量的丙酮酸。在第二部分中，VCP 酶促反应用 30 mM EDTA 和 250 μM NADH 猝灭，并用 40 U/ml 乳酸脱氢酶进行化学计量氧化，以减少累积的丙酮酸。使用 Tecan Safire 2 读板在 340 nm 处测量 NADH 浓度的降低。该测定在 96 孔或 384 孔 UV 板中的反应缓冲液中进行，反应缓冲液含有 50 mM Hepes、pH 7.5、0.2 mg/ml BSA、10 mM MgCl2 和 2 mM DTT。实验数据符合合作方程，获得约 60 μM 的 Ks* 和 2.0 ± 0.1 的 Hill 系数 (n)。 HTS 活动是使用 1,536 孔格式的小型化测定针对 100 万化合物库进行的以及更灵敏的 ADP 检测系统 Transcreener ADP FP。 10 nM VCP 和 10 μM 抑制剂预孵育 20 分钟，然后向反应中添加 10 μM ATP，反应进行 90 分钟，然后淬灭。筛选的平均Z'为0.58，以3×sd（38％抑制）为截止值的命中率为1.7％。使用物理化学和结构过滤器修剪在 10 μM 浓度下抑制率 >60% 的初级命中，留下 7,516 种化合物。最后，对 3,988 个主要命中进行重复确认，并选择 500 种化合物使用先前描述的 NADH 改良偶联测定进行剂量反应评估。最有趣的 HTS 命中的效力是针对两种野生型进行测量的VCP 和 C522T 突变体。测定中使用的 ATP 浓度可产生每种酶的半最大速度 (Ks*)，分别对应于野生型和 C522T 突变体的 60 μM 和 130 μM。为了探索可逆抑制剂对底物浓度的依赖性，还在饱和 ATP 浓度 (1 mM) 下评估了它们的效力，并与标准 ATP 竞争性抑制剂 (AMP-PNP) 的效力进行了比较。细胞测定：将细胞按每孔 1,600 个细胞接种在 384 孔白色透明底板中。接种后 24 小时，用化合物处理细胞（每种化合物有 8 个稀释点，一式两份），并在 37°C、5% CO2 气氛下再孵育 72 小时。然后裂解细胞，并使用基于热稳定性萤火虫荧光素酶的测定法测定每孔中的 ATP 含量，作为细胞活力的测量。 IC50 值使用处理细胞相对于未处理对照的生长百分比来计算。

此外，NMS-873 在血液肿瘤以及多种实体瘤中显示出细胞杀伤活性，IC50 范围在 0.08μM 至 2μM 之间

改良的 NADH 偶联测定用于监测反应中 ADP 的形成，以评估重组野生型 VCP 及其突变体的 ATP 酶活性和动力学参数。鉴于 ADP 和 NADH 都是 VCP ATP 酶活性的 ATP 竞争性抑制剂，NADH 偶联测定的标准方案已更改为分两步进行。在初始阶段，由 3 mM 磷酸烯醇丙酮酸和 40 U/ml 丙酮酸激酶组成的 ATP 再生系统回收 VCP 活性产生的 ADP，维持恒定的底物浓度以避免产物抑制，并积累化学计量的丙酮酸。第二部分涉及用 30 mM EDTA 和 250 μM NADH 猝灭 VCP 酶促反应，然后用 40 U/ml 乳酸脱氢酶进行化学计量氧化，从而降低丙酮酸积累。 Tecan Safire 2 读数板用于测量 340 nm 处 NADH 浓度的下降。该测定在 96 或 384 孔 UV 板中的反应缓冲液中进行，反应缓冲液含有 2 mM DTT、10 mM MgCl₂、pH 7.5、0.2 mg/mL BSA 和 50 mM Hepes。使用合作方程来拟合实验数据，得到大约 60 μM 的 Ks* 和 2.0 ± 0.1 的 Hill 系数 (n)。称为 Transcreener ADP FP 的更灵敏的 ADP 检测系统与 1,536 孔格式的小型化测定结合使用，对包含 100 万种化合物的库进行 HTS 活动。将 10 μM 抑制剂和 10 nM VCP 预孵育 20 分钟后，向反应中添加 10 μM ATP，然后允许反应进行 90 分钟，然后淬灭。以3×sd（38%抑制）为截止值，筛选平均值Z'为0.58，命中率为1.7%。使用物理化学和结构过滤器去除在 10 μM 浓度下表现出超过 60% 抑制率的初级命中，留下 7,516 种化合物。最后，在对 3,988 个主要命中进行重复确认后，选择 500 种化合物进行剂量反应分析，利用前面提到的 NADH 改良偶联测定。 C522T 突变体和野生型 VCP 用于衡量最有趣的 HTS 命中的效力。在该测定中，使用了为每种酶产生半最大速度 (Ks*) 的 ATP 浓度（野生型分别为 60 μM，C522T 突变体分别为 130 μM）。为了研究可逆抑制剂对底物浓度的依赖性，在 1 mM ATP 饱和浓度下评估其效力，并与传统 ATP 竞争性抑制剂 (AMP-PNP) 的效力并列。

在 384 孔白色透明底板中，每孔接种 1,600 个细胞。接种后 24 小时将化合物添加到细胞中（每种化合物有 8 个稀释点，一式两份），然后在 37°C、5% CO2 的空气中再孵育 72 小时。之后，裂解细胞，并使用 Promega 的基于热稳定性萤火虫荧光素酶的检测来测量每个孔中存在的 ATP 量，作为细胞活力的代表。处理后的细胞与未处理的对照相比的生长百分比用于计算IC50值。

[1]. Covalent and allosteric inhibitors of the ATPATP ase VCP/p97 induce cancer cell death. Nat Chem Biol. 2013 Jul 28. doi: 10.1038/nchembio.1313.

C27H28N4O3S2

520.67

520.16

C, 62.28; H, 5.42; N, 10.76; O, 9.22; S, 12.32

1418013-75-8

White solid powder

CC1=C(C=CC(=C1)OCC2=NN=C(N2C3=CN=CC=C3)SC4CCCC4)C5=CC=C(C=C5)S(=O)(=O)C

UJGTUKMAJVCBIS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H28N4O3S2/c1-19-16-22(11-14-25(19)20-9-12-24(13-10-20)36(2,32)33)34-18-26-29-30-27(35-23-7-3-4-8-23)31(26)21-6-5-15-28-17-21/h5-6,9-17,23H,3-4,7-8,18H2,1-2H3

3-[3-cyclopentylsulfanyl-5-[[3-methyl-4-(4-methylsulfonylphenyl)phenoxy]methyl]-1,2,4-triazol-4-yl]pyridine

NMS-873; NMS873; NMS 873

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 20.5~100 mg/mL (9.4 ~192.1 mM）