NSC 319726   中文名称: 1-吖丁啶硫代羧酸[1-(2-吡啶基)亚乙基]酰肼

R175 (p53 = 8 nM)
Mutant p53 protein (specifically p53R175 conformational mutant); zinc ion; cellular redox state. No IC50/Ki/EC50 values for target binding are reported. [1]

NSC319726 是一种 p53(R175) 突变体激活剂，可抑制表达突变型 p53 的细胞生长，对 p53(R175) 突变体的 IC50 为 8 nM，对 p53 野生型细胞无抑制作用，且对其他热点 p53 突变体的选择性高 10 至 100 倍。NSC319726 可诱导 p53(R175) 依赖性细胞凋亡。p53(R175) 突变蛋白经 NSC319726 处理后，其构象变化与野生型相似，从而恢复序列特异性 p53 转录。NSC319726 螯合锌离子和发生氧化还原变化的能力是其发挥活性的必要条件。 [1]

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与野生型对照组相比，NSC319726 在表达突变型 p53 的细胞中表现出显著降低的 IC50 值，尤其对于 p53R175 等位基因而言，其生长抑制作用更为显著。在小鼠成纤维细胞 (10)3/175 细胞（p53R175 突变体）中，IC50 值为 8 nM，而未达到野生型 Balb/c 3T3 成纤维细胞的 IC50 值。[1]

在 WI38 人成纤维细胞（p53 野生型）中，未获得 NSC319726 的 IC50 值。 [1]

在来自 p53+/+、p53−/− 和 p53R172H/R172H 小鼠的同源小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 中，NSC319726 对 p53R172H/R172H 细胞系的敏感性远高于 p53+/+ 和 p53−/− 对照组。[1]

在具有热点 p53 突变的人类肿瘤细胞系中，携带 p53R175 突变的细胞的 IC50 值比携带 p53R248 或 p53R273 突变的细胞低约 10 倍，在某些情况下甚至低 100 倍。[1]

通过 Annexin-V 染色检测，NSC319726 可诱导细胞凋亡，其中 p53R175 突变细胞的凋亡率最高 (10)3/175。在卵巢癌细胞系中，用 1 μM NSC319726 处理 24 小时后，TOV112D (p53R175H) 细胞的凋亡率比 OVCAR3 (p53R248W) 或 SKOV3 (p53-/-) 细胞高出 2 倍以上。[1]

在 TOV112D 细胞中，siRNA 敲低 p53R175 突变蛋白显著降低了其对 NSC319726 介导的生长抑制的敏感性，表明这种抑制作用部分依赖于突变蛋白。[1]

使用构象特异性抗体的免疫荧光分析显示，NSC319726 诱导了类似野生型的构象变化：PAB240（突变特异性抗体）的荧光强度降低了 5 倍，而 PAB1620（野生型特异性抗体）的荧光强度增加了 2 倍。 PAB240免疫沉淀实验显示，NSC319726处理后突变型p53免疫反应性降低超过85%。[1]

蛋白质印迹分析表明，NSC319726可诱导TOV112D (p53R175H)细胞中p21蛋白的表达，但不能诱导SKOV3 (p53-/-)细胞中p21蛋白的表达。依托泊苷不能诱导TOV112D细胞中p21蛋白的表达。NSC319726导致突变型p53R175蛋白水平降低，6小时时最低，24小时后恢复至处理前水平；在p53R248或p53R273突变细胞系中未观察到这种不稳定性。Nutlin-3 (5 μM)可消除NSC319726诱导的p53R175稳定性降低。 [1]染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验表明，NSC319726 可恢复 TOV112D 细胞中 p53R175 突变体与 p21、PUMA 和 MDM2 启动子的位点特异性 DNA 结合。[1]qRT-PCR 显示，NSC319726 可提高 TOV112D 细胞中 p21、PUMA 和 MDM2 的 mRNA 水平，尤其是凋亡基因 PUMA。[1]使用 p21 启动子 p53 反应元件的荧光素酶报告基因检测显示，在 TOV112D 细胞中，NSC319726 处理后荧光素酶活性增加了 2.5 倍，但在表达 p53R248 或 p53R273 等位基因的 MEF 细胞中未观察到此现象。 [1]基因表达微阵列证实，NSC319726 在 TOV112D 细胞中产生了与未处理对照组不同的 p53 靶基因表达特征。[1]添加浓度高于 15 μM 的 FeSO4 可完全抑制 NSC319726 的活性；浓度低于 15 μM 时，其活性呈剂量依赖性抑制。[1]添加 5–15 μM 的 ZnCl2 可使 TOV112D 细胞中 NSC319726 的活性增强 2 倍。浓度高于 100 μM 的 ZnCl2 单独使用具有毒性，且与 p53 状态无关。 [1]

NSC319726 处理 (1 μM) 显著降低了 1 小时 (p=0.0057)、3 小时 (p=0.0027) 和 24 小时 (p=0.001) 时还原型谷胱甘肽 (GSH) 与氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 的比值。[1]

还原剂 N-乙酰半胱氨酸 (5 mM) 抑制了 NSC319726 的促凋亡活性，而氧化剂二酰胺 (100 μM) 则增强了其促凋亡活性。[1]

NSC319726（5mg/kg，7天）对p53(R172H/R172H)小鼠表现出更大的毒性，存活率仅为30%，而p53+/+和p53-/-小鼠的存活率为100%。 NSC319726抑制TOV112D-p53(R175H)异种移植瘤的生长，但对H460 (p53+/+)和MDAMB468-p53(R273W)异种移植瘤无抑制作用。[1]

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在毒性试验中，每日腹腔注射（ip）10 mg/kg/天的NSC319726治疗的p53R172H/R172H小鼠全部在第3天死亡（7/7），而9只p53+/+小鼠中仅有1只在第3天死亡。到第4天，p53+/+小鼠的存活率为70%，而p53+/-小鼠的存活率为30%。在较低剂量（5 mg/kg/天，腹腔注射）下，到第 7 天，p53+/+ 和 p53-/- 小鼠的存活率达到 100%，而 p53R172H/R172H 小鼠的存活率仅为 30%。[1]

经过两天的系列化合物稀释处理后，将5000个TOV112D细胞（5000个细胞/孔，100毫升培养液）接种于96孔板中，培养至汇合度达到50%至60%。孵育3天后，使用MTS试剂和Victor平板读数仪评估细胞生长情况。

进行细胞活力检测。将细胞以每孔 5×10⁴ 个细胞的密度接种于 12 孔板中，每孔加入 1 ml 培养液。第二天用化合物进行系列稀释处理，直至细胞汇合度达到 50% 至 60%。孵育三天后，使用 Guava ViaCount 试剂和 Guava PCA 仪器测量细胞生长情况。

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细胞生长抑制率通过 MTS 法测定：将 5000 个细胞接种于 96 孔板中，培养至细胞汇合度达到 50% 至 60%，然后用 NSC319726 进行系列稀释（0.00001 至 10 μM）处理 3 天，最后使用 MTS 试剂和酶标仪测量细胞生长情况。 [1]

细胞活力也使用 Guava ViaCount 检测法进行评估：将 5×10^4 个细胞/孔接种于 12 孔板中，培养至 50-60% 汇合度，用化合物进行系列稀释处理 3 天，然后使用 ViaCount 试剂和 Guava PCA 仪器进行检测。[1]

细胞凋亡通过 Annexin-V 染色法使用 Guava Nexin 试剂进行检测：将 12 孔板中的细胞用 NSC319726 处理 24 小时，用 Nexin 试剂染色，并使用 Guava PCA 仪器检测 Annexin 阳性细胞。[1]

使用 Lipofectamine 2000 和 SMARTpool p53 siRNA 进行 siRNA 转染。 [1]

免疫荧光：将生长在盖玻片上的细胞用 4% 多聚甲醛固定，用 0.5% Triton X-100 透化，用 PAB1620（1:50，识别野生型构象）或 PAB240（1:200，识别突变型构象）染色过夜，随后用二抗（山羊抗小鼠 IgG）孵育 40 分钟。使用 Adobe Photoshop 软件定量荧光强度。[1]

免疫沉淀：将细胞裂解液（500 μg）与 PAB240（4 μg）在蛋白基质中进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹法用 p53 抗体（FL393）检测沉淀物。使用 Adobe Photoshop 软件确定图像密度。 [1]

蛋白质印迹：将裂解物或免疫沉淀产物进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，并使用ECL法检测。所用抗体：p21、GAPDH、p53 (DO-1)、肌动蛋白。密度值以与内参的比值表示。[1]

染色质免疫沉淀 (ChIP)：使用商业试剂盒进行。回收的ChIP DNA使用针对p21、PUMA和MDM2基因中p53反应元件侧翼的引物进行PCR扩增。使用GAPDH作为对照引物。[1]

实时荧光定量PCR (qRT-PCR)：使用试剂盒提取RNA，通过TaqMan探针检测基因表达，以β-肌动蛋白进行标准化，结果以重复两次或三次实验的平均值±标准差表示。 [1]

荧光素酶报告基因检测：将含有 p21 启动子 p53 反应元件的 pGL3 载体转染细胞，用 NSC319726 处理，裂解细胞，并根据制造商说明测量荧光素酶活性。[1]

微阵列检测：提取经 NSC319726 处理或未经 NSC319726 处理的细胞的 RNA，并与 GeneChip 人类基因组 U133 Plus 2.0 芯片进行杂交。[1]

谷胱甘肽测定：使用谷胱甘肽检测试剂盒，按照制造商说明测量还原型谷胱甘肽 (GSH) 和氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 的水平。[1]

5-10 mg/kg/天，最多7天 DMSO
p53+/+、p53-/- 和 p53R172H 敲入小鼠

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基因型为 p53R172H/R172H、p53R172H/+、p53-/- 和 p53+/+ 的小鼠（6-10 周龄）每天腹腔注射 (ip) NSC319726（10 mg/kg 或 5 mg/kg）或溶剂对照（二甲基亚砜），最多持续 7 天，之后收集组织。[1]

在 p53R172H/R172H 小鼠中，每日腹腔注射 10 mg/kg NSC319726 导致所有 7 只小鼠在第 3 天全部死亡；5 mg/kg 剂量下，第 7 天仅有 30% 的小鼠存活。相比之下，p53+/+ 小鼠在 10 mg/kg 剂量下第 4 天存活率为 70%，在 5 mg/kg 剂量下第 7 天存活率为 100%。[1] 抑制 p53R175 突变异种移植瘤生长的 NSC319726 剂量（1 mg/kg 静脉注射）对小鼠完全无毒。0.1 mg/kg 剂量下，仅观察到肿瘤生长抑制的微小差异，表明存在治疗窗口。 [1]

该化合物对WI38人成纤维细胞（p53野生型）的毒性极低，未测得IC50值；且在对p53R175突变细胞有效的浓度下，该化合物对Balb/c 3T3成纤维细胞也无毒性。[1]

[1]. Cancer Cell . 2012 May 15;21(5):614-625.

NSC319726 是通过对 NCI60 抗癌药物进行计算机模拟筛选而发现的。该筛选方法基于突变型 p53 细胞系（尤其是热点密码子 175、248 和 273）中良好反应者的富集以及野生型 p53 细胞系中的耗竭情况对化合物进行排序。另外两种硫代氨基脲类化合物（NSC319725 和 NSC328784）也获得了较高的评分。[1]

其作用机制涉及锌离子螯合和氧化还原变化。p53R175 突变体无法与锌配位，该化合物可能作为锌金属伴侣促进蛋白质的重折叠。氧化还原变化（GSH/GSSG 比值降低）和氧化应激促进了细胞凋亡机制。 [1]

p53R175突变体是第三大常见的p53错义突变体，约占所有错义突变的5.5%。根据国际癌症研究机构（IARC）TP53数据库，美国每年携带TP53R175等位基因的癌症患者估计超过32,000例。[1]

该化合物不像依托泊苷那样能诱导野生型p53蛋白水平或转录活性，其活性也不是由核糖核苷酸还原酶抑制所致，因为在相同剂量下，具有野生型p53的非肿瘤细胞几乎没有或完全没有生长抑制。[1]

C11H14N4S

234.32

234.093

C, 56.38; H, 6.02; N, 23.91; S, 13.68

71555-25-4

5351307

Off-white to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

367.7±34.0 °C at 760 mmHg

176.2±25.7 °C

0.0±0.8 mmHg at 25°C

1.659

0.17

72.61

1

3

2

16

286

0

S=C(N([H])/N=C(\C([H])([H])[H])/C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

XDHBUMNIQRLHGO-UKTHLTGXSA-N

InChI=1S/C11H14N4S/c1-9(10-5-2-3-6-12-10)13-14-11(16)15-7-4-8-15/h2-3,5-6H,4,7-8H2,1H3,(H,14,16)/b13-9+

N-[(E)-1-pyridin-2-ylethylideneamino]azetidine-1-carbothioamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀； 然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀； 加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。