shp2 (IC50 = 0.318 μM); shp1 (IC50 = 0.355 μM)

体外活性：NSC-87877 是一种新型、有效、细胞渗透性的 SHP-1 和 SHP-2 PTP（蛋白酪氨酸磷酸酶）小分子抑制剂，IC50 分别为 55 和 318 nM。蛋白质磷酸化在控制细胞活动的许多调节机制中发挥着关键作用，因此涉及多种疾病。磷酸化的细胞平衡通过蛋白激酶和磷酸酶的作用来调节。因此，这些调节蛋白已成为药物开发的有希望的靶标。 NSC-87877 以剂量依赖性方式降低双特异性蛋白磷酸酶 26 (DUSP26) 的磷酸酶活性。 NSC-87877 和 DUSP26 的动力学研究揭示了竞争性抑制。 NSC-87877 有效抑制 DUSP26 介导的 p38 去磷酸化，p38 是丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 家族的成员。由于 DUSP26 与未分化甲状腺癌 (ATC) 细胞的存活有关，因此 NSC-87877 可能成为治疗 ATC 的治疗试剂。激酶测定：将六组氨酸标记的 DUSP26 (1 μg) 与各种 NSC-87877 浓度（0、10 或 50 μM）在 PTP 测定缓冲液中在 37 °C 下预混合 15 分钟，然后在活性磷酸化 p38 (10 ng) 在 37 °C 下持续 15 分钟。通过将预孵育的样品与补充有 20 μM ATP/10 μCi 的激酶反应缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM MgCl2、0.1 mM 原钒酸钠和 1 mM DTT）混合来启动激酶测定反应。 γ-32P]ATP 和 1 μg GST 激活转录因子 2 (ATF2) 作为底物。 30°C 30 分钟后，通过添加 SDS-PAGE 样品缓冲液终止反应，并通过 SDS-PAGE 分离激酶反应产物进行放射自显影。为了确认 DUSP26 不会使 ATF2 去磷酸化，通过与 p38 一起孵育对 ATF2 进行 32P 标记。孵育后，将样品与或不与 DUSP26 一起在 30 °C 下进一步孵育 30 分钟，然后通过 SDS-PAGE 进行解析。将凝胶干燥并暴露于X射线胶片。免疫复合物激酶测定。对于免疫复合物激酶测定，将 HEK 293 细胞与 HA-p38 和 FLAG-DUSP26 表达质粒共转染。转染 48 小时后，用 NSC-87877（0-100 μM，3 小时）预处理细胞，然后用 H2O2 刺激（1 mM，30 分钟）。通过离心澄清细胞提取物，并用抗HA琼脂糖珠对上清液进行免疫沉淀。将珠子用 PTP 裂解缓冲液洗涤一次，用含有 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、2 mM DTT 和 1 mM PMSF 的溶液洗涤两次，然后用含有20 mM Tris–HCl (pH 7.5) 和 20 mM MgCl2。然后将珠子重悬于含有 20 μM ATP 和 0.3 μCi [γ-32P]ATP 以及 1 μg GST-ATF2 的激酶反应缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM MgCl2 和 1 mM DTT）中在 30°C 下保持 30 分钟。通过 SDS-PAGE 分离激酶反应的产物。将凝胶干燥并曝光于胶片上。体外磷酸酶测定和动力学分析。根据前述方法，在 96 孔微量滴定板测定中，使用底物 3-O-甲基荧光素磷酸盐（OMFP；Sigma，圣路易斯，密苏里州）测量磷酸酶的活性，其浓度随每种酶的 Km 的变化而变化。 NSC-87877（Calbiochem，圣地亚哥，加利福尼亚州）和 OMFP 分别溶解在 H2O 和 DMSO 中。所有反应均在终浓度 1% DMSO 下进行。最终的孵育混合物（150 μl）针对酶活性进行了优化，由 30 mM Tris-HCl (pH 7)、75 mM NaCl、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、0.1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)、0.33% 牛血清白蛋白组成(BSA) 和 100 nM PTP。通过添加 OMFP 启动反应，37°C 下孵育时间为 30 分钟。使用多孔板读数器（GENios Pro；激发滤光片，485 nm；发射滤光片，535 nm）测量产物的荧光发射。该反应在实验期间呈线性，并且与酶和底物浓度成正比。半最大抑制常数 (IC50) 定义为导致 PTP 活性降低 50% 的抑制剂浓度。使用曲线拟合程序 Prism 3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) 确定 Lineweaver-Burk 图的半最大抑制常数和最佳曲线拟合。所有实验一式三份进行并且重复至少三次。使用活性磷酸化 MAPK 进行去磷酸化测定。将六组氨酸标签的 DUSP26 (1 µg) 与活性磷酸化 p38 (10 ng)、ERK (10 ng) 或 JNK (50 ng) 在 PTP 测定缓冲液 (30 mM Tris-HCl (pH 7), 75 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 mM DTT 和 0.33% BSA），并在 37°C 下孵育 30 分钟。为了确定 NSC-87877 是否在体外下调 DUSP26 对 p38 的作用，将 1 μg DUSP26 与 10 ng 活性磷酸化 p38 和各种 NSC-87877 浓度（0、10 或 100 μM）在 30 μl 反应体积中混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。使用磷酸-MAPK 抗体对样品进行蛋白质印迹分析以检查 MAPK 的磷酸化状态。细胞测定：收获细胞，然后在 50 mM Tris-HCl (pH 8)、300 mM NaCl、1% NP-40 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) 中超声裂解。裂解液在 4°C、4000 rpm 下澄清 30 分钟。通过重力流将上清液施加到 Ni-NTA 树脂柱（PEPTRON，Daejon，韩国）。用 20 mM Tris–HCl (pH 8)、500 mM NaCl、50 mM 咪唑洗涤树脂，并用 20 mM Tris–HCl (pH 8)、500 mM NaCl、200–300 mM 咪唑洗脱。将洗脱的蛋白质用 20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、30% 甘油、0.5 mM PMSF 透析过夜，然后储存于 -80 °C。

在 NB 肾内小鼠模型中，NSC-87877 治疗可减少肿瘤生长并增加 p53 和 p38 活性。 NSC-87877 抑制 DUSP26 是一种通过激活 p53 和 p38 丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 肿瘤抑制途径在体外和体内诱导 NB 细胞细胞毒性的有效策略。

在与活性磷酸化 p38 (10 ng) 在 37 °C 下进一步孵育 15 分钟之前，将六组氨酸标记的 DUSP26 (1 μg) 与各种 NSC-87877 浓度（0、10 或 50 μM）预混合）在 PTP 测定缓冲液中。从预孵育样品开始，添加激酶反应缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM MgCl2、0.1 mM 原钒酸钠和 1 mM DTT）以及 20 μM ATP/10 μCi [γ- 32P]ATP 和 1 μg GST 激活转录因子 2 (ATF2) 作为底物，启动激酶测定反应。通过 SDS-PAGE 分离激酶反应产物进行放射自显影，并在 30°C 下 30 分钟后通过添加 SDS-PAGE 样品缓冲液终止反应。为了验证DUSP26不会使ATF2去磷酸化，通过p38孵育对ATF2进行32P标记。使用或不使用 DUSP26 将样品在 30°C 下再孵育 30 分钟，并使用 SDS-PAGE 解析结果。干燥后，将凝胶暴露于 X 射线胶片。
免疫复合物激酶测试。将 HA-p38 和 FLAG-DUSP26 表达质粒共转染至 HEK 293 细胞中进行免疫复合物激酶测定。转染 48 小时后用 H2O2（1 mM，30 分钟）刺激细胞，并预处理 NSC-87877（0–100 μM，3 小时）。使用抗HA琼脂糖珠，离心去除多余液体后对细胞提取物进行免疫沉淀。将珠子用 PTP 裂解缓冲液处理一次，然后用 150 mM NaCl、5 mM EDTA、2 mM DTT 和 1 mM PMSF 处理两次，并用 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM MgCl2、和 5 mM EDTA。随后，将珠子再次悬浮于含有 20 μM ATP、0.3 μCi 的 [γ-32P]ATP 和 1 μg GST-ATF2 在 30 摄氏度下保持 1 小时。 SDS-PAGE技术用于分离激酶反应产物。干燥后将胶片暴露于凝胶。
体外磷酸酶测定和动力学评估。使用基于先前发表的技术的 96 孔微量滴定板测定，使用底物 3-O-甲基荧光素磷酸盐 (OMFP; Sigma, St. Louis, MO) 在浓度随每种酶的 Km 变化的情况下评估磷酸酶的活性。 H2O 和 DMSO 分别用于溶解 NSC-87877 (Calbiochem, San Diego, CA) 和 OMFP。每次反应均以 1% DMSO 作为终浓度进行。最终的孵育混合物 (150 μl) 含有 30 mM Tris–HCl (pH 7)、75 mM NaCl、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、0.1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)、0.33% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 100 nM PTP。该混合物针对酶活性进行了优化。加入OMFP开始反应，37℃孵育30分钟。使用多孔板读数器（GENios Pro；激发滤光片，485 nm；发射滤光片，535 nm）测量产物的荧光发射。在整个实验过程中，反应是线性的，并且与酶和底物的浓度直接相关。抑制剂的半最大抑制常数 (IC50) 定义为 PTP 活性降低 50% 时的浓度。使用曲线拟合应用程序 Prism 3.0（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州）找到了 Lineweaver-Burk 图的最佳曲线拟合和半最大抑制常数。每个实验至少重复三次，一式三份。
使用活性磷酸化 MAPK 进行去磷酸化检测。在 PTP 检测缓冲液（30 mM Tris-HCl (pH 7)、75 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 mM DTT 和 0.33% BSA）中，将六组氨酸标记的 DUSP26 (1 μg) 与活性磷酸化p38 (10 ng)、ERK (10 ng) 或 JNK (50 ng)。然后将混合物在 37°C 下孵育 30 分钟。在 30 μl 反应体积中，将 1 μg DUSP26 与 10 ng 活性磷酸化 p38 和不同浓度的 NSC-87877（0、10 或 100 μM）混合，以观察 NSC-87877 是否下调 DUSP26 对p38 体外。然后将混合物在 37°C 下孵育 30 分钟。使用磷酸-MAPK 抗体，对样品进行蛋白质印迹分析以确定 MAPK 的磷酸化状态。

细胞收获后，通过在 50 mM Tris-HCl (pH 8)、300 mM NaCl、1% NP-40 和 1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）中超声处理进行裂解。 4°C 下 30 分钟，裂解物在 4000 rpm 下澄清。 Ni-NTA 树脂柱（PEPTRON，Daejon，韩国）通过重力流接收上清液。使用 20 mM Tris–HCl (pH 8)、500 mM 氯化钠和 200–300 mM 咪唑进行洗脱步骤后，用 20 mM Tris–HCl (pH 8)、50 mM 咪唑和 500 mM 氯化钠冲洗树脂。用 20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、30% 甘油和 0.5 mM PMSF 透析过夜后，洗脱的蛋白质储存在 -80 °C。

Intrarenal neuroblastoma (NB) tumor mouse model in female nude mice.
30 mg/kg.
IP once daily for 15 days.

[1]. Discovery of a novel shp2 protein tyrosine phosphatase inhibitor. Mol Pharmacol. 2006 Aug;70(2):562-70.

[2]. NSC-87877, inhibitor of SHP-1/2 PTPs, inhibits dual-specificity phosphatase 26 (DUSP26). Biochem Biophys Res Commun. 2009 Apr 17;381(4):491-5.

[3]. NSC-87877 inhibits DUSP26 function in neuroblastoma resulting in p53-mediated apoptosis. Cell Death Dis. 2015 Aug 6;6(8):e1841.

C19H13N3O7S2

459.45

459.02

C, 49.67; H, 2.85; N, 9.15; O, 24.38; S, 13.96

56990-57-9

NSC-87877 disodium;56932-43-5

Solid powder

C1=CC2=C(C=C(C(=C2N=C1)O)N=NC3=CC4=C(C=C3)C=C(C=C4)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O

XGMFVZOKHBRUTL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H13N3O7S2/c23-19-16(10-17(31(27,28)29)15-2-1-7-20-18(15)19)22-21-13-5-3-12-9-14(30(24,25)26)6-4-11(12)8-13/h1-10,23H,(H,24,25,26)(H,27,28,29)

8-hydroxy-7-[(6-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl]quinoline-5-sulfonic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.53 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 3.33 mg/mL (7.25 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。