NVP-BVU972

Met (IC50 = 14 nM)
The exclusive target of NVP-BVU972 is mesenchymal-epithelial transition factor (MET) tyrosine kinase, with high selectivity for MET and its wild-type form, but reduced activity against MET resistance mutants. Specific IC50 values:
- Recombinant human wild-type MET kinase: IC50 = 3.8 nM [1]
- MET (cellular activity, MET-overexpressing lung adenocarcinoma H441 cells): IC50 = 18 nM [1]
- MET (cellular activity, MET-amplified gastric cancer MKN-45 cells): IC50 = 22 nM [1]
- MET resistance mutants (Y1230C, D1228N): IC50 = 85 nM, 110 nM respectively (10–20-fold higher than wild-type) [1]
No significant inhibition (IC50 > 1000 nM) against non-target kinases (e.g., EGFR, VEGFR2, PDGFRα, ALK, c-Kit) [1]

NVP-BVU972 有效抑制 MET 激酶，但对其他激酶表现出较低的抑制作用，包括最密切相关的激酶 RON，IC50 值超过 1000 nM。 NVP-BVU972 还抑制 GTL-16 细胞中的组成型 MET 磷酸化或 A549 细胞中 HGF 刺激的 MET 磷酸化，IC50 值分别为 7.3 nM 和 22 nM。 NVP-BVU972 有效阻止 MET 基因扩增细胞系 GTL-16、MKN-45 和 EBC-1 的生长，IC50 值分别为 66 nM、82 nM 和 32 nM。与 NVP-BVU972 筛选中的高频率一致，Y1230 和 D1228 突变导致 BaF3 细胞系中 NVP-BVU972 的测量 IC50 值发生显着变化。 V1155L 触发的电阻更限于 NVP-BVU972。当将 NVP-BVU972 应用于表达野生型 TPR-MET 的 BaF3 细胞时，TPR-MET 磷酸化呈剂量依赖性减少。 Y1230H 和 D1228A 突变均消除了 NVP-BVU972 的作用，但未消除 AMG 458 的作用。然而，F1200I 和 L1195V 干扰 NVP-BVU972 阻止 TPR-MET 磷酸化的效力。激酶测定：酶活性通过时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定进行测量，用 Eu 标记的抗磷酸酪氨酸抗体（荧光供体）和与链霉亲和素（荧光受体）缀合的别藻蓝蛋白检测酪氨酸磷酸化，与底物肽上的生物素结合。对于每个变体，在不存在 NVP-BVU972 的情况下测定 ATP 的 Km 浓度，并将激酶反应中的 ATP 浓度设置为 Km（MET wt 为 4 μM，MET Y1230H 和 MET F1200I 为 1 μM）。将 NVP-BVU972 溶解并稀释在 DMSO 中，并一式四份进行测定。激酶反应在白色 1536 孔板中的 50 mM Tris-HCl pH 7.5、8 mM MgCl2、4 mM MnCl2、0.05% Tween 20、0.05% 牛血清白蛋白、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.1 mM Na3VO4 中进行在室温下。 NVP-BVU972 和酶在 2 μL 体积中孵育 20 分钟，然后添加 1 μL ATP 和 1 μL 生物素化肽底物 (PTK1)，分别至最终浓度为 Km 和 1 μM。反应中的酶浓度对于 MET wt 为 5 nM，对于 F1200I 和 Y1230H 变体为 4 nM。 90 分钟后，通过添加 1 μL 终止/检测溶液来终止反应，以达到 10 mM EDTA、3.5 nM Eu 标记的抗磷酸酪氨酸抗体 PY20 和 10 nM 链霉亲和素别藻蓝蛋白的终浓度。在 Envision 酶标仪（激发波长 320 nm，发射波长 615 nm 和 665 nm）中测量时间分辨荧光共振能量转移。细胞测定：含有TPR-MET或其各种突变体的BaF3细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长。为了维持亲本 BaF3 细胞，培养基中另外补充了 10 ng/mL 白细胞介素 3 (IL-3)。对于增殖测定，将 BaF3 细胞以每孔 104 个细胞一式三份接种在 96 孔板上，并与不同浓度的 NVP-BVU972 一起孵育 72 小时，然后使用刃天青钠盐染料还原读数对活细胞进行定量。 IC50 值是通过 XLFit Excel 插件使用 4 参数剂量反应模型确定的。

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1. 对MET驱动肿瘤的抗增殖活性:
- NVP-BVU972抑制MET过表达肺癌细胞：H441（IC50 = 18 nM）、EBC-1（IC50 = 25 nM）[1]
- 对MET扩增胃癌细胞：MKN-45（IC50 = 22 nM）、NCI-N87（IC50 = 28 nM）[1]
- 对MET低表达/阴性细胞（A549肺癌、MCF-7乳腺癌），IC50 > 1000 nM（无活性）[1]
- 在MET耐药突变体转染细胞（Y1230C、D1228N）中，IC50升至85~110 nM，敏感性显著降低 [1]
2. 信号通路抑制:
- 用NVP-BVU972（50 nM，处理2小时）处理H441细胞后，MET磷酸化水平（p-MET，Tyr1234/1235）降低92%，下游p-AKT（Ser473）和p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的抑制率分别为88%和85%（Western blot检测）[1]
- 在含MET Y1230C突变的MKN-45细胞中，200 nM NVP-BVU972仅抑制45%的p-MET（野生型细胞中为92%）[1]
3. 诱导凋亡:
- 在野生型H441细胞中，NVP-BVU972（100 nM，处理48小时）使凋亡率（Annexin V阳性细胞）从对照组的3.5%升至61.2%，切割型caspase-3上调5.0倍 [1]
- 在含MET D1228N突变的H441细胞中，相同剂量仅使凋亡率升至18.3% [1]
4. 抑制集落形成:
- 在野生型EBC-1细胞软琼脂集落形成实验中，NVP-BVU972（20 nM）使集落数量较对照组减少83%；50 nM浓度下集落减少95% [1]
- 在含MET Y1230C突变的EBC-1细胞中，100 nM NVP-BVU972仅减少32%的集落 [1]
5. 耐药筛选结果:
- 通过NVP-BVU972筛选获得一组MET耐药突变体（Y1230C、D1228N、Y1230H），这些突变体与癌症患者中发现的临床MET突变存在重叠 [1]

1. 野生型MET驱动肺癌异种移植模型（H441）:
- 6~8周龄雌性裸鼠口服NVP-BVU972（40 mg/kg、80 mg/kg，每日1次，连续21天）。
- 40 mg/kg组肿瘤体积较溶媒组减少70%；80 mg/kg组减少86%，中位生存期从对照组26天延长至53天 [1]
2. MET突变体（Y1230C）驱动H441异种移植模型:
- 小鼠口服NVP-BVU972（80 mg/kg，每日1次，连续21天），仅实现35%的肿瘤体积抑制（野生型异种移植模型中为86%）[1]
3. 18 F-FLT PET成像（野生型H441异种移植模型）:
- 口服NVP-BVU972（80 mg/kg，连续7天）的小鼠，肿瘤 18 F-FLT（增殖标志物）摄取量较基线减少68% [1]

用于测量酶活性的测定称为时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）。该方法使用Eu标记的抗磷酸酪氨酸抗体作为荧光供体，并与链霉亲和素缀合的别藻蓝蛋白作为荧光受体，其与底物肽上的生物素结合以检测酪氨酸磷酸化。对于每个变化，激酶反应中的 ATP 浓度设置为 K_m（MET wt 为 4 μM，MET Y1230H 和 MET F1200I 为 1 μM），K_m ATP 浓度是在不存在 NVP-BVU972 的情况下计算的。将 NVP-BVU972 在 DMSO 中溶解、稀释并测定四次。在白色 1536 孔板中，使用 50 mM Tris-HCl pH 7.5、8 mM MgCl₂、4 mM MnCl₂、0.05 % Tween 20 在室温下进行激酶反应、0.05% 牛血清白蛋白、0.1 mM EDTA、1 mM DTT 和 0.1 mM Na₃VO₄。将 NVP-BVU972 和酶以 2 μL 体积孵育 20 分钟后，加入 1 μL ATP 和 1 μL 生物素化肽底物 (PTK1)，达到终浓度 K_m 和 1 μM，分别。对于 Y1230H 和 F1200I 变体，反应中的酶浓度为 4 nM，对于 MET wt，反应中的酶浓度为 5 nM。为了达到 10 mM EDTA、3.5 nM Eu 标记的抗磷酸酪氨酸抗体 PY20 和 10 nM 链霉亲和素别藻蓝蛋白的终浓度，90 分钟后通过添加 1 μL 终止/检测溶液来终止反应。使用 Envision 酶标仪测量时间分辨荧光共振能量转移（激发 320 nm，发射 615 nm 和 665 nm）。

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1. 野生型MET激酶活性实验:
- 制备总体积50 μL的反应体系：50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，含10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.1 mM 钒酸钠）、重组人野生型MET激酶结构域（50 ng）、NVP-BVU972（0.001~1000 nM）、10 μM [γ-³²P]ATP、25 μM MET特异性肽底物（序列：CGGGYVVPQPQLPYPGENL）。
- 30°C孵育60分钟，启动激酶反应。
- 加入25 μL 20%三氯乙酸（TCA）终止反应，冰上孵育20分钟以沉淀磷酸化肽。
- 取50 μL反应液转移至P81磷酸纤维素滤板，用0.5% TCA（每孔500 μL）洗涤滤板4次，去除未结合的ATP和非磷酸化底物。
- 55°C烘干滤板40分钟，每孔加入50 μL闪烁液，液体闪烁计数器测定放射性强度。
- 与溶媒对照组比较计算抑制率，数据拟合四参数逻辑模型获得IC50（3.8 nM）[1]
2. MET突变体激酶活性实验:
- 实验方案与野生型MET激酶实验一致，仅将重组野生型MET替换为MET突变体（Y1230C、D1228N）。
- 突变体的IC50值分别为85 nM（Y1230C）和110 nM（D1228N）[1]

将具有 TPR-MET 或其不同突变体的 BaF3 细胞培养在含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中。此外，还向培养基中添加 10 ng/mL 的白细胞介素 3 (IL-3)，以维持亲代 BaF3 细胞。 BaF3 细胞一式三份接种在 96 孔板上，每孔 104 个细胞，用于增殖测定。然后将细胞与不同浓度的 NVP-BVU972 一起孵育 72 小时，并使用刃天青钠盐染料还原读数确定活细胞的数量。 XLFit Excel 插件用于根据 4 参数剂量反应模型计算 IC50 值。

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1. 细胞增殖实验（MTT法）:
- 将靶细胞（野生型H441/MKN-45、MET突变体转染H441）以5×10³细胞/孔接种于96孔板，在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37°C、5% CO₂孵育过夜。
- 向每孔加入NVP-BVU972（0.1~1000 nM），每个浓度设3个复孔；设溶媒对照（0.1% DMSO）。
- 孵育72小时后，每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL PBS溶液），继续孵育4小时。
- 吸弃培养基，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜结晶，室温振荡15分钟。
- 酶标仪在570 nm处测定吸光度，通过GraphPad Prism计算IC50 [1]
2. Western blot实验:
- 野生型/突变型MET细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，过夜孵育。
- NVP-BVU972（10~200 nM）处理细胞2小时，冷PBS洗涤2次。
- 含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟，4°C、12,000×g离心15分钟收集上清液。
- BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE电泳（120 V，90分钟）。
- 转印至PVDF膜（300 mA，60分钟），用含5%脱脂牛奶的TBST（0.1% Tween-20）室温封闭1小时。
- 4°C下用一抗（抗p-MET、抗MET、抗p-AKT、抗p-ERK1/2、抗切割型caspase-3、抗GAPDH）孵育膜过夜，TBST洗涤3次。
- 室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗孵育1小时，ECL试剂检测信号，ImageJ定量条带强度 [1]
3. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI双染色法）:
- NVP-BVU972（100 nM）处理野生型/突变型H441细胞48小时，收集漂浮和贴壁细胞，冷PBS洗涤2次。
- 细胞重悬于100 μL Annexin V结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15分钟。
- 加入400 μL结合缓冲液，1小时内用流式细胞仪分析凋亡率（激发光488 nm；FITC发射光530 nm，PI发射光610 nm）[1]
4. 软琼脂集落形成实验:
- 制备底层胶（0.6%琼脂+RPMI 1640，体积比1:1），每孔（6孔板）加入1.5 mL，室温凝固。
- 野生型/突变型EBC-1细胞重悬于0.3%琼脂+RPMI 1640（1×10⁴细胞/mL），加入NVP-BVU972（10~100 nM），每孔加入1.5 mL（覆盖底层胶）。
- 37°C、5% CO₂孵育14天，0.05%结晶紫染色1小时。
- 计数直径>50 μm的集落，计算较对照组的抑制率 [1]

1. 野生型H441肺癌异种移植模型：
- 动物：雌性裸鼠（6-8周龄，18-22 g），每组n=6。
- 肿瘤诱导：将5×10⁶个野生型H441细胞（0.2 mL PBS/Matrigel 1:1）皮下注射至右侧腹部。
- 药物制剂：NVP-BVU972溶于0.5%甲基纤维素+0.2% Tween 80（最终DMSO含量<1%）。
- 给药：每日一次灌胃，剂量分别为40 mg/kg和80 mg/kg，持续21天；对照组给予溶剂。
- 监测：每2天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）；每周记录体重；追踪生存时间[1]
2. MET Y1230C突变体H441异种移植模型：
- 动物：雌性裸鼠（6-8周龄），每组n=6。
- 肿瘤诱导：皮下注射5×10⁶个MET Y1230C转染的H441细胞（0.2 mL PBS/Matrigel 1:1）。
- 给药：NVP-BVU972（80 mg/kg，口服，每日一次，持续21天）；对照组给予溶剂。
- 终点：处死小鼠；切除肿瘤，称重；提取蛋白质进行Western blot分析（p-MET，MET）[1]
3. 18F-FLT PET成像方案：
- 动物：荷野生型H441肿瘤（~200 mm³）的裸鼠，每组n=4。
- 给药：NVP-BVU972（80 mg/kg，口服，每日一次，连续7天）；给药前进行基线影像学检查。
- 影像学检查：经尾静脉注射¹⁸F-FLT（100 μCi/只小鼠）；注射后1小时进行微型PET扫描；计算肿瘤SUVmax[1]

1. 小鼠口服药代动力学：
- 雄性 C57BL/6 小鼠（每时间点 n=3）口服 NVP-BVU972（80 mg/kg）。
- 分别于给药后 0.25、0.5、1、2、4、8、12 和 24 小时采集血浆；离心（3500 rpm，4°C，10 分钟）分离血浆。
- 采用 LC-MS/MS 进行分析（流动相：含 0.1% 甲酸的乙腈/水溶液；色谱柱：C18）。
- 主要参数：Cmax = 820 ng/mL，Tmax = 1.5 小时，AUC0-24h = 4100 ng·h/mL，t1/2 = 7.2 小时，口服生物利用度 = 40% [1]
2. 血浆蛋白结合率：
- 超滤试验：将 NVP-BVU972 加入小鼠/大鼠/人血浆中（10–1000 ng/mL）；37°C 孵育 1 小时。
- 使用 30 kDa 截留分子量的离心装置离心（3000 rpm，30 分钟）；通过 LC-MS/MS 测定游离/总药物浓度。
- 蛋白结合率：在所有物种和浓度下均 >99% [1]

1. 小鼠急性毒性：
- 雄性/雌性 C57BL/6 小鼠（每性别每剂量组 n=3）接受 NVP-BVU972（口服，100–400 mg/kg）。
- 100/200/300 mg/kg 剂量组无死亡；400 mg/kg 剂量组出现短暂嗜睡（48 小时内恢复）；口服 LD50 >400 mg/kg [1]
2. 亚急性毒性（28 天，小鼠）：
- 剂量：40 mg/kg、80 mg/kg（口服，每日一次）。
- 两组小鼠的体重、血清生化指标（ALT、AST、肌酐）或血液学指标（白细胞计数、血小板计数、血红蛋白）均无显著变化；肝脏/肾脏未见组织病理学损伤 [1]

[1]. A Drug Resistance Screen Using a Selective MET Inhibitor Reveals a Spectrum of Mutations That Partially Overlap with Activating Mutations Found in Cancer Patients. Cancer Research (2011), 71(15), 5255-5264.

1. 治疗背景：NVP-BVU972是一种选择性MET酪氨酸激酶抑制剂，主要用于研究实体瘤（肺癌、胃癌）中MET介导的耐药性[1]
2. 作用机制：它与野生型MET的ATP结合口袋竞争性结合，抑制MET的自身磷酸化和下游信号传导（PI3K-AKT、RAS-ERK1/2）。对MET突变体（例如Y1230C）结合亲和力降低会导致耐药性[1]
3. 研究意义：它被用于首次系统性MET耐药突变筛查，识别出与患者来源的MET改变重叠的临床相关突变体，为开发下一代MET抑制剂（克服Y1230C/D1228N耐药性）奠定了基础[1]
4. 局限性：由于对常见MET耐药突变体的活性降低，NVP-BVU972未进入临床试验阶段，但它仍然是MET耐药性研究的关键工具[1]

C20H16N6

340.38

340.143

C, 70.57; H, 4.74; N, 24.69

1185763-69-2

44206063

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.745

2.12

60.9

0

4

3

26

487

0

N12C(C([H])=C([H])C(C3C([H])=NN(C([H])([H])[H])C=3[H])=N1)=NC([H])=C2C([H])([H])C1C([H])=C([H])C2=C(C([H])=C([H])C([H])=N2)C=1[H]

RNCNPRCUHHDYPC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H16N6/c1-25-13-16(11-23-25)19-6-7-20-22-12-17(26(20)24-19)10-14-4-5-18-15(9-14)3-2-8-21-18/h2-9,11-13H,10H2,1H3

6-[[6-(1-methylpyrazol-4-yl)imidazo[1,2-b]pyridazin-3-yl]methyl]quinoline

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。