NVP-LCQ-195

Cdk5/p25 (IC50 = 1 nM); CDK5/p35 (IC50 = 1 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 2 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 2 nM); CDK2/cyclinE (IC50 = 5 nM); CDK9/cyclinT1 (IC50 = 15 nM); CDK3/Cyclin E (IC50 = 42 nM); cdk6/cyclin D3 (IC50 = 187 nM); CDK7/Cyclin H/MAT1 (IC50 = 3564 nM)
LCQ195 potently inhibits CDK 1, 2 and 5 activity and also modestly targets CDK3 and 9. These distinct patterns of inhibition of CDKs correlate with different patterns of activity against MM cells. [1]
EC50 values with seliciclib for most MM cell lines are >10 μM compared to ~1 μM or lower for similar cell lines treated with LCQ195. [1]
Signaling through the Rb pathway is reduced by LCQ195, but remains largely unaffected by flavopiridol. In addition, the anti-MM activity of LCQ195 does not involve the release of cytochrome c and is not suppressed by the over-expression of bcl-2. LCQ195, therefore, appears to operate through mitochondrial-independent mechanisms of apoptosis.[1]

LCQ195 可有效抑制 CDK 1、2 和 5 活性，同时适度靶向 CDK3 和 9。这些不同的 CDK 抑制模式与针对 MM 细胞的不同活性模式相关。[1]
对于大多数 MM 细胞系，seliciclib 的 EC50 值 >10 μM，而对于用 LCQ195 处理的类似细胞系，EC50 值约为 1 μM 或更低。[1]
LCQ195 可降低通过 Rb 通路的信号传导，但基本不受黄酮吡啶醇的影响。此外，LCQ195 的抗 MM 活性不涉及细胞色素 c 的释放，也不会因 bcl-2 的过度表达而受到抑制。因此，LCQ195 似乎是通过线粒体独立的细胞凋亡机制起作用的。[1]

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NVP-LCQ-195 在一组人多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中抑制细胞活力，许多细胞系的 EC50 值约为 1 µM 或更低（例如，S6B45：0.761 µM，OPM2：<1 µM，KMS-12-BM：0.737 µM，U266：0.817 µM）。一些细胞系显示出较高的 EC50 值（例如，Dox40：2.810 µM）。[1]
NVP-LCQ-195 以剂量依赖性方式降低从 MM 患者中纯化的原代 CD138+ 肿瘤细胞的活力（0-4 µM，处理 48 小时）。[1]
细胞死亡定型实验表明，将敏感的 MM 细胞系（如 OPM-2，MM.1S）暴露于 NVP-LCQ-195 (0.5 µM) 下短至 8-16 小时，足以使细胞在后续无药培养基中培养时定型走向死亡。[1]
NVP-LCQ-195 对 MM 细胞表现出选择性细胞毒性，优于非恶性细胞。计算得到的 EC50 值对于非恶性的 HS-5 骨髓基质细胞 (BMSCs) 和水生化 THLE-3 肝细胞 >4 µM。来自健康供体的植物血球凝集素刺激的外周血单个核细胞 (PBMCs) 与大多数 MM 细胞系相比敏感性降低。[1]
NVP-LCQ-195（浓度高达 2 µM）克服了由白细胞介素-6 (IL-6, 10 ng/mL)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1, 50 ng/mL) 或与 HS-5 基质细胞共培养对 MM.1S 细胞产生的增殖和保护作用。[1]
用 NVP-LCQ-195 (2 µM) 处理 MM.1S 细胞诱导了细胞周期阻滞，其特征是早期（4-16 小时内）处于 S 期和 G2/M 期的细胞百分比增加，随后在较晚时间点（48 小时）亚 G1 期细胞群（指示细胞死亡）增加。[1]
NVP-LCQ-195 (2 µM) 在 MM.1S 细胞中诱导凋亡，通过 Annexin V 阳性细胞随时间增加而证实（早期凋亡：Annexin V+/PI-；晚期凋亡/死亡：Annexin V+/PI+）。[1]
蛋白质免疫印迹分析显示，NVP-LCQ-195 处理 (2 µM) 导致 caspase-3、caspase-8 和 PARP 的切割，但没有切割 caspase-9。它还导致 Rb 磷酸化的显著降低，CDK2、CDK5、cyclin B1、cyclin D2、cyclin E2、cdc25、E2F1 的水平降低，以及 p53、p21、p27、Puma 和 Noxa 的水平增加。未观察到 Bcl-2、Bad 或 Bax 蛋白水平的变化。[1]
在用 NVP-LCQ-195 (2 µM) 处理长达 16 小时的 MM.1S 细胞中未检测到细胞色素 c 释放。在 MM.1S 细胞中过表达 Bcl-2 并未显著影响其对 NVP-LCQ-195 的敏感性，提示其为不依赖线粒体的凋亡机制。[1]
NVP-LCQ-195 与地塞米松 (Dex) 联用，在多种剂量组合下表现出协同的抗 MM 活性（大多数条件下的联合指数 CI < 1）。与硼替佐米或多柔比星未观察到显著的协同或拮抗作用。[1]
用 NVP-LCQ-195 (2 µM) 处理的 MM.1S 细胞的基因表达谱显示，与癌变（如 MYC、IRF4、XBP-1）、耐药（如 HIF1A）、生长因子信号传导和抗凋亡（如 XIAP、survivin）相关的转录本受到抑制，同时诱导了一些促凋亡基因（如 TRAIL-R2/DR5）。[1]
通路分析表明，NVP-LCQ-195 处理降低了与关键转录因子（MYC、HIF-1α、IRF4、NF-κB）活性、信号通路（Notch、Ras、Akt、Hedgehog）、泛素-蛋白酶体系统、核糖体生物合成、癌症干细胞自我更新和高危 MM 相关的转录特征幅度。[1]
从 NVP-LCQ-195 在 MM.1S 细胞中诱导的早期（2 小时）基因表达变化中得出的转录指数被应用于临床数据集。肿瘤中基线高表达受 NVP-LCQ-195 抑制基因的硼替佐米治疗 MM 患者，与这些基因低表达的患者相比，其无进展生存期 (PFS) 和总生存期 (OS) 显著缩短。[1]

使用 Invitrogen Z'-LYTE™ 技术筛选参与细胞周期的激酶。选定的激酶存在 500 nM LCQ195（在 1% DMSO 中）和 100 μM ATP。[1]

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使用基于荧光共振能量转移 (FRET) 的肽段磷酸化检测平台进行体外激酶活性测定。在 500 nM NVP-LCQ-195（溶于 1% DMSO）和 100 µM ATP 存在下孵育选定的激酶。该测定涉及将 ATP 的 γ-磷酸基团转移至合成 FRET 肽上的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。二级反应使用位点特异性蛋白酶，该酶仅切割非磷酸化的 FRET 肽。供体激发后供体与受体荧光团发射的比率用于量化激酶活性，该比率的偏移表示抑制。[1]
另一个激酶分析平台涉及将各种重组 CDK/cyclin 复合物与 NVP-LCQ-195 的 5 个对数剂量滴定（0.001-10 µM）和 ATP 一起孵育。测量激酶活性并生成剂量反应曲线以计算每种激酶的 IC50 值。[1]

通过将细胞放入 24 孔板中，用 LCQ195 (2 μM) 孵育 1-24 小时，评估导致 MM 细胞死亡所需的 LCQ195 最低暴露量。[1]
用 2 μM LCQ195 处理 MM 细胞系 MM.1S 0-48 小时。[1]
用 2 μM LCQ195 或 DMSO（作为对照）处理 MM.1S 细胞 2、4、8、16 和 24 小时；然后提取和纯化总 RNA，合成 cDNA 并标记 cRNA，然后与 HT-U133 A 和 B 阵列杂交。[1]

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细胞活力 (MTT) 测定: 将 MM 细胞系或原代细胞铺板于多孔板中。加入指定浓度（通常为 0-4 µM）的 NVP-LCQ-195（溶于 DMSO）。孵育 48 或 72 小时后，加入 MTT 试剂孵育最后 4 小时。使用酸化有机溶剂溶解形成的甲瓒晶体，并在 570/630 nm 处用分光光度法测量吸光度。细胞存活率表示为相对于溶剂对照的百分比。[1]
细胞死亡定型实验: 将 MM 细胞与固定浓度的 NVP-LCQ-195（例如，0.5 或 2 µM）孵育不同时间（1-24 小时）。然后用无药培养基洗涤细胞以去除残留化合物，并在无药培养基中继续孵育一段时间（例如，3 天）以使死亡定型显现。使用 MTT 法定量存活率。[1]
流式细胞术进行细胞周期分析: 收获处理组和对照组的细胞，用 70% 乙醇固定，用 RNase 处理，并用碘化丙啶 (PI) 染色。使用流式细胞仪分析 DNA 含量，以确定细胞在 G0/G1、S 和 G2/M 各期的分布，以及亚 G1 期（凋亡）细胞群。[1]
流式细胞术进行凋亡检测 (Annexin V/PI 染色): 收获细胞，洗涤，重悬于结合缓冲液中。然后根据试剂盒说明，用异硫氰酸荧光素标记的 Annexin V 和 PI 染色。使用流式细胞仪分析染色细胞，以区分活细胞 (Annexin V-/PI-)、早期凋亡细胞 (Annexin V+/PI-)、晚期凋亡/坏死细胞 (Annexin V+/PI+) 和死细胞 (Annexin V-/PI+)。[1]
细胞色素 C 释放测定: 收集处理后的细胞，洗涤，并使用专用缓冲液透化。固定细胞，洗涤，并用一种特异性识别细胞色素 c 的抗体染色，该抗体在未释放时与线粒体结合。通过流式细胞术测量细胞内荧光信号以评估细胞色素 c 释放。[1]
蛋白质免疫印迹: 用含有去污剂和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解液裂解处理后的细胞。测定蛋白质浓度。等量的蛋白质通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至膜上，并进行封闭。膜与特异性一抗孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。使用增强化学发光法可视化蛋白质条带。[1]
基质细胞共培养实验: 将骨髓基质细胞（如 HS-5）铺板并使其粘附过夜。然后加入表达荧光素酶的 MM 细胞，并用 NVP-LCQ-195 处理。孵育后，加入荧光素底物，使用发光计测量产生的与存活 MM 细胞数量成比例的生物发光信号。[1]
基因表达谱分析: 用 NVP-LCQ-195 或溶剂处理 MM 细胞不同时间。提取并纯化总 RNA，用于 cDNA 合成，随后进行 cRNA 标记并杂交至寡核苷酸微阵列（例如，Affymetrix HT-U133 A&B 芯片）。分析数据以鉴定差异表达基因。[1]

该研究表明，在体外测试浓度下，NVP-LCQ-195 对多发性骨髓瘤 (MM) 细胞的细胞毒性高于非恶性细胞（HS-5 基质细胞、THLE-3 肝细胞、PHA 刺激的 PBMC）。但未提供体内研究的具体毒性数据（例如，LD50、器官毒性）。[1]

[1]. Molecular and cellular effects of multi-targeted cyclin-dependent kinase inhibition in myeloma: biological and clinical implications. Br J Haematol. 2011 Feb;152(4):420-32.

NVP-LCQ-195（也称为 AT9311）是一种小分子非手性杂环激酶抑制剂，由 Astex Therapeutics 发现并与诺华公司合作开发。[1]
它是一种多靶点 CDK 抑制剂，具有独特的活性谱，主要靶向 CDK1、CDK2 和 CDK5，对 CDK3 和 CDK9 也有活性，但对 CDK6 和 CDK7 的活性较弱。这种活性谱与其他 CDK 抑制剂（如 flavopiridol、seliciclib 和 SNS-032）不同。[1]
其抗多发性骨髓瘤 (MM) 的作用机制涉及细胞周期阻滞（S 期和 G2/M 期），导致 caspase-8 和 caspase-3 依赖性但线粒体非依赖性的细胞凋亡。它调节对 MM 细胞存活和侵袭性至关重要的关键致癌通路和转录因子。 [1]
该研究强调，NVP-LCQ-195诱导的特定转录变化与硼替佐米治疗患者的不良临床结局相关，提示其可能靶向生物学侵袭性强的疾病亚群。这种将药物诱导的分子特征与临床数据联系起来的方法被认为是一种评估多靶点药物的策略。[1]

C17H19CL2N5O4S

460.3349

459.053

C, 44.36; H, 4.16; Cl, 15.40; N, 15.21; O, 13.90; S, 6.96

902156-99-4

902156-99-4

11655534

White to off-white solid powder

3.916

136.13

3

6

5

29

701

0

O=C(C1C(Cl)=CC=CC=1Cl)NC1C(C(NC2CCN(S(C)(=O)=O)CC2)=O)=NNC=1

CCUXEBOOTMDSAM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H19Cl2N5O4S/c1-29(27,28)24-7-5-10(6-8-24)21-17(26)15-13(9-20-23-15)22-16(25)14-11(18)3-2-4-12(14)19/h2-4,9-10H,5-8H2,1H3,(H,20,23)(H,21,26)(H,22,25)

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-(1-methylsulfonylpiperidin-4-yl)-1H-pyrazole-5-carboxamide

NVP-LCQ-195; NVP-LCQ195; NVP-LCQ 195; LCQ 195; LCQ-195; LCQ195; AT9311; AT-9311; AT 9311

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 66.7~92 mg/mL (144.8~199.9 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。