Olaparib (AZD2281; KU0059436)   中文名称: 奥拉帕尼

PARP-2 ( IC50 = 1 nM ); PARP-1 ( IC50 = 5 nM ); tankyrase-1 ( IC50 = 1.5 μM ); Autophagy; Mitophagy

体外活性：奥拉帕尼可对抗 BRCA1 或 BRCA2 突变。奥拉帕尼对坦科聚合酶 1 不敏感 (IC50 >1 μM)。浓度为 30-100 nM 的奥拉帕尼可以消除 SW620 细胞中的 PARP-1 活性。与 BRCA1 和 BRCA2 丰富的细胞系（Hs578T、MDA-MB-231 和 T47D）相比，奥拉帕尼对 BRCA1 缺陷细胞系（MDA-MB-463 和 HCC1937）高度敏感。由于PARP抑制作用抑制了碱基切除修复，奥拉帕尼对KB2P细胞高度敏感，这可能导致DNA复制过程中单链断裂转化为双链断裂，从而激活BRCA2依赖性重组途径。激酶测定：向第 1 至第 10 列中添加 1 μL 奥拉帕尼（在 DMSO 中），并且仅将 1 μL DMSO 添加至阳性 (POS) 和阴性 (NEG) 对照孔（分别为第 11 列和第 12 列）预处理的 FlashPlate。 PARP-1 在缓冲液中按 1:40 稀释（缓冲液 B：10% 甘油 (v/v)、25 mM HEPES、12.5 mM MgCl2、50 mM KCl、1 mM DTT、0.01% NP-40 (v/v)、 pH 7.6）和 40 μL 添加到所有 96 个孔中（测定中的最终 PARP-1 浓度约为 1 ng/μL）。将板密封并在室温下摇动 15 分钟。随后，将 10 μL 阳性反应混合物（每孔 0.2 ng/μL 双链寡核苷酸 [M3/M4] DNA、5 μM NAD+ 最终测定浓度和每孔 0.075 μCi 3H-NAD+）添加到适当的反应孔中。孔（第 1-11 列）。将不含 DNA 寡核苷酸的阴性反应混合物添加到第 12 列（使用平均阴性对照值作为背景）。将板重新密封并在室温下再摇动 60 分钟以使反应继续进行。然后，向每孔中加入 50 μL 冰冷的乙酸 (30%) 以终止反应，并将板密封并在室温下再摇动 60 分钟。然后使用 TopCount 读板器以每分钟计数 (CPM) 确定与 FlashPlate 结合的氚化信号。细胞测定：奥拉帕尼的细胞毒性通过克隆形成测定来测量。使用前将奥拉帕尼溶解在 DMSO 中并用培养基稀释。将细胞（乳腺癌细胞系，包括 SW620 结肠细胞、A2780 卵巢细胞、HCC1937、Hs578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436 和 T47D）接种在六孔板中并贴壁过夜。然后添加不同浓度的奥拉帕尼并将细胞孵育7-14天。之后对存活的菌落进行计数以计算IC50。

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体外细胞效力[1]
在许多体外模型中评估了47/奥拉帕尼的细胞效力。初步研究表明，47是一种有效的药物，可以增强烷化剂MMS对细胞的杀伤作用。在SW620细胞上建立MMS的生长抑制曲线后，以nM浓度添加PARP-1抑制剂可剂量依赖性地提高MMS的有效性（图2a）。增强水平在100nM浓度附近趋于平稳，这表明47与MMS联合使用的最大细胞活性在这个范围内。我们通过使用标准杆数形成测定法直接测量细胞中的PARP-1抑制活性来证实这一点，其中47以类似的浓度范围应用于SW620细胞裂解物，并确定PARP-1抑制的IC50约为6nM，PARP-1活性的总消融浓度为30-100nM（图2b）。

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结果：遗传、转录和功能分析证实，成功分离出BRCA2缺陷型和BRCA2富集型小鼠乳腺肿瘤细胞系。用11种不同的抗癌药物或γ射线照射治疗这些细胞系表明，新型特异性PARP抑制剂Olaparib/AZD2281对BRCA2缺陷型乳腺肿瘤细胞和BRCA2富集型乳腺癌细胞的生长抑制作用最强。最后，药物组合研究表明，AZD2281和顺铂对BRCA2缺陷细胞具有协同细胞毒性，但对BRCA2-熟练对照细胞没有协同细胞毒性。
结论：我们成功建立了第一套BRCA2缺陷乳腺肿瘤细胞系，这是对现有BRCA突变乳腺癌症临床前模型的重要补充。这些细胞对PARP抑制剂奥拉帕尼单独或与顺铂联合使用的AZD2281的高度敏感性为AZD2281作为针对BRCA缺陷型癌症的新型靶向治疗提供了强有力的支持。

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Olaparib选择性靶向ATM突变淋巴细胞，包括增殖的原代CLL细胞。对Olaparib的敏感性是由ATM活性的缺失和细胞增殖介导的。ATM功能障碍细胞的奥拉帕尼敏感性与DNA损伤的积累有关，并且与凋亡无关。研究人员调查了5个ATM突变淋巴母细胞系（LCL）、一个ATM突变MCL细胞系、一个ATM-敲除PGA-CLL细胞系和9个ATM缺陷原代CLL对聚ADP核糖聚合酶抑制剂olaparib（AZD2281）的体外敏感性，并观察到与ATM野生型对应物相比的差异杀伤。ATM的药理学抑制和ATM敲除证实了这种作用是ATM依赖性的，并且是通过有丝分裂突变介导的，与凋亡无关。

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奥拉帕尼使ATM突变细胞对常规细胞毒性药物敏感[4]
最后，为了解决PARP抑制提高标准CLL治疗和其他化疗药物效果的能力，我们测试了olaparib使ATM突变细胞对嘌呤类似物氟达拉滨、烷化剂4HC和苯达莫司汀、组蛋白脱乙酰酶抑制剂VPA和IR敏感的能力（补充表2；图6A）。当单独用这些药物处理时，Granta-519细胞对苯达莫司汀和4HC具有抗性，但对VPA敏感。奥拉帕尼预处理能够显著地使细胞对所有测试的药物敏感（图6A）。奥拉帕尼与VPA之间观察到最大的协同作用，而奥拉帕尼和IR仅显示出适度的协同作用（补充表2）。4HC和奥拉帕尼的效果在很大程度上是相加的（补充表2），尽管在0.1µM的4HC剂量下观察到适度的协同作用（图6A）。最后，奥拉帕尼对氟达拉滨和苯达莫司汀细胞毒性的影响通常是累加的，尽管在某些剂量的氟达拉滨下可以检测到协同活性（补充表2）。Western blot分析表明，当Granta-519细胞暴露于4HC、VPA或IR与1µM olaparib联合使用时，PARP1和胱天蛋白酶3和7的切割增强（图6B），表明在olaparib存在的情况下，药物诱导的凋亡增加。

奥拉帕尼（10 mg/kg，口服）与替莫唑胺联合使用可显着抑制 SW620 异种移植物中的肿瘤生长。奥拉帕尼对 Brca1-/-;p53-/- 乳腺肿瘤显示出良好的反应（每天 50 mg/kg ip），而对 HR 缺陷的 Ecad-/-;p53-/- 乳腺肿瘤没有反应。奥拉帕尼甚至在荷瘤小鼠中没有表现出剂量限制性毒性。奥拉帕尼已用于治疗 BRCA 突变肿瘤，例如卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。此外，Olaparib 对 ATM（共济失调毛细血管扩张突变）缺陷型肿瘤细胞表现出选择性抑制作用，这表明它是治疗 ATM 突变淋巴肿瘤的潜在药物。

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体内疗效[1]
根据我们的体外细胞数据，在SW620肿瘤模型中评估了化合物47/Olaparib增强甲基化化疗药物TMZ抗肿瘤活性的能力。 携带SW620异种移植物肿瘤的动物用化合物47/Olaparib（10mg/kg，po）联合TMZ（50mg/kg，po）治疗，每天一次，连续5天，之后让肿瘤生长出来。与单独使用TMZ组相比，TMZ加化合物47组合对肿瘤体积有相当大的抑制作用（平均值以相对肿瘤体积（RTV）给出，图4）。这相当于在TMZ治疗和联合治疗之间的整个研究末期，肿瘤生长抑制率超过80%。TMZ和联合治疗达到2×RTV的时间分别为44天和70天（潜伏期增加59%）。更高的RTV值，如4×RTV（两倍），无法进行比较评估，因为在研究期间，用联合治疗的肿瘤没有达到这种大小，这清楚地表明化合物47对TMZ活性的显著增强（图4）。TMZ耐受良好，第7天（给药结束后3天）最大平均体重减轻6%，一周内完全恢复。同样，当联合使用时，PARP抑制剂不会加剧TMZ的全身毒性，在第6天最大平均体重减轻9%，体重在3天内完全恢复，没有死亡（体重减轻>20%），这表明在这种给药方案下，联合治疗具有良好的耐受性。

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为了在现实的体内环境中评估PARP1的抑制作用，我们在BRCA1相关乳腺癌症的基因工程小鼠模型（GEMM）中测试了PARP抑制剂OlaparibAZD2281。用AZD2281治疗荷瘤小鼠抑制了肿瘤生长，没有毒性迹象，导致存活率显著提高。在该模型中，AZD2281的长期治疗确实导致了耐药性的发展，这是由编码P-糖蛋白外排泵的Abcb1a/b基因的上调引起的。这种对AZD2281的耐药性可以通过联合使用P-糖蛋白抑制剂tariquidar来逆转。AZD2281与顺铂或卡铂的联合使用增加了无复发和总体生存率，表明AZD2281增强了这些DNA损伤剂的作用。我们的研究结果证明了AZD2281对BRCA1缺乏型癌症的体内疗效，并说明了癌症的GEMM如何用于新疗法的临床前评估和测试克服或规避治疗耐药性的方法。[3]

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ATM突变淋巴肿瘤细胞在体内对Olaparib敏感[4]
为了研究奥拉帕尼的体内影响，我们建立了ATM突变MCL细胞系Granta-519的小鼠异种移植物模型。为了确定在不同动物队列中开始奥拉帕尼治疗之前是否已经发生了肿瘤细胞系的浸润和植入，在治疗开始当天（静脉注射细胞后14天或皮下注射细胞后5天）分析了每个队列中的3只代表性小鼠。注射后5天（皮下注射）和14天（静脉注射），通过FACS分析观察到骨髓和脾脏中存在至少占所有细胞1%的肿瘤细胞，这被认为是植入的（图5A）。此外，使用免疫细胞化学和抗人CD5、Pax-5和Ki-67抗体，我们证实在治疗开始前的两个时间点，脾脏和骨髓中都有增殖的人B淋巴肿瘤细胞的显著浸润（图5A）

随后，在静脉注射细胞5周后和奥拉帕尼治疗14天后，比较了23只NOD/SCID Granta-519细胞注射小鼠淋巴器官中的肿瘤负荷程度。然而，在实验早期，7只小鼠死于与移植物无关的原因，留下16只小鼠，这些小鼠要么接受奥拉帕尼（n=8）治疗，要么仅接受赋形剂（=8）治疗。通过FACS分析对人CD45染色百分比的分析（图5B）显示，与仅接受载体的小鼠相比，接受奥拉帕尼治疗的小鼠骨髓中Granta-519细胞的百分比显著降低，脾脏中的肿瘤细胞载量呈下降趋势（图5B）。 接下来，我们评估了奥拉帕尼对小鼠局部注射ATM突变Granta-519细胞产生的皮下肿瘤生长的影响，发现奥拉帕尼治疗与肿瘤大小减小之间存在显著的正相关关系（图5C）。最后，与单独使用载体相比，奥拉帕尼治疗显著提高了植入Granta-519细胞的小鼠的总体存活率（图5D）。

该测定评估了奥拉帕尼抑制 PARP-1 酶活性的能力。测量 PARP-2 活性抑制的另一种方法涉及使用 PARP-2 特异性抗体在白壁 96 孔板中结合重组 PARP-2 蛋白。添加 ³H-NAD⁺ DNA 后测量 PARP-2 活性。洗涤后添加闪烁剂以量化 ³H 掺入的核糖基化。创建了针对 tankyrase-1 的 AlphaScreen 测定，包括在 384 孔 ProxiPlate 测定中与生物素化 NAD⁺ 一起孵育 HIS 标记的重组 TANK-1 蛋白。通过添加 α 珠子结合 HIS 和生物素标签来产生邻近信号；该信号的丢失与 TANK-1 活性抑制直接相关。每个实验至少进行三次重复。

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体外分离酶测定[1]
该测定测定了受试化合物抑制PARP-1酶活性的能力。所采用的方法与报道一致。我们通过使用PARP-1测定的变体来测量PARP-2活性抑制，其中PARP-2蛋白（重组）在96孔白壁板中被PARP-2特异性抗体结合。在添加3H-NAD+DNA后测量PARP-2活性。洗涤后，加入闪烁剂以测量3H掺入的核糖基化。对于tankyrase-1，开发了一种AlphaScreen检测方法，其中HIS标记的重组TANK-1蛋白在384孔ProxiPlate检测中与生物素化的NAD+一起孵育。加入α珠以结合HIS和生物素标签，从而产生接近信号，而TANK-1活性的抑制与该信号的损失成正比。所有实验至少重复三次。

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体外PARP活性测定[1]
SW620全细胞蛋白提取物是通过在提取缓冲液（1×PBS，1%NP-40，蛋白酶抑制剂混合物，200μM DTT）中在4°C下孵育10分钟制备的。PARP活性通过体外激活后标准杆数形成量的定量来确定。PARP激活反应通过在30°C下使用65 ng SW620全细胞提取物在反应混合物（50 mM Tris pH 8，4 mM MgCl2，200μM DTT，200μM NAD+，20 ng/μL DNA）中进行5分钟。然后通过使用中尺度发现测定平台对每个反应中形成的标准杆数量进行定量。数据是通过三次重复实验计算得出的，即PARP活性相对于载体对照±SE和IC50的平均百分比，这些百分比是使用XL-FIT 4软件计算的。

增强因子或 PF50 值是通过将对照生长中使用的烷化剂甲磺酸甲酯 (MMS) 的 IC50 除以 MMS 加 PARP 抑制剂的 IC50 来确定的。使用 HeLa B 细胞以固定 200 nM 浓度对 Olaparib 进行 MMS 筛选测试。在结直肠细胞系 SW620 上测试的奥拉帕尼浓度为 1、3、10、100 和 300 nM。磺胺罗丹明 B (SRB) 测定用于测量细胞生长。

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体外细胞PF50测定[1]
PF50值是增强因子，其计算方法为使用烷基化剂甲基甲烷磺酸盐（MMS）的对照生长的IC50除以MMS与PARP抑制剂组合的IC50。使用HeLa B细胞，在固定的200 nM浓度下测试测试化合物，以用MMS进行筛选。对于化合物47/Olaparib在SW620结直肠细胞系上的测试（图2），使用的浓度为1、3、10、100和300 nM。通过使用磺基罗丹明B（SRB）测定来评估细胞生长。

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细胞系和培养[1]
SW620结肠癌、A2780卵巢癌、HCC1937、Hs578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436和T47D乳腺癌症细胞系从ATCC或ECACC库获得。所有细胞系均在添加了10%v/v FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中单层生长。

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细胞系细胞毒性试验[1]
KU-0059436对癌症细胞系的细胞存活的影响通过使用克隆发生测定来测定，如前所述。简而言之，将细胞接种在六孔板中，并放置过夜。将载体对照（DMSO）或浓度增加的KU-0059436（高达4μM）加入细胞中，根据细胞类型，将混合物放置7-14天，然后计数存活的菌落。通过XL-FIT 4软件计算三个重复孔的数据，即细胞存活率相对于载体对照±SE和IC50的平均百分比。

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47/奥拉帕尼增强MMS细胞毒性通过使用硫罗丹明B细胞生长试验确定[1]
将SW620细胞接种在96孔板中，并放置过夜。在添加浓度递增的MMS之前，细胞与载体对照（DMSO）或单一浓度的KU-0059436（1、3、10、30、100或300 nM）预孵育1小时。细胞在每种药物组合存在下孵育4天，然后通过SRB测定定量细胞生长。从三个重复孔计算数据，作为相对于仅KU-0059436孔的细胞生长平均百分比，并使用XL-FIT 4软件计算±SE和IC50。当仅以低于300 nM的浓度使用KU-0059436时，SW620细胞显示出<24%的生长抑制（>76%的细胞生长）（数据未显示）。

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实验设计：我们建立并彻底表征了一组来自独立BRCA2缺陷小鼠乳腺肿瘤和BRCA2精通控制肿瘤的克隆细胞系。随后，我们评估了这些细胞系对传统细胞毒性药物和新型PARP抑制剂AZD2281的敏感性。最后，进行了体外联合研究，以研究/OlaparibAZD2281和顺铂之间的相互作用。[2]

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CD40L/IL-4[4]
诱导原代CLL细胞增殖 从外周血获得的原代CLL白血病细胞通常在细胞周期的间隙1/间隙0（G1/G0）处停滞。为了刺激和维持这些细胞的增殖，我们比较了5种不同的促有丝分裂刺激（见图3），发现CD40L/IL-4培养系统是最有效和可重复的。简而言之，在以3×105个细胞/孔的剂量照射（50 Gy）表达CD40L的小鼠成纤维细胞后，将1-1.5×106个原代CLL细胞与10 ng/mL IL-4接种到每个孔中，总体积为2 mL RPMI，含有10%胎牛血清，并在37°C下孵育3-4天。此时，启动了存活检测。由于溴脱氧尿苷（BrdU）染色显示CLL增殖在培养中只能持续7-11天（补充图3），因此开始循环3-4天的原代CLL细胞然后用0-10µM的Olaparib再处理7天。因此，为了保持一致性，在所有存活试验中，所有细胞类型仅暴露于奥拉帕尼7天。

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细胞存活试验[4]
在三次重复实验中，将淋巴细胞悬浮液暴露于浓度越来越高的Olaparib中长达7天，并使用血细胞计数器计数3次；然后计算存活分数。在使用单剂量奥拉帕尼的实验中，无论细胞类型如何，都使用3µM，因为这在曲线的第二部分产生了超出初始急剧减少的存活反应，并确保了正常和ATM缺陷细胞之间的最大差异。它还反映了临床上可达到的最大剂量，使该剂量的细胞效应在临床上具有重要意义。

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联合奥拉帕尼/细胞毒性治疗[4]
以1×105个细胞/mL的浓度在200µL的体积中接种三份Granta-519细胞，用Olaparib（剂量范围0-10µM）预处理2天。随后，将递增剂量的4-羟基环磷酰胺（4HC；0-0.25µM；NIOMECH）、氟达拉滨（0-0.5µM）、丙戊酸（VPA；0-10mM）、苯达莫司汀（0-12.5µM）和IR（0-5 Gy）加入含奥拉帕尼的培养物中，再持续5天。这一时间框架使奥拉帕尼治疗的持续时间（共7天）保持一致，并在计算细胞存活率之前，为常规药物的细胞毒性作用提供了足够的时间。根据制造商的说明，使用CellTiter Glo发光细胞存活率测定法测量细胞存活率。使用Wallac Victor2 1420多标签计数器对发光进行定量。使用Windows软件的Calcusyn 2.1版确定协同作用。

小鼠：将肿瘤体积为 220-250 mm³ 的小鼠随机分为四组（n = 5）：载体对照组（每日灌胃给予 10% DMSO/10% 2-羟丙基-β-环糊精溶液，连续 5 天）、奥拉帕尼组（每日灌胃给予 50 mg/kg，连续 5 天）、10 Gy 分次放射治疗组（每日 2 Gy，连续 5 天）以及奥拉帕尼联合 10 Gy（5×2 Gy）分次放射治疗组（奥拉帕尼在每次 2 Gy 放射治疗前 30 分钟给予）。每日测量肿瘤体积，直至肿瘤体积达到 1000 mm³。对于每组肿瘤，计算每个肿瘤从治疗开始到体积增大至原来的四倍所需的天数（相对肿瘤体积×4；RTV4）。

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小鼠异种移植[1]
将标记小鼠右侧腹部皮下注射 0.1 mL PBS 溶液，每只小鼠含 5 × 10⁶ 个细胞。每周测量三次肿瘤大小，并使用公式 [长度/2] × [宽度2] 估算肿瘤体积。在异种移植化疗增效研究中，将每只动物体内已形成的肿瘤体积分别标准化至实验开始时的大小，并使用相对肿瘤体积 (RTV) 公式计算肿瘤体积相对于第 0 天体积的变化，RTV = TVx/TV0，其中 TVx 为任意一天的肿瘤体积，TV0 为给药开始时（即第 0 天）的肿瘤体积。在肿瘤生长曲线中，平均值代表治疗组中所有动物的平均值；低于此阈值，我们停止绘制曲线。

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给药方案[1]
当平均肿瘤体积达到100 mm3时，荷瘤小鼠被随机分为治疗组，每组8只动物，连续5天每日口服给药一次（po，qd，×5）；对于联合治疗，PARP抑制剂在TMZ给药前45分钟给药。化合物47/奥拉帕尼配制成溶液，TMZ配制成玉米油均质混悬液；两种给药溶液均每日新鲜配制。未治疗组的小鼠按mg/kg剂量接受两种赋形剂。在给药阶段，每天称量小鼠体重，以准确计算当日剂量和任何体重减轻的迹象（体重减轻20%将导致动物安乐死）。仅当各治疗组动物数量达到上限时（即，载体组和47单药治疗组为第13天，替莫唑胺组和联合用药组为第45天），才对数据进行统计分析。根据Jonckheere-Terpstra趋势检验，我们得出结论：在第45天，与单独使用替莫唑胺（50 mg/kg）相比，47（10 mg/kg，数据仅显示在图3中）与替莫唑胺（50 mg/kg）联合使用时，其剂量增加具有统计学意义（p < 0.0001）。采用 Wilcoxon 秩和检验证实了这一点，该检验比较了联合治疗组与单独使用替莫唑胺（TMZ）的治疗组，结果表明，在第 45 天，TMZ 单药治疗与 TMZ 联合 47（10 mg/kg）治疗之间存在统计学意义上的显著差异（p = 0.007）。

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药代动力学[1]
我们对小鼠、大鼠和犬进行了药代动力学测定。所有化合物均以单次给药的方式给药，途径为静脉注射（iv）或口服（po；剂量水平见表 6 和表 7）。静脉注射研究中，化合物配制成 10% DMSO/10% 环糊精的 PBS 溶液。口服研究中，除化合物 47 外，其他化合物也主要配制成 10% DMSO/10% 环糊精的 PBS 溶液；化合物 47 在犬的口服给药中采用甲基纤维素/PBS 混悬液。

吸收、分布和排泄
口服后，奥拉帕尼迅速吸收。单次服用 300 mg 奥拉帕尼后，平均（CV%）Cmax 为 5.4 μg/mL (32%)，AUC 为 39.2 μg·h/mL (44%)。每日两次服用 300 mg 后，稳态 Cmax 和 AUC 分别为 7.6 μg/mL (35%) 和 49.2 μg·h/mL (44%)。Tmax 为 1.5 小时。高脂肪、高热量膳食可能会延迟 Tmax，但不会显著改变奥拉帕尼的吸收程度。
单次服用放射性标记的奥拉帕尼后，在 7 天的收集期内回收了 86% 的给药放射性，主要以代谢物的形式存在。
约44%的药物经尿液排出，42%的剂量经粪便排出。女性患者口服放射性标记的奥拉帕尼后，尿液和粪便中放射性物质的15%和6%为原形药物。
单次口服300 mg奥拉帕尼后，其平均（±标准差）表观分布容积为158 ± 136 L。
癌症患者单次口服后，平均表观血浆清除率为4.55 L/h。

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代谢/代谢物
奥拉帕尼在体外经细胞色素P450 (CYP) 3A4/5代谢。女性患者口服放射性标记的奥拉帕尼后，血浆中循环放射性物质的70%为原形奥拉帕尼。奥拉帕尼会发生氧化反应以及随后的葡萄糖醛酸苷或硫酸盐结合反应。在人体内，奥拉帕尼还会发生水解、羟基化和脱氢反应。虽然在血浆、尿液和粪便中检测到了多达37种奥拉帕尼代谢物，但大多数代谢物占总给药剂量的比例不到1%，且尚未被完全表征。主要的循环代谢物是一种开环哌嗪-3-醇部分和两种单加氧代谢物。这些代谢物的药效学活性尚不清楚。

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生物半衰期
癌症患者单次口服给药后，平均终末半衰期为6.10小时。

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药代动力学特征[1]
为了确定化合物46或47/奥拉帕尼中是否有一种具有合适的药代动力学特征，足以作为口服生物利用度高的候选药物用于临床，我们首先评估了这两种化合物在大鼠体内的口服生物利用度和药代动力学稳定性（表7）。尽管这些化合物结构相似，且在大鼠静脉注射药代动力学参数方面也表现出非常相似的特征，但环丙基化合物47/奥拉帕尼的口服暴露量显著高于化合物46，这与小鼠数据相符。因此，化合物47被推进到犬体内进行进一步的药代动力学分析。表7重点列出了化合物47在犬体内以甲基纤维素为载体，静脉注射2.5 mg/kg和口服10 mg/kg给药后的药代动力学特征。数据显示，该化合物保持了与大鼠相似的优异生物利用度，但相对清除率较低，相当于约16%的肝血流量（大鼠为68%）。因此，该药代动力学特征表明，PARP抑制剂在该物种体内至少4小时内可维持治疗相关的浓度。环丙酰胺类似物47具有良好的暴露量以及效力和理化性质，因此该化合物被推进至细胞效力和体内疗效的进一步分析，以确定其是否为潜在的临床候选药物。

肝毒性
在奥拉帕尼的大型临床试验中，常规肝功能检查异常并不常见，血清转氨酶升高仅见于4%的患者，而超过正常值上限（ULN）5倍的患者仅见于1%或更少。在奥拉帕尼治疗各种晚期实体瘤患者的试验中，未见出现伴有黄疸的肝炎或肝功能衰竭的报告。自奥拉帕尼获批并广泛应用以来，尚未有已发表的临床上明显的肝损伤病例报告。
可能性评分：E（不太可能是临床上明显的肝损伤的原因）。

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妊娠和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于奥拉帕尼在哺乳期临床应用的信息。由于奥拉帕尼与血浆蛋白的结合率为82%，因此其在乳汁中的含量可能很低。制造商建议在奥拉帕尼治疗期间以及末次给药后一个月内停止母乳喂养。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白质结合
奥拉帕尼的蛋白质结合率在体外约为 82%。在纯化蛋白质溶液中，奥拉帕尼与白蛋白的结合率约为 56%，与 α-1 酸性糖蛋白的结合率为 29%。

[1]. J Med Chem . 2008 Oct 23;51(20):6581-91.

[2]. Clin Cancer Res . 2008 Jun 15;14(12):3916-25.

[3]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2008 Nov 4;105(44):17079-84.

[3]. Blood . 2010 Nov 25;116(22):4578-87.

奥拉帕尼是一种N-酰基哌嗪类化合物，由2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸的羧基与N-(环丙基羰基)哌嗪的游离氨基缩合而成；用于治疗晚期卵巢癌。它具有抗肿瘤活性，是EC 2.4.2.30（NAD(+) ADP-核糖基转移酶）抑制剂和细胞凋亡诱导剂。它属于N-酰基哌嗪类、环丙烷类、单氟苯类和酞嗪类化合物。
奥拉帕尼是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）1和PARP2的选择性强效抑制剂。 PARP抑制剂是一类新型抗癌疗法，其作用机制是利用携带BRCA突变的癌细胞DNA修复缺陷诱导细胞死亡。奥拉帕尼用于治疗多种BRCA相关肿瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。它于2014年12月首次获得美国FDA和欧盟批准，并于2016年4月获得加拿大卫生部批准。
奥拉帕尼是一种聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂。其作用机制是作为聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂。
奥拉帕尼是一种小分子聚ADP-核糖聚合酶抑制剂，用于治疗难治性和晚期卵巢癌。奥拉帕尼治疗期间血清转氨酶短暂升高的发生率较低，且未发现与临床上明显的肝损伤病例相关。
奥拉帕尼是一种小分子核酶聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂，具有潜在的化疗增敏、放疗增敏和抗肿瘤活性。奥拉帕尼选择性地结合并抑制PARP，从而抑制PARP介导的单链DNA断裂修复；PARP抑制可能增强DNA损伤药物的细胞毒性，并可能逆转肿瘤细胞的化疗耐药性和放疗耐药性。 PARP 催化核蛋白的翻译后 ADP 核糖基化，并可被单链 DNA 断裂激活。

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药物适应症
卵巢癌 奥拉帕尼适用于对一线铂类化疗有完全或部分缓解的、携带致病性或疑似致病性生殖系或体细胞 BRCA 突变的晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者的维持治疗。奥拉帕尼联合贝伐珠单抗适用于对一线铂类化疗有完全或部分缓解的、且癌症与同源重组缺陷 (HRD) 阳性状态相关的晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者的维持治疗，HRD 阳性状态定义为：致病性或疑似致病性 BRCA 突变和/或基因组不稳定性。奥拉帕尼适用于对铂类化疗有完全或部分缓解的复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者的维持治疗。乳腺癌 奥拉帕尼适用于接受过新辅助或辅助化疗的、携带致病性或疑似致病性g_BRCA_m突变、人表皮生长因子受体2 (HER2) 阴性的高危早期乳腺癌成年患者的辅助治疗。奥拉帕尼适用于接受过新辅助、辅助或转移性化疗的、携带致病性或疑似致病性g_BRCA_m突变、HER2阴性的转移性乳腺癌成年患者的治疗。激素受体 (HR) 阳性乳腺癌患者应已接受过内分泌治疗或被认为不适合接受内分泌治疗。 胰腺癌 奥拉帕尼适用于接受至少16周一线铂类化疗方案治疗后病情未进展的、携带致病性或疑似致病性gBRCAm突变的转移性胰腺腺癌成年患者的维持治疗。前列腺癌 奥拉帕尼适用于接受过激素类药物（如恩扎卢胺或阿比特龙）治疗后病情进展的、携带致病性或疑似致病性生殖系或体细胞同源重组修复（HRR）基因突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）成年患者的治疗。本品还可与阿比特龙和泼尼松或泼尼松龙联合用于治疗携带致病性或疑似致病性 BRCA 突变 (BRCAm) 的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 成年患者。
卵巢癌 Lynparza 可作为单药疗法用于：一线铂类化疗后有完全或部分缓解的晚期（FIGO III 期和 IV 期）BRCA1/2 突变（生殖系和/或体细胞突变）高级别上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者的维持治疗；对铂类化疗有完全或部分缓解的铂敏感复发性高级别上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者的维持治疗。 Lynparza 与贝伐单抗联合用于：对接受一线铂类化疗联合贝伐单抗治疗后达到缓解（完全或部分缓解）的晚期（FIGO III 期和 IV 期）高级别上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者进行维持治疗，这些患者的癌症与同源重组缺陷（HRD）阳性状态相关，HRD 阳性状态由 BRCA1/2 突变和/或基因组不稳定性定义（参见第 5.1 节）。乳腺癌 Lynparza 的适应症包括：单药治疗或与内分泌治疗联合用于辅助治疗携带生殖系 BRCA1/2 突变且既往接受过新辅助或辅助化疗的 HER2 阴性、高危早期乳腺癌成年患者（参见第 4.2 节和第 5.1 节）。用于治疗携带生殖系 BRCA1/2 突变且 HER2 阴性的局部晚期或转移性乳腺癌成人患者的单药治疗。患者既往应接受过蒽环类药物和紫杉烷类药物的（新）辅助或转移性治疗，除非患者不适合接受这些治疗（参见第 5.1 节）。激素受体 (HR) 阳性乳腺癌患者还应在既往内分泌治疗期间或之后出现疾病进展，或被认为不适合接受内分泌治疗。胰腺腺癌：Lynparza 的适应症为：用于治疗携带生殖系 BRCA1/2 突变且患有转移性胰腺腺癌的成人患者的单药维持治疗，这些患者在接受一线化疗方案中至少 16 周的铂类药物治疗后未出现疾病进展。 Lynparza 适用于前列腺癌：单药治疗既往接受过包括新型激素药物在内的治疗后病情进展的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 成人患者，且该患者携带 BRCA1/2 突变（种系和/或体细胞突变）。与阿比特龙和泼尼松或泼尼松龙联合治疗不适合化疗的 mCRPC 成人患者（参见 5.1 节）。
治疗所有恶性肿瘤（中枢神经系统肿瘤、造血和淋巴组织肿瘤除外）。

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作用机制
聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 是一类多功能酶，包含 17 个成员。它们参与重要的细胞功能，例如 DNA 转录和 DNA 修复。 PARPs能够识别并修复细胞DNA损伤，例如单链断裂（SSB）和双链断裂（DSB）。不同的DNA修复途径可以修复这些DNA损伤，包括用于修复SSB的碱基切除修复（BER）途径和用于修复DSB的BRCA依赖性同源重组。奥拉帕尼是一种PARP抑制剂：虽然它作用于PARP1、PARP2和PARP3，但奥拉帕尼是一种更具选择性的竞争性抑制剂，可抑制PARP1和PARP2催化位点的NAD⁺。奥拉帕尼对BER途径的抑制会导致未修复的SSB积累，进而形成DSB，而DSB是最具毒性的DNA损伤形式。虽然BRCA依赖性同源重组可以修复正常细胞中的DSB，但这种修复途径在携带BRCA1/2突变的细胞（例如某些肿瘤细胞）中存在缺陷。在携带 BRCA 突变的癌细胞中抑制 PARP 会导致基因组不稳定和细胞凋亡。这种最终结果也被称为合成致死性，指的是两种缺陷——PARP 活性抑制和同源重组 (HR) 介导的 DNA 双链断裂 (DSB) 修复丧失——单独存在时无害，但组合起来却会导致有害后果。体外研究表明，奥拉帕尼诱导的细胞毒性可能涉及 PARP 酶活性的抑制和 PARP-DNA 复合物形成增加，从而导致 DNA 损伤和癌细胞死亡。聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 的激活是细胞对代谢、化学或电离辐射诱导的 DNA 损伤的即时反应，代表了一种新的癌症治疗靶点。本文报道了一系列新型取代的 4-苄基-2H-酞嗪-1-酮类化合物，它们对 PARP-1 和 PARP-2 均具有很高的酶抑制活性和细胞抑制活性。该系列优化化合物还表现出良好的药代动力学特征、口服生物利用度和在SW620结直肠癌异种移植模型中的体内活性。4-[3-(4-环丙烷羰基哌嗪-1-羰基)-4-氟苄基]-2H-酞嗪-1-酮（KU-0059436，AZD2281）47 是一种纳摩尔级PARP-1和PARP-2抑制剂，对BRCA1缺陷型乳腺癌细胞系具有独立的抑制活性。化合物 47 目前正处于治疗 BRCA1 和 BRCA2 缺陷型癌症的临床开发阶段。[1]

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共济失调毛细血管扩张症突变基因 (ATM) 在慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、T 前淋巴细胞白血病 (T-PLL) 和套细胞淋巴瘤 (MCL) 等淋巴系统恶性肿瘤中经常失活，并且与对烷化剂和嘌呤类似物的凋亡反应缺陷有关。ATM 突变细胞表现出 DNA 双链断裂修复受损。抑制聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 可使 DNA 双链断裂修复成为必需，从而选择性地增强 ATM 缺陷型肿瘤细胞对杀伤的敏感性。我们研究了5株ATM突变淋巴母细胞系（LCL）、1株ATM突变MCL细胞系、1株ATM敲低PGA CLL细胞系以及9株诱导增殖的ATM缺陷型原发性CLL细胞对聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂奥拉帕尼（AZD2281）的体外敏感性，并观察到其与ATM野生型对应细胞相比的差异性杀伤作用。ATM的药理学抑制和ATM敲低证实了该效应依赖于ATM，并通过有丝分裂灾难介导，且与细胞凋亡无关。在ATM突变MCL细胞系的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠异种移植模型中，体内奥拉帕尼治疗显著降低了肿瘤负荷并延长了动物的生存期。添加奥拉帕尼可增强ATM缺失型肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性。我们认为奥拉帕尼可能是治疗难治性ATM突变型淋巴瘤的合适药物。[4]

C24H23FN4O3

434.46

434.175

C, 66.35; H, 5.34; F, 4.37; N, 12.90; O, 11.05

763113-22-0

23725625

White solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.702

1.9

86.37

1

5

4

32

790

0

FC1C([H])=C([H])C(C([H])([H])C2C3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C3C(N([H])N=2)=O)=C([H])C=1C(N1C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C1([H])[H])C(C1([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O)=O

FDLYAMZZIXQODN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H23FN4O3/c25-20-8-5-15(14-21-17-3-1-2-4-18(17)22(30)27-26-21)13-19(20)24(32)29-11-9-28(10-12-29)23(31)16-6-7-16/h1-5,8,13,16H,6-7,9-12,14H2,(H,27,30)

4-[[3-[4-(cyclopropanecarbonyl)piperazine-1-carbonyl]-4-fluorophenyl]methyl]-2H-phthalazin-1-one

AZD2281; Ku-0059436; AZD2281; 763113-22-0; Lynparza; KU-0059,436; 1-(Cyclopropylcarbonyl)-4-[5-[(3,4-dihydro-4-oxo-1-phthalazinyl)methyl]-2-fluorobenzoyl]piperazine; AZD-2281; AZD 2281; KU59436; KU-59436; KU 59436; KU0059436; KU-0059436; KU 0059436; Olaparib; trade name Lynparza

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 10 mg/mL (23.02 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 100.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (11.51 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (11.51 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMF 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMF 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMF 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。

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配方 8 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，要配制1 mL工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混匀。

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配方 9 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.15 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 10 中的溶解度: 20 mg/mL (46.03 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。