Orexin 2 Receptor Agonist

OX₂ Receptor

体外活性：Orexin 2 Receptor Agonist 是一种有效的选择性 Orexin2 受体激动剂，对 OX2R 的 EC50 为 0.023 μM；它是 OX2R 选择性的（OX1R/OX2R EC50 比率为 70）。食欲素是调节睡眠/觉醒的神经肽家族，作用于两种 G 蛋白偶联受体：食欲素受体 1 (OX1R) 和 2 (OX2R)。遗传和药理学证据表明，食欲素受体激动剂，尤其是 OX2R 激动剂，将可用于睡眠障碍发作性睡病/猝倒症的机械治疗。我们在此报告发现了一种有效的（OX2R 上的 EC50 为 0.023 μM）和 OX2R 选择性（OX1R/OX2R EC50 比率为 70）激动剂，4-甲氧基-N,N-二甲基-3-[N-(3-{ [2-(3-甲基苯甲酰胺基)乙基]氨基}苯基)氨磺酰基]-(1,1-联苯)-3-甲酰胺 26. 激酶测定：Orexin 2 Receptor Agonist 是一种有效的选择性 Orexin2 受体激动剂，EC50 为 0.023 μM在 OX2R 上；它是 OX2R 选择性的（OX1R/OX2R EC50 比率为 70）。食欲素是调节睡眠/觉醒的神经肽家族，作用于两种 G 蛋白偶联受体：食欲素受体 1 (OX1R) 和 2 (OX2R)。细胞测定：食欲素是调节睡眠/觉醒的神经肽家族，作用于两种 G 蛋白偶联受体：食欲素受体 1 (OX1R) 和 2 (OX2R)。遗传和药理学证据表明，食欲素受体激动剂，尤其是 OX2R 激动剂，将可用于睡眠障碍发作性睡病/猝倒症的机械治疗。我们在此报告发现了一种有效的（OX2R 上的 EC50 为 0.023 μM）和 OX2R 选择性（OX1R/OX2R EC50 比率为 70）激动剂，4'-甲氧基-N,N-二甲基-3'-[N-(3 -{[2-(3-甲基苯甲酰胺基)乙基]氨基}苯基)氨磺酰基]-(1,1'-联苯)-3-甲酰胺 26/Orexin 2 Receptor Agonist . 最近，与双食欲素受体拮抗剂suvorexant结合的人OX2R的X射线晶体结构在2.5Å处得到了解决。通过使用这种X射线结构，通过分子对接计算检查了Orexin 2 Receptor Agonist /食欲素2受体激动剂/26与OX2R的结合模式（见支持信息）。由此产生的食欲素2受体激动剂/26的结合模式（图3）表明，食欲素2接收器激动剂/26上的二甲基氨基甲酰基位于OX2R配体结合位点的深处，其羰基与N324（跨脑螺旋5，TM5）形成氢键。化合物26还使用乙二胺部分的氮原子与C210（TM3）的主链羰基形成额外的氢键。26的联苯基位于由V138（TM3）、F227（TM5）、Y317（TM6）、I320（TMA6）和V353（TM7）组成的疏水口袋中，以进行疏水相互作用。磺酰酰胺基团26与OX2R的T111（TM2）、H350（TM7）和Y354（TM7。有趣的是，26分别将磺酰酰胺基团的两个氧导向T111（TM2）和Y354（TM7）的羟基以及H350（TM7”）的咪唑环。26的磺酰酰胺基团可以在与受体活化相关的结构变化中形成氢键。这可以解释羧酰胺衍生物29是无活性的，因为羧酰胺和磺酰酰胺基团之间的氧方向不同。OX2R的T111（TM2）在OX1R中突变为Ser。这种突变可能与表2中化合物对OX2R的高选择性有关。26的中间和末端部分中的苯基团还与V114（TM2）、W120（ECL1）和I130（TM3）以及Y343（TM7）和F346（TM7。化合物26的B环邻域如图3所示。这也可以解释，在3-位具有取代基的化合物23、26和28具有强大的活性，因为我们可以在3-位方向上看到很大的空间来容纳取代基。图4比较了suvorexant和26与OX2R的结合模式。如文献所述，suvorexan采用π堆叠的马蹄形构象，将其七元环导向OX2R的TM5和TM6。这种结合模式被认为是suvorexantOX2R拮抗剂活性的原因，因为七元环似乎抑制了TM5和TMI相对于TM束其余部分的向内运动，这可能是GPCR激活的一般触发因素。相比之下，26以延伸的构象结合OX2R，我们检测到26与OX2R的TM5和TM6之间存在一些空间容差。因此，我们可以认为26与OX1R的结合可能会诱导TM5和TMI的向内运动，这将使26具有OX2R激动剂活性。[1]

食欲素受体 1 (OX1R) 和 2 (OX2R) 是两种 G 蛋白偶联受体，是控制睡眠和觉醒的食欲素神经肽家族的靶标。根据遗传和药理学证据，睡眠障碍发作性睡病/猝倒症的机械治疗可能受益于食欲素受体激动剂，特别是 OX2R 激动剂的使用。本文报道了 4'-甲氧基-N,N-二甲基-3'-[N-(3-{[2-(3-甲基苯甲酰氨基)乙基]氨基}苯基)氨磺酰]的发现，作为一种有效的（OX2R 上的 EC50）为 0.023 μM）和 OX2R 选择性（OX1R/OX2R EC50 比率为 70）激动剂。 -(联苯-1,1′)26-甲酰胺-3。

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在表2中，最强的化合物是3-甲基衍生物26/食欲素2受体激动剂。同时，对OX2R最具选择性的化合物是3-甲氧基衍生物23。然而，表2中的化合物11和22-28几乎不溶于水，这导致难以确认体内活性，尽管每种化合物在体外都显示出令人满意的活性和效力。因此，我们在B环上引入了2-二甲氨基，得到了更具极性的衍生物30（图5），然后将30转化为二盐酸盐31（食欲素2受体激动剂类似物），可以在1.3 M下溶解在生理盐水中。为了评估31的体内药理作用，我们在光照期将其注入侧脑室，并通过记录C57BL/6J小鼠的脑电图/肌电图来观察其对睡眠/觉醒状态的影响。31以剂量依赖的方式促进觉醒（图6）。260nmol的31将清醒时间增加到53分钟，与3.0nmol的食欲素a（58分钟）报告的程度相似。相比之下，31并没有增加OX1R/OX2R双敲除（DKO）小鼠的清醒度，这表明31的作用需要食欲素受体。31的腹腔注射也产生了类似的效果[1]。

体外结合试验[1]
根据文献对与人OX1R或OX2R的结合亲和力进行了评估。在含有25 mM Hepes/NaOH（pH 7.4）、0.5 mM EDTA、2.5 mM CaCl2和2.5 mM MgCl2（OX1R）或25 mM Heps/NaOH（pH 7.4，2.5 mM CaCl_2）、2.5 mM Ca2、1 mM MgCl2和0.5%BSA（OX2R）的缓冲液中，在不存在或存在测试化合物的情况下，将表达人OX1R的CHO-K1细胞或表达人OX2R的HEK-293细胞（20µg蛋白质）的细胞膜匀浆在22°C下与0.1 nM[125I]食欲素-A一起孵育60分钟。在1µM SB-334867（OX1R）或食欲素-B（OX2R）存在的情况下测定非特异性结合。孵育后，在真空下通过用0.3%PEI预浸的玻璃纤维过滤器 快速过滤样品，并使用96个样品细胞采集器 用含有50 mM Tris-HCl和150 mM NaCl（OX1R）或50 mM Tris-HaCl（OX2R）的冰冷缓冲液冲洗数次。将过滤器干燥，然后使用闪烁鸡尾酒 在闪烁计数器中计数放射性。结果表示为对照放射性配体特异性结合的抑制百分比。标准参考化合物是食欲素-A（OX1R）或食欲素-B（OX2R），在每个实验中以几种浓度进行测试，以获得竞争曲线。

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26/食欲素2受体激动剂与OX2R结合模式的建模[1]
所有计算均使用薛定谔套件2013-2进行。首先使用LigPrep2.7程序将26/食欲素2受体激动剂的2D结构转换为3D结构。使用Epik2.5程序预测了26的质子化状态4。然后，使用ConfGen2.5程序5进行构象搜索，并将得到的构象用于以下对接计算。OX2R与suvorexant（PDB ID:4S0V）复合物的X射线结构被用作对接受体6。该结构是使用Maestro9.5中的蛋白质制备向导制备的。使用Prime3.3程序7补偿了侧链的缺失原子。最后，使用力场OPLS 2005将结构最小化。在对接计算之前，我们去除了H2O分子，但位于OX2R配体结合位点的HOH4021和HOH4025除外。由于HOH4021/HOH4025分别在OX2R的N324和R328侧链之间以及OX2R的H350和suvorexant之间形成水介导的氢键网络，这些水分子似乎对配体结合位点或配体识别的结构稳定性很重要。26与OX2R的对接计算是使用薛定谔套件2013-28中实现的IFD 2006协议进行的。“受体网格生成”方案的盒中心设置为suvorexant与OX2R结合的质心。初始滑翔对接使用蛋白质和配体的范德华半径标度为0.8进行，每个构象的最大姿势数设置为2。Prime用于精炼配体位置5.0Å以内的残基。在Glide中使用标准设置进行重新对接。根据IFDScore对生成的姿势进行排名，以选择前10%的对接复合体。然后使用Prime程序通过分子力学广义玻恩表面积（MM-GBSA）方法估算这些配合物（Gcomplex）的自由能，我们最终选择了Gcomplex最低的对接配合物作为相互作用模型。为了测试我们的程序，我们将其应用于suvorexant-OX2R复合物。结果如图1所示。由此产生的模型，即排名第一的姿势，再现了suvorexant和OX2R之间的所有相互作用，以及通过HOH4025在晶体结构中观察到的水介导的氢键。位置和构象均方根偏差（RMSD）分别为1.30和0.99Å。这些结果表明，我们的程序适用于建立26和OX2R之间可靠的相互作用模型。

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Orexin 2 Receptor Agonist 是一种有效且特异性的 Orexin2 受体激动剂，对 OX2R 的 EC50 为 0.023 μM。它仅对 OX2R 有选择性（OX1R 和 OX2R 之间的 EC50 比率为 70）。食欲素受体 1 (OX1R) 和 2 (OX2R) 是两种 G 蛋白偶联受体，是控制睡眠和觉醒的食欲素神经肽家族的靶标。

细胞系和细胞培养[1]
根据制造商的建议，使用FuGENE 6转染48小时后，收获逆转录病毒液。为了产生表达受体的细胞，用逆转录病毒上清液感染CHO（中国仓鼠卵巢）K1细胞。感染后24小时，用10µg/mL的嘌呤霉素选择感染细胞。为了产生稳定的指示细胞系，使用FuGENE 6将NFAT反应萤光素酶报告质粒（pNFAT TA-Luc）与携带抗生素抗性基因的pSV2neo一起转染组成型受体表达的CHO-K1细胞系。24小时后，用1mg/mL G418选择转染的细胞。将G418抗性细胞接种在含有5%胎牛血清、1种非必需氨基酸、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素、10µg/mL嘌呤霉素、1 mg/mL G418的Dulbecco改良Eagle培养基中，分离出一个克隆。生成了与人OX1R或OX2R cDNA和NFAT反应荧光素酶报告基因共转染的细胞系。这些细胞系保持在上述培养基中。

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钙动员试验[1]
将稳定表达人OX1R（CHOOX1R）或OX2R（CHOOX2R）的CHO-K1细胞接种在96孔板（10000个细胞/孔）中，在37°C下与5%FBS/DMEM一起孵育48小时。然后，在Hanks平衡盐溶液（HBSS:GIBCO）中用5µM荧光钙指示剂Fura 2-AM装载细胞，其中包括20 mM HEPES、2.5 mM Probenecid、5%CremophorEL和0.1%BSA，在37℃下孵育1小时。洗涤细胞一次，加入75µL HBSS缓冲液。然后，用25µL不同浓度的受试化合物或食欲素A（OXA：稀释于PBS/0.1%BSA中）处理细胞。FDSS 3000系统监测了施用受试化合物或OXA后细胞内Ca2+浓度的增加。通过Graph Pad Prism 5J（MDF）计算每种化合物的EC50值

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萤光素酶测定[1]
将CHOOX1R或CHOOX2R细胞（10000个细胞/孔）接种在96孔板中，并生长至融合24小时。用指定的测试化合物或OXA处理细胞。OXA（在PBS/0.1%BSA中稀释）用作阳性对照。六小时后，通过抽吸去除培养基。将细胞单层溶解在50µL Steay Glo萤光素酶试剂中，通过ARVO x5测定萤光素酶活性。将Steady-Glo试剂在25 mM Tris（pH 7.5）/10%甘油/1%曲拉通X-100作为工作溶液中稀释10倍。

体内实验[1]
实验小鼠单独饲养，光照周期为12小时光照：12小时黑暗，环境温度为23 ± 1 °C，并处于无特定病原体（SPF）条件下。8至12周龄的雄性C57BL/6J小鼠先用4%异氟烷麻醉，再用2%异氟烷维持麻醉，然后通过手术将引导套管置入左侧脑室，用于脑室内（ICV）给药，同时植入脑电图/肌电图（EEG/EMG）电极。两个EEG电极植入于右半球坐标处，两个EMG电极植入于两侧斜方肌。所有小鼠术后恢复至少1周，并在实验前适应记录线1周。适应环境后，记录小鼠脑电图/肌电图基线1天。次日ZT6时，在异氟烷短暂麻醉下，通过插管使用注射泵和油浸注射器进行脑室内（ICV）给药。每只小鼠注射5.0 µL，注射时间为10分钟。给药后立即将小鼠放回笼中，并记录脑电图/肌电图。生理盐水给药后，每隔一天分别给予小鼠32、130和260 nmol的化合物31（水溶性食欲素2受体激动剂类似物）。使用定制的半自动软件分析脑电图/肌电图信号。脑室内给药后，我们评估了小鼠2小时的清醒时间。所有数值均以均值±标准误（SEM）表示。在野生型小鼠中，数据采用重复测量单因素方差分析（ANOVA）进行分析，然后使用Bonferroni检验比较各组之间的差异。当 P <0.05、P <0.001 时，差异被认为具有统计学意义。在 OX1R/OX2R DKO 小鼠中，采用配对 t 检验分析数据。

几乎不溶于水[1]

[1]. Design and Synthesis of Non-Peptide, Selective Orexin Receptor 2 Agonists. J Med Chem. 2015 Oct 22;58(20):7931-7.

研究人员重点关注先导化合物 1 的磺酰胺基团，并合成了 1000 多种化合物。利用 NFAT-荧光素酶报告基因检测和钙离子内流检测，对这些化合物在表达人食欲素受体的 CHO 细胞系中进行了活性测试。我们发现了第一个先导化合物 5，随后着重研究了 5 中 A 环和 B 环的转化。最终，我们发现了第一个高效且选择性的 OX2R 激动剂 26/食欲素 2 受体激动剂。将 26/食欲素 2 受体激动剂中的磺酰胺基团转化为羰基酰胺基团，并对所得化合物 29 进行评估，结果表明磺酰胺基团是 OX2R 激动活性最重要的结构特征之一。此外，我们还开发了二甲氨基衍生物 30 及其二盐酸盐，它们在生理盐水中的溶解度为 1.3 M。二盐酸盐的体内试验表明其具有明显的促醒作用。这些结果将有助于进一步设计 OXR 激动剂。[1]

C32H34N4O5S

586.70

586.224

C, 65.51; H, 5.84; N, 9.55; O, 13.63; S, 5.46

1796565-52-0

91810287

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.629

3.4

125

3

7

11

42

986

0

S(C1C(=CC=C(C2C=CC=C(C(N(C)C)=O)C=2)C=1)OC)(NC1C=CC=C(C=1)NCCNC(C1C=CC=C(C)C=1)=O)(=O)=O

RHLMXWCISNJNDH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C32H34N4O5S/c1-22-8-5-10-25(18-22)31(37)34-17-16-33-27-12-7-13-28(21-27)35-42(39,40)30-20-24(14-15-29(30)41-4)23-9-6-11-26(19-23)32(38)36(2)3/h5-15,18-21,33,35H,16-17H2,1-4H3,(H,34,37)

N-[2-[3-[[5-[3-(dimethylcarbamoyl)phenyl]-2-methoxyphenyl]sulfonylamino]anilino]ethyl]-3-methylbenzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。