Oridonin (NSC-250682)   中文名称: 冬凌草甲素

Akt1 (IC50 = 8.4 μM); Akt2 (IC50 = 8.9 μM)

Oridonin 是一种 ATP 竞争性 AKT 抑制剂，AKT1 和 AKT2 的 IC50 值分别为 8.4 和 8.9 M。通过靶向 AKT1/2，冬凌草甲素（5、10 或 20 μM）可明显阻止 ESCC 细胞 KYSE70、KYSE410 和 KYSE450 的生长。在 KYSE70、KYSE410 和 KYSE450 细胞中，冬凌草甲素（10 或 20 μM）导致 G2/M 期细胞周期停滞，20 μM 则诱导细胞凋亡。此外，顺铂或 5-FU 与冬凌草甲素（5、10 或 20 μM）的组合可增强对食管鳞状细胞癌 (ESCC) 细胞生长的抑制作用[1]。 AKT/mTOR 信号传导优先被冬凌草甲素（0.1 和 1 μM）抑制。此外，冬凌草甲素 (1 μM) 通过过度激活 AKT 信号传导选择性抑制乳腺癌细胞的生长[2]。

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在这项研究中，我们证明冬凌草甲素是AKT的抑制剂，在体外和体内抑制食管鳞状细胞癌（ESCC）的增殖。通过肿瘤微阵列的免疫组织化学分析、AKT敲除对细胞生长的影响以及用AKT抑制剂MK-2206治疗细胞，研究了AKT在ESCC中的作用。冬凌草甲素阻断AKT激酶活性，并与AKT的ATP结合袋相互作用。它以时间和浓度依赖的方式抑制KYSE70、KYSE410和KYSE450食管癌症细胞的生长。冬凌草甲素诱导细胞停滞在G2-M细胞周期期，刺激细胞凋亡，并增加凋亡生物标志物的表达，包括ESCC细胞系中切割的PARP、caspase-3、caspase-7和Bims。从机制上讲，我们发现冬凌草甲素减少了AKT信号的磷酸化和激活。此外，冬凌草甲素和5-氟尿嘧啶或顺铂（临床化疗药物）的组合增强了对ESCC细胞生长的抑制作用。[1]
AKT是冬凌草甲素的直接靶点。 冬凌草甲素通过靶向AKT1/2抑制ESCC细胞的增殖。 冬凌草甲素诱导ESCC细胞G2/M期阻滞和凋亡。 冬凌草甲素抑制AKT信号通路。 冬凌草甲素和顺铂或5-FU的组合可增强对ESCC细胞生长的抑制。[1]

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我们发现冬凌草提取物冬凌草甲素在最大程度上降低了细胞存活率。冬凌草甲素与AKT1结合，并可能作为ATP竞争性AKT抑制剂发挥作用。重要的是，冬凌草甲素通过PI3K/AKT信号的过度激活选择性地损害了人类乳腺癌症细胞的肿瘤生长。 冬凌草甲素优先抑制人乳腺上皮细胞中的AKT/mTOR信号传导。 冬凌草甲素通过过度激活AKT信号选择性抑制乳腺癌症细胞的生长[2]。

冬凌草甲素（160 mg/kg，口服）在携带 EG9 和 HEG18 肿瘤细胞的 SCID 小鼠中显示出肿瘤生长显着减少，但体重没有明显减轻。冬凌草甲素治疗还可减少小鼠中 Ki-67、磷酸化 AKT、GSK-3 或 mTOR 的表达量[1]。在裸鼠中，冬凌草甲素（15 mg/kg，腹腔注射）通过过度激活 AKT 信号传导抑制乳腺癌细胞生长[2]。

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冬凌草甲素抑制AKT高表达肿瘤体内PDX生长[1]
为了探索冬凌草甲素在体内的抗肿瘤活性，我们使用了两种PDX模型，EG9和HEG18，它们表现出AKT的高表达（图8，补充图6）。将PDX肿瘤块植入SCID小鼠体内，然后通过强饲注射给予载体或冬凌草甲素（40或160mg/kg体重），每天一次，持续40或52天。结果表明，与赋形剂治疗组相比，用160mg/kg冬凌草甲素治疗小鼠显著降低了肿瘤生长（图8A，C），对体重没有影响（图8B）。制备肿瘤组织进行IHC分析，并检测Ki-67、磷酸化AKT、GSK-3β或mTOR的表达（图8D，E）。结果表明，与赋形剂处理的对照组相比，冬凌草甲素处理显著抑制了所有这些蛋白质标志物（图8D，E）。EG9和HEG18的特性如补充图6E所示。

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冬凌草甲素通过体内AKT的过度激活损害乳腺肿瘤的生长[1]
为了测试冬凌草甲素是否会损害p-AKTHigh乳腺癌症细胞的体内生长，用冬凌草乙素或载体对照处理携带可触摸的MDAMB468或HCC1569异种移植物的NCr裸鼠。冬凌草甲素治疗后，MDAMB468和HCC1569异种移植物肿瘤模型均实现了持久的肿瘤消退（图5A和5D）。为了评估冬凌草甲素治疗期间MDAMB468和HCC1569异种移植物的信号传导和药效学反应，在给药后72小时分离肿瘤，并通过免疫组织化学染色分析分子标志物。冬凌草甲素降低了AKT底物PRAS40和AKT下游mTOR靶点的磷酸化（S6），阻断了增殖（通过Ki67指数评估），并诱导了凋亡（通过切割的胱天蛋白酶3评估）（图5B、5C、5E和5F）。这些结果表明，冬凌草甲素通过抑制AKT-mTOR信号通路抑制增殖和诱导凋亡，有效地损害了p-AKTHigh乳腺癌的肿瘤生长。

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冬凌草甲素通过阻断AKT-mTOR信号传导来预防携带PIK3CAH1047R的乳腺肿瘤的发生[1]
我们之前报道过，PIK3CAH1047R的表达可以启动诱导型MMTV-rtTA-tetO-PIK3CAH1047R（iPIK3CAH1047R）雌性小鼠乳腺上皮的转化。为了研究冬凌草甲素是否可以预防PIK3CAH1047R诱导的乳腺上皮细胞转化，我们将PIK3CAH1047R乳腺组织片段移植到3周龄NCr裸鼠的清除脂肪垫中。iPIK3CAH1047R乳腺上皮细胞中PIK3CAH1047R的表达与萤光素酶报告基因偶联，从而可以在体内追踪转基因表达。在移植后8周用强力霉素处理小鼠，诱导移植乳腺上皮细胞中PIK3CAH1047R的表达。小鼠同时接受冬凌草甲素、BEZ235或赋形剂对照治疗。多西环素处理诱导的移植iPIK3CAH1047R上皮中萤光素酶报告活性的增加被冬凌草甲素和BEZ235处理阻断（图6A）。组织学检查显示，在载体对照组中，乳腺导管侧支增加，局灶性结节结构增大，充满早期肿瘤病变特征的过度增殖细胞，而在用冬凌草甲素或BEZ235治疗的小鼠中观察到正常的乳腺上皮结构（图6B）。免疫组织化学分析显示，冬凌草甲素显著消除了AKT效应物磷酸化，并阻断了iPIK3CAH1047R乳腺外突的细胞增殖（图6C-6E）。这些结果证实，冬凌草甲素通过阻断AKT和下游mTOR信号传导来阻止细胞转化，以响应PIK3CAH1047R的诱导。

对于 AKT 激酶测定，使用 ADP-Glo™ 激酶测定试剂盒。将活性AKT1或AKT2激酶与非活性GSK-3β作为底物用1×反应缓冲液混合，然后添加到白色96孔板中。试剂盒中提供的纯 ATP 被连续稀释，得到 0、1、10、50 和 100 μM 的终浓度。 GSK-3β 用 DMSO 稀释，直至最终浓度达到 2.5、5、10 或 20 μM。使用 Luminoskan Ascent 读板器，将组合溶液在室温下孵育以测量荧光素酶活性的量。 [1]

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激酶测定[1]
AKT激酶测定使用非放射性IP激酶测定试剂盒进行。将20μl固定化抗体珠浆与200μl细胞裂解物（200μg）混合，并在4°C下轻轻摇晃过夜。在第2天洗涤两次后，将颗粒悬浮在50μl 1×激酶缓冲液中，该缓冲液补充了1μl 10mM ATP和1μg激酶底物。然后，将混合物在30°C下孵育30分钟，用25μl 3×SDS样品缓冲液终止反应。通过蛋白质印迹分析评估结合。对于AKT激酶测定，我们使用ADP-Glo™激酶测定试剂盒。。以活性AKT1或AKT2激酶和非活性GSK-3β为底物，用1x反应缓冲液混合，然后加入白色96孔板中。试剂盒中提供的纯ATP被连续稀释，最终浓度为0、1、10、50和100μM加入冬凌草甲素，使其终浓度达到2.5、5、10或20μM，并使用DMSO作为对照。将混合溶液在室温下孵育，并使用Luminoskan Ascent平板读数器测量萤光素酶活性。

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冬凌草甲素与AKT1结合的动力学分析[2]
在BIAcore 3000仪器上对冬凌草甲素与纯化的人重组AKT1蛋白的相互作用进行了表面等离子体共振（SPR）测量。使用胺偶联试剂盒将AKT1固定在14450RU的BIAcore传感器芯片上冬凌草甲素通过1 mg/mL的超声波处理溶解在1%的Pluronic F68洗涤剂中。实验中使用的运行缓冲液是HEPES/NaCl缓冲液，含有1%的Pluronic F68洗涤剂，流速为20μl/分钟。在Biacore 3000机器中，将Oridonin/冬凌草乙素（稀释至2μM）注射到芯片表面7分钟，然后再解离7分钟。使用BIA评估软件进行结合分析。

将细胞接种于 96 孔板中（KYSE70 为 6×103 个细胞/孔；KYSE410 为 2.5×103 个细胞/孔；KYSE450 为 2×103 个细胞/孔），孵育 24 小时，然后用不同量的冬凌草甲素或冬凌草甲素处理。车辆。 MTT 测定用于测量孵育 24、48 或 72 小时后的细胞增殖。对于贴壁无关的细胞生长评估，将悬浮在完全培养基中的细胞（2.5、5 或 10 μM 冬凌草甲素）添加到 0.3% 琼脂中，并在 0.5% 琼脂基层上的顶层添加载体、2.5、5 或 10 μM 冬凌草甲素与载体、2.5、5 或 10 μM 冬凌草甲素一起使用。

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细胞增殖试验[1]
将细胞接种在96孔板中（KYSE70为6×103个细胞/孔；KYSE410为2.5×103个单元/孔；KYSE450为2×103个电池/孔），孵育24小时，然后用不同量的Oridonin/冬凌草甲素或载体处理。孵育24、48或72小时后，通过MTT法测量细胞增殖。对于锚定非依赖性细胞生长评估，将悬浮在完全培养基中的细胞（8×103个细胞/孔）添加到0.3%琼脂中，顶层为含有载体、2.5、5或10μM冬凌草甲素的载体，底层为0.5%琼脂中含有载体、2.5,5或10μM冬凌草乙素。将培养物在5%CO2的培养箱中在37°C下保持3周，然后在显微镜下观察菌落，并使用Image Pro Plus软件（v.6.1）程序进行计数。

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细胞周期和凋亡分析[1]
将细胞（KYSE70为6×105个细胞；KYSE410为3×105个；KYSE450为2×105个）接种在60mm平板上，用0、5、10或20μMOridonin/冬凌草甲素处理48或72小时。对于细胞周期分析，然后将细胞固定在70%乙醇中，在-20°C下储存24小时。用膜联蛋白-V染色以进行凋亡或碘化丙啶染色以进行细胞周期评估后，使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析细胞。

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体外和体外下拉试验[1]
KYSE450细胞裂解物（500μg）和重组人活性AKT1或AKT2（200 ng）在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM EDTA，150 mM NaCl，1 mM二硫苏糖醇，0.01%NP-40和0.2 mM PMSF，20倍蛋白酶抑制剂[每片]）中与Oridonin/冬凌草甲素琼脂糖4B（或仅作为对照的琼脂糖4B）珠（50μL；50%浆液）一起孵育。在4°C下轻轻摇晃过夜后，用缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇、0.01%NP-40和0.2 mM PMSF）洗涤珠子3次，并通过蛋白质印迹观察结合情况。

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报告基因活性测定[1]
使用简单粪便转染试剂进行瞬时转染，并根据制造商的说明进行萤光素酶报告基因活性测定。简而言之，在转染前一天将细胞（1Ⅹ105）接种到24孔培养板中。将NF-κB-luc或pGL-3-luc萤火虫报告质粒与pRL-SV对照Renilla报告质粒共转染细胞。孵育24小时后，细胞用载体或Oridonin/冬凌草甲素再处理24小时，然后在裂解缓冲液中收获。通过使用报告分析系统 中提供的底物来评估萤火虫和雷尼拉荧光素酶的活性。Renilla萤光素酶活性用于转染效率的标准化。使用Luminoskan Ascent平板读数器测量萤光素酶活性。

小鼠：分离乳腺癌细胞，将其重悬于40% Matrigel-基底膜基质中（不含LDEV），然后注射（每点100 μL）至裸鼠（CrTac: NCr-Foxn1nu）的第四对乳腺脂肪垫。使用游标卡尺测量肿瘤的二维尺寸。肿瘤体积的计算公式为：体积 = 0.5 × 长 × 宽 × 厚。每2-3天测量一次肿瘤体积。收集肿瘤组织，并在70%乙醇中固定1小时，然后进行组织病理学检查。每天腹腔注射（IP）小鼠，分别给予赋形剂（1% Pluronic F68）或奥利多宁（15 mg/kg）。BEZ235以1:9的比例溶于1-甲基-2-吡咯烷酮和聚乙二醇300（PEG300）的混合溶液中。通过灌胃法，小鼠每日（QD）以 45 mg/kg 的剂量接受该化合物制剂[2]。

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患者来源异种移植 (PDX) 小鼠模型 [1]
本实验采用 6 至 8 周龄的重症联合免疫缺陷 (SCID) 雌性小鼠。将 PDX 肿瘤组织皮下植入 SCID 小鼠背部。当肿瘤平均体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠分为 3 个治疗组进行后续实验，具体如下：(1) 载体组 (n = 10)；(2) 40 mg/kg 奥利多宁组 (n = 10)；(3) 160 mg/kg 奥利多宁组 (n = 10)。奥利多宁每日灌胃一次，持续 52 天。肿瘤体积通过测量单个肿瘤底部三个直径，并使用以下公式计算：肿瘤体积 (mm³) = (长 × 宽 × 高 × 0.52)。监测小鼠直至肿瘤总体积达到 1.0 cm³，此时处死小鼠并取出肿瘤。

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抑制剂给药[1]
如前所述，每日腹腔注射（IP）小鼠奥利多宁（15 mg/kg，溶于 1% Pluronic F68）或载体（1% Pluronic 68）。BEZ235 以 1:9 的比例用 1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP；Sigma）和聚乙二醇 300 复溶。每日（QD）通过灌胃给予小鼠该化合物制剂 45 mg/kg。

小鼠腹腔注射LD50为35 mg/kg，英国专利文件，编号1476016

[1]. Targeting AKT with oridonin inhibits growth of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and patient derived xenografts in vivo. Mol Cancer Ther. 2018 Apr 25. pii: molcanther.0823.2017.

[2]. Oridonin inhibits aberrant AKT activation in breast cancer. Oncotarget. 2018 Feb 1;9(35):23878-23889.

奥利多宁（Oridonin）是一种有机杂五环化合物，属于ent-贝壳杉烷二萜类化合物，分子式为C20H28O6，是从药用植物红花罗布多西亚（Rabdosia rubescens）的叶片中分离得到的。它具有抗肿瘤、抑制血管生成、诱导细胞凋亡、抗哮喘、作为植物代谢产物和抗菌等多种活性。它是一种有机杂五环化合物，属于烯酮、环状半缩酮、仲醇和ent-贝壳杉烷二萜类化合物。
据报道，奥利多宁存在于日本香茶菜（Isodon japonicus）、大萼香茶菜（Isodon macrocalyx）和其他一些有相关数据的生物体中。

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本研究的新颖之处在于发现奥利多宁可直接与AKT1/2相互作用并抑制AKT1/2激酶活性（图2）。我们的 MTT 和软琼脂增殖实验结果也表明，冬凌草甲素显著抑制了 KYSE70、KYSE410 和 KYSE450 食管鳞状细胞癌 (ESCC) 细胞系的生长（图 3）。Pi 等人报道，冬凌草甲素在 30 μM 浓度下可诱导 KYSE150 细胞凋亡 (40)，而我们发现，冬凌草甲素在 20 μM 浓度下即可诱导 KYSE70、KYSE410 和 KYSE450 ESCC 细胞系凋亡并导致 G2/M 期阻滞（图 5，补充图 3、4）。值得注意的是，这些细胞表达极高水平的 AKT。这些结果表明，AKT 是冬凌草甲素抑制 ESCC 细胞增殖和诱导其凋亡的重要靶点。 AKT介导多种信号分子，包括GSK-3β、mTOR和NF-κB (8)，而冬凌草甲素可降低GSK-3β和mTOR的磷酸化水平以及NF-κB的转录活性（图6）。此外，冬凌草甲素与标准化疗药物5-氟尿嘧啶或顺铂联合使用，对食管鳞状细胞癌（ESCC）的生长具有协同或叠加效应（图7，补充图5）。最后，我们在体内PDX小鼠模型中验证了我们的发现，该模型是研究人类肿瘤生长的有效临床前模型。我们的结果表明，口服冬凌草甲素可显著抑制高表达AKT的PDX肿瘤的生长（图8，补充图6A、C、E），且无毒性，表现为与载体对照组小鼠相比，体重、肝脏或脾脏均无明显变化，且H&E染色分析结果也无明显异常（补充图6B、E）。 IHC结果表明，在两种PDX模型中，冬凌草甲素均能降低Ki-67、pAKT、pGSK-3β或p-mTOR的表达（图8D、E，补充图6D）。
总而言之，我们的研究表明，冬凌草甲素可通过直接靶向AKT抑制AKT信号通路，从而在体外和体内抑制食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤的进展（图9）。因此，本研究可能为冬凌草甲素在ESCC化疗中的临床应用提供有用的信息。[1]

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在本研究中，我们筛选了一个包含441种中药提取物的库，通过检测其对组成型激活AKT信号通路的HMEC-PIK3CAH1047R细胞模型中细胞活力的影响。其中19种提取物抑制细胞生长的效率与泛PI3K抑制剂BKM120或双重PI3K/mTOR抑制剂BEZ235相当。我们发现，从红花藤（Rabdosia rubescens）中提取的奥利多宁能最有效地降低细胞活力。奥利多宁并非直接抑制PI3K活性，而是与AKT1结合，可能作为一种潜在的ATP竞争性AKT抑制剂发挥作用。奥利多宁通过优先阻断AKT-mTOR信号通路，选择性地抑制了体外和体内p-AKT高表达的人乳腺癌细胞的生长。奥利多宁还能有效阻止PIK3CAH1047R驱动的小鼠乳腺肿瘤的发生。我们的结果表明，奥利多宁可能成为治疗AKT信号通路过度激活的乳腺癌患者的一种强效且选择性的治疗药物。
我们的研究结果提供了确凿的证据，表明红花藤提取物奥利多宁能够降低AKT信号通路活性，并选择性地抑制p-AKT高表达的乳腺肿瘤细胞的生长。值得注意的是，迄今为止，PI3K 抑制剂、AKT 抑制剂、mTOR 抑制剂以及双重 PI3K/mTOR 抑制剂的泛抑制剂或亚型选择性抑制剂均未取得持久或有效的临床疗效。与单一 PI3K 抑制剂、AKT 抑制剂甚至双重 PI3K/mTOR 抑制剂相比，奥利多宁有望提高疗效并降低毒性。综上所述，我们的数据表明，在 p-AKT 高表达的乳腺癌中，奥利多宁可能是一种强效且持久的治疗药物，应考虑将其应用于临床。[2]

C20H28O6

364.43

364.188

C, 65.92; H, 7.74; O, 26.34

28957-04-2

5321010

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

599.8±50.0 °C at 760 mmHg

248-250ºC

215.0±23.6 °C

0.0±3.9 mmHg at 25°C

1.635

1.44

107.22

4

6

0

26

717

9

O1C([H])([H])C23C([H])(C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C2([H])C([H])(C1(C12C(C(=C([H])[H])C([H])(C([H])([H])C([H])([H])C31[H])C2([H])O[H])=O)O[H])O[H])O[H]

SDHTXBWLVGWJFT-BAFGBBEMSA-N

InChI=1S/C20H28O6/c1-9-10-4-5-11-18-8-26-20(25,19(11,14(9)22)15(10)23)16(24)13(18)17(2,3)7-6-12(18)21/h10-13,15-16,21,23-25H,1,4-8H2,2-3H3/t10-,11-,12-,13+,15+,16-,18+,19-,20-/m0/s1

(1S,2S,5S,8R,9S,10S,11R,15S,18R)-9,10,15,18-tetrahydroxy-12,12-dimethyl-6-methylidene-17-oxapentacyclo[7.6.2.15,8.01,11.02,8]octadecan-7-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 62.5~72 mg/mL (171.5~197.6 mM)
Water: ~20 mg/mL warming (~134.1 mM)
Ethanol: ~34 mg/mL (~93.3 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+20%PEG 300+ddH2O: 12.5mg/ml

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配方 5 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (13.72 mM) (饱和度未知) in 10% 1-Methyl-2-pyrrolidinone 90% PEG300 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。