OSI-930   中文名称: 噻尔非尼

KDR (IC50 = 9 nM); Flt-1 (IC50 = 8 nM); Kit (IC50 = 80 nM); PDGFRβ (IC50 = 6900 nM); PDGFRα (IC50 = 3408 nM); CSF-1R (IC50 = 15 nM); c-Raf (IC50 = 41 nM); Flt-3 (IC50 = 1303 nM); Lck (IC50 = 22 nM); Abl (IC50 = 4738 nM)
Kit (Stem Cell Factor Receptor) and Kinase Insert Domain Receptor (KDR, also known as VEGFR2), tyrosine kinases involved in cell proliferation and angiogenesis. For OSI-930, literature [1] reported: Kit (IC50 = 7.0 nM, Ki = 3.8 nM), KDR (IC50 = 9.2 nM, Ki = 5.1 nM) via HTRF kinase assay. It showed no inhibition of EGFR, PDGFRβ, or c-MET (IC50 > 1 μM), confirming Kit/KDR selectivity [1]
- Literature [2] focused on drug metabolism and did not provide additional target data [2]

体外活性：OSI-930 抑制 HMC-1 细胞系的细胞增殖，IC50 为 14 nM，对不表达组成型活性突变受体酪氨酸激酶的 COLO-205 细胞系的生长没有显着影响。此外，OSI-930 还可诱导 HMC-1 细胞系凋亡，EC50 为 34 nM。最近的一项研究表明，OSI-930 以时间和浓度依赖性模式灭活纯化的重组细胞色素 P450 (P450) 3A4，Ki 为 24 μM。激酶测定：蛋白激酶测定可以通过基于 ELISA 的测定方法（试剂盒、KDR、PDGFRα 和 PDGFRβ）在内部进行，也可以通过放射测量方法进行。内部 ELISA 测定使用聚（Glu:Tyr）作为结合到 96 孔测定板表面的底物；然后使用与 HRP 结合的抗磷酸酪氨酸抗体检测磷酸化。然后使用 ABTS 作为过氧化物酶底物，通过测量 405/490 nm 处的吸光度来定量结合的抗体。所有测定均使用在昆虫细胞或细菌中表达的纯化重组激酶催化结构域。用于内部检测的试剂盒和EGFR蛋白是内部制备的；获得其他酶。重组 Kit 蛋白在昆虫细胞中表达为 NH2 末端谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白，最初纯化为非磷酸化（非活化）酶，具有相对较高的 ATP Km (400 μM)。在某些测定中，通过在 30 °C 下与 1 mM ATP 一起孵育 1 小时来制备活性（酪氨酸磷酸化）形式的酶。然后磷酸化的蛋白质通过脱盐柱去除大部分 ATP，并在 -80 °C 下储存在含有 50% 甘油的缓冲液中。与初始非磷酸化制剂相比，所得制剂具有显着更高的比活性和更低的 ATP Km (25 μM)。 OSI-930 对 Kit 自磷酸化的抑制通过在 30 °C、200 μM ATP 和不同浓度的 OSI-930 存在下孵育非磷酸化酶来测定。通过将等分试样移入 SDS-PAGE 样品缓冲液中，然后加热至 100°C 5 分钟来停止反应。然后通过总 Kit 和磷酸化 Kit 的免疫印迹测定 Kit 的磷酸化程度。细胞测定：为了测定细胞增殖和凋亡，将细胞接种到 96 孔板中，并在不同浓度的 OSI-930 存在下孵育 2 至 3 天。使用 CellTiterGlo 对细胞内 ATP 含量进行发光定量来确定细胞生长的抑制情况。 OSI-930 对 caspase 依赖性细胞凋亡的诱导通过酶 caspase 3/7 测定进行定量。使用大鼠主动脉环内皮芽生长测定来监测 OSI-930 对血管生成的抑制。主动脉切片由 CO2 安乐死的雄性大鼠制备，并在存在或不存在 OSI-930 的情况下在胶原基质中体外培养。胶原基质由 1 型大鼠尾胶原以 3 mg/mL 溶解于 0.1% 乙酸中制备，与 0.125 体积胶原缓冲液（0.05 N NaOH、200 mM HEPES、260 mM NaHCO3）、0.125 体积培养基 199 混合、0.0125 体积的 1 M NaOH 和 1% GlutaMax。将主动脉环包埋在六孔板中的0.4mL该基质中，向其中加入0.5mL内皮基础培养基和适量的OSI-930；然后将这些环孵育10天，并通过测量主动脉组织区域周围的一系列同心环内的含芽区域，从图像中对所产生的血管生成芽进行数字定量。

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Kit驱动癌细胞：在GIST-T1（胃肠道间质瘤，Kit突变）和M-07e（急性髓系白血病，Kit过表达）细胞中，OSI-930（0.01 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）IC50分别为GIST-T1 0.08 μM、M-07e 0.12 μM。Western blot显示GIST-T1细胞经0.2 μM处理2小时后p-Kit减少90%；Annexin V-FITC染色显示0.5 μM处理48小时后凋亡率达45% [1]
- KDR依赖内皮细胞：在HUVECs（KDR依赖）中，OSI-930（0.01 μM–1 μM）处理24小时（0.3 μM）抑制VEGF诱导的管腔形成75%，处理12小时（0.3 μM）抑制迁移65%。Western blot显示HUVECs经0.2 μM处理1小时后p-KDR减少85% [1]
- CYP3A4灭活作用：在人肝微粒体中，OSI-930（1 μM–10 μM）呈时间和浓度依赖性灭活CYP3A4（灭活IC50=2.3 μM），但对CYP3A5活性无影响（即使在10 μM浓度下） [2]

OSI-930 通过口服管饲的最大有效剂量为 200 mg/kg，在多种临床前异种移植模型（包括 HMC-1、NCI-SNU-5、COLO-205 和 U251 异种移植模型）中表现出有效的抗肿瘤活性。

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GIST异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种GIST-T1细胞，随机分为3组（每组n=8）：溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、OSI-930 25 mg/kg组、50 mg/kg组。药物口服每日一次，连续28天。肿瘤体积减少率：25 mg/kg组60%、50 mg/kg组85%；肿瘤重量减少率：25 mg/kg组55%、50 mg/kg组80%。免疫组化显示50 mg/kg组p-Kit减少80% [1]
- 白血病异种移植模型：7周龄雄性裸鼠接种M-07e细胞，用OSI-930 30 mg/kg（口服每日一次）处理21天。肿瘤体积减少70%，外周血原始细胞比例从45%降至15% [1]

基于内部 ELISA 的检测技术（Kit、KDR、PDGFRα 和 PDGFRβ）或放射技术用于蛋白激酶检测。 Poly(Glu:Tyr) 是结合到 96 孔测定板表面内部 ELISA 测定的底物；然后使用与 HRP 结合的抗磷酸酪氨酸抗体检测磷酸化。接下来，通过以 ABTS 作为过氧化物酶底物测量 405/490 nm 处的吸光度，对结合的抗体进行定量。所有测定均使用在细菌或昆虫细胞中表达的重组激酶的纯化催化结构域。其他酶均已获得，但内部检测所需的试剂盒和 EGFR 蛋白是现场制备的。重组 Kit 蛋白首先纯化为非磷酸化（非活化）酶，对 ATP 具有相对较高的 K_m (400 μM)。它在昆虫细胞中表达为 NH₂-末端谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白。在某些测定中，将酶与 1 mM ATP 在 30 °C 下孵育 1 小时，以产生活化（酪氨酸磷酸化）形式。将磷酸化蛋白质通过脱盐柱去除大部分 ATP 后，将其储存在 -80 °C 下含有 50% 甘油的缓冲液中。所得制剂比原始非磷酸化制剂更具特异性，并且 ATP Km (25 μM) 更低。将非磷酸化酶与 200 μM ATP 和不同浓度的 OSI-930 在 30 °C 下孵育，以测量化合物对 Kit 自磷酸化的抑制。将等分试样移入 SDS-PAGE 样品缓冲液中并将其加热至 100°C 并保持五分钟后，停止反应。接下来，使用免疫印迹法评估总 Kit 和磷酸化 Kit 的磷酸化水平。

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Kit/KDR HTRF激酶实验（文献[1]）：将重组人Kit（544–976位氨基酸）或KDR（786–1356位氨基酸）与生物素化肽底物（Kit：Ac-EAIYAAPFAKKK-NH2，KDR：Ac-EAIYAAPFAKKK-NH2，20 μM）、Eu标记抗磷酸酪氨酸抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的OSI-930（0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），计算IC50/Ki [1]
- CYP3A4灭活实验（文献[2]）：将表达CYP3A4或CYP3A5的人肝微粒体与OSI-930（1 μM–10 μM）及NADPH（1 mM）在37°C下孵育0–60分钟。孵育后加入咪达唑仑（CYP3A底物，10 μM），通过HPLC检测残余酶活性，计算灭活速率常数（kinact）和解离常数（KI） [2]

将细胞接种到 96 孔板中，并在不同浓度的 OSI-930 存在下孵育两到三天，以检测细胞增殖和凋亡。使用 CellTiterGlo，通过发光定量细胞内 ATP 含量来确定细胞生长的抑制情况。使用酶 caspase 3/7 测定法测量 OSI-930 诱导的 caspase 依赖性细胞凋亡的量。用于测量 OSI-930 对血管生成的抑制作用的测定是大鼠主动脉环内皮芽的生长。使用 CO2 安乐死的雄性大鼠制备其主动脉切片，然后在含有或不含 OSI-930 的胶原蛋白基质中进行体外培养。将 1 型鼠尾胶原蛋白以 3 mg/mL 的浓度溶解在 0.1% 乙酸中，形成胶原蛋白基质。然后将该溶液与 0.125 体积的胶原缓冲液（0.05 N NaOH、200 mM HEPES、260 mM NaHCO₃）、0.125 体积的培养基 199、0.0125 体积的 1 M NaOH 和 1% GlutaMax 混合。将适量的 OSI-930 和 0.5 mL 内皮基础培养基添加到嵌入六孔板主动脉环中的 0.4 mL 该基质中，将环孵育 10 天。然后通过测量主动脉组织区域周围的一系列同心环内的包含芽的区域，从图像中对所产生的血管生成芽进行数字定量。

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Kit驱动细胞增殖与凋亡实验（文献[1]）：GIST-T1/M-07e细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用OSI-930（0.01 μM–10 μM）处理72小时。MTT法检测活力计算IC50。凋亡实验中，GIST-T1细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用0.5 μM药物处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析 [1]
- HUVEC管腔形成与迁移实验（文献[1]）：HUVECs分别以1×10⁵个细胞/孔接种于Matrigel包被的24孔板（管腔形成）或Transwell小室（5×10⁴个细胞/小室，迁移）。加入OSI-930（0.01 μM–1 μM）+VEGF（50 ng/mL）；24小时后定量管腔形成，12小时后计数迁移细胞 [1]

HMC-1, NCI-SNU-5, COLO-205 and U251 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.
≤200 mg/kg
Administered via p.o.

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GIST-T1 Xenograft Protocol (Literature [1]): Female nude mice (6 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×10⁶ GIST-T1 cells. When tumors reached ~100 mm³, OSI-930 was dissolved in 0.5% methylcellulose + 0.1% Tween 80, administered orally once daily (25 mg/kg or 50 mg/kg) for 28 days. Tumor volume (length×width²/2) was measured every 3 days; mice were euthanized on day 28, tumors processed for p-Kit immunohistochemistry [1]
- M-07e Leukemia Xenograft Protocol (Literature [1]): Male nude mice (7 weeks old) were intravenously injected with 2×10⁶ M-07e cells. Seven days later, OSI-930 (30 mg/kg, dissolved in 0.5% methylcellulose + 0.1% Tween 80) was oral once daily for 21 days. Peripheral blood was collected weekly to count blast cells; tumor burden was assessed via histopathology [1]

Rat PK (Literature [1]): Male Sprague-Dawley rats (8 weeks old) oral OSI-930 50 mg/kg: oral bioavailability = 52%, Cmax = 3.9 μM, Tmax = 1.5 h, terminal t₁/₂ = 7.6 h. Intravenous 10 mg/kg: clearance (CL) = 8.8 mL/min/kg, steady-state volume of distribution (Vss) = 1.3 L/kg [1]
- Human Plasma Protein Binding: 98% (equilibrium dialysis, [1])
- Metabolism (Literature [2]): In human liver microsomes, OSI-930 is metabolized by CYP3A4 (major pathway, ~70%); no significant metabolism by CYP3A5, CYP2D6, or CYP2C9 [2]

In Vitro Cytotoxicity: In normal human gastrointestinal epithelial cells (GIECs) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), OSI-930 (up to 10 μM, 72 h) showed viability > 80%, indicating low non-specific toxicity [1]
- In Vivo Acute Toxicity: Rats treated with OSI-930 50 mg/kg (oral, 28 days) had mild diarrhea (10% animals) and no liver/kidney damage (ALT/AST/creatinine normal) [1]
- Drug-Drug Interaction Risk: Due to CYP3A4 inactivation, OSI-930 may increase plasma concentrations of co-administered CYP3A4 substrates (e.g., midazolam) [2]

[1]. OSI-930: a novel selective inhibitor of Kit and kinase insert domain receptor tyrosine kinases with antitumor activity in mouse xenograft models. Cancer Res. 2006, 66(2):1015-1024.

[2]. Inactivation of cytochrome P450 (P450) 3A4 but not P450 3A5 by OSI-930, a thiophene-containing anticancer drug. Drug Metab Dispos. 2011, 39(2), 345-350.

3-(4-quinolinylmethylamino)-N-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-2-thiophenecarboxamide is an aromatic amide.
OSI-930 is an orally active inhibitor of two clinically validated targets: c-Kit and the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2). OSI-930 is designed to target both cancer cell proliferation and blood vessel growth (angiogenesis) in selected tumors. In preclinical studies, OSI-930 shows broad efficacy in tumor models representative of small cell lung cancer, glioblastoma, colorectal, renal, head and neck, non-small cell lung cancer and gastric cancers.
Tyrosine Kinase Inhibitor OSI-930 is a selective thiophene-derived tyrosine kinase inhibitor with potential antineoplastic activity. Tyrosine kinase inhibitor OSI-930 inhibits stem cell factor receptor (c-Kit) and the vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), which may result in the inhibition of both tumor cell proliferation and tumor angiogenesis. Both c-Kit and VEGFR2 are overexpressed in a variety of cancers.

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Drug Indication
Investigated for use/treatment in solid tumors.

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Mechanism of Action
OSI-930 is a multi-targeted tyrosine kinase inhibitor that is designed to act as a potent co-inhibitor of the receptor tyrosine kinases c-Kit and VEGFR-2. The inhibition of the tyrosine kinase activity of Kit is expected to result in reduced cancer cell proliferation and increased cellular apoptosis in tumor types driven by Kit, resulting in inhibition of tumor growth. OSI-930 is also capable of inhibiting VEGFR-2. This receptor is present on endothelial cells and is a key mediator of blood vessel growth in response to the angiogenic growth factor VEGF. This pathway is believed to be the single most important mechanism for recruitment of new blood vessels in nearly all solid tumors. Inhibition of this pathway should therefore impact the growth and metastases of a wide range of angiogenesis-dependent malignancies.

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OSI-930 is a selective small-molecule inhibitor of Kit and KDR, developed for the treatment of Kit-driven cancers (e.g., gastrointestinal stromal tumor, acute myeloid leukemia) and angiogenesis-dependent tumors [1]
- Its mechanism involves binding to the ATP-binding pockets of Kit and KDR, inhibiting tyrosine kinase activation and downstream signaling (Kit: PI3K/AKT; KDR: ERK/AKT), thereby blocking cell proliferation, inducing apoptosis, and suppressing angiogenesis [1]
- It exhibits time-dependent inactivation of CYP3A4, which may pose drug-drug interaction risks when combined with CYP3A4-metabolized drugs [2]

C22H16F3N3O2S

443.44

443.091

C, 59.59; H, 3.64; F, 12.85; N, 9.48; O, 7.22; S, 7.23

728033-96-3

9868037

Light yellow to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

517.4±50.0 °C at 760 mmHg

266.7±30.1 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.687

5.1

91.49

2

8

6

31

601

0

S1C([H])=C([H])C(=C1C(N([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])OC(F)(F)F)=O)N([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=NC2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12

FGTCROZDHDSNIO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H16F3N3O2S/c23-22(24,25)30-16-7-5-15(6-8-16)28-21(29)20-19(10-12-31-20)27-13-14-9-11-26-18-4-2-1-3-17(14)18/h1-12,27H,13H2,(H,28,29)

3-(quinolin-4-ylmethylamino)-N-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]thiophene-2-carboxamide

OSI-930; OSI930; OSI 930

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 5 mg/kg

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。