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PF-06447475

别名: PF6447475;PF-06447475;PF-6447475; PF06447475;PF 6447475; PF 06447475
3-[4-(4-吗啉基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-5-基]苯甲腈
目录号: V2916 纯度: ≥98%
COA 产品数据 产品说明书 SDS
PF-06447475 (PF06447475) 是一种新型、高效、选择性和脑可渗透的富含亮氨酸重复激酶 2 (LRRK2) 抑制剂，具有抗 PD 活性。
PF-06447475 CAS号: 1527473-33-1
产品类别: LRRK2
产品仅用于科学研究，不针对患者销售
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产品描述
PF-06447475 (PF06447475) 是一种新型、高效、选择性和脑可渗透的富含亮氨酸重复激酶 2 (LRRK2) 抑制剂，具有抗 PD 活性。它抑制 LRRK2，IC50 为 3 nM。通过全基因组关联研究 (GWAS)，LRRK2 与帕金森病 (PD) 存在遗传关联。 PF-06447475 在全细胞测定中抑制 LRRK2 酶和 LRRK2，IC50 分别为 3 和 25 nM。单独使用 PF-06447475（0.5、1、3 μM）或在 ROT 存在的情况下孵育细胞，可显着降低 (S935)-LRRK2 激酶磷酸化至对照。 PF-06447475 具有治疗 PD 的潜力。
生物活性&实验参考方法
靶点
PF-06447475 specifically targets Leucine-rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) (a serine-threonine protein kinase); IC50 is approximately 5 nM (determined by the ratio of Ser(P)-935 to total LRRK2 in mouse macrophage Raw264.7 cells). [3]

PF-06447475 is a potent and selective LRRK2 kinase inhibitor, with inhibitory activity verified in recombinant LRRK2 FRET assay and human peripheral blood monocytic cells (PBMCs) ActivX assay. [1]
体外研究 (In Vitro)
PF-06447475 在全细胞测定中抑制 LRRK2 酶和 LRRK2，IC50 分别为 3 和 25 nM[1]。与对照相比，单独用 PF-06447475（0.5、1、3 μM）或用 ROT 处理的细胞显着降低 (S935)-LRRK2 激酶的磷酸化。与未处理和对照相比，PF-06447475 显着保留了暴露于 ROT 的 NLC 的细胞核形态和 ΔΨm。 PF-475 显着降低了 ROT 诱导的 ROS 产生，达到与单独暴露于 PF-475 的细胞相当的水平[2]。
1. 在50 μM鱼藤酮（rotenone，帕金森病模型诱导剂）诱导氧化应激的人神经样分化细胞（NLCs）中：1 μM PF-06447475可完全阻断LRRK2的丝氨酸935位点磷酸化（p-S935-LRRK2），消除活性氧（ROS）过量产生（鱼藤酮诱导升高约100%），逆转线粒体膜电位（∆Ψₘ）降低（约21%），并使凋亡相关标志物的过表达恢复至对照水平：转录因子NF-κB（升高5.6倍）、p53（升高5.3倍）、c-Jun（升高5.4倍），以及蛋白caspase-3（升高8.0倍）、AIF（升高6.8倍）；同时抑制细胞核浓缩/碎裂（鱼藤酮诱导率16%）。[2]

2. 在小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞中：PF-06447475处理24小时可剂量依赖性抑制LRRK2的Ser935位点磷酸化，半数最大抑制浓度（IC50）约为5 nM（通过Ser(P)-935与总LRRK2的比值计算）。[3]

3. 体外激酶活性实验：以LRRKtide为底物，在1 mM ATP存在下，通过FRET实验检测显示，PF-06447475对重组全长GST标签LRRK2蛋白具有强效抑制活性；在人PBMCs中，通过商业化ActivX实验验证了其对内源性LRRK2的抑制潜力。[1]
体内研究 (In Vivo)
使用 PF-06447475 治疗的 G2019S+ 大鼠中的小胶质细胞增生显着降低至野生型大鼠中观察到的水平。在共聚焦切片中，在骨髓细胞而非神经元上表达的促炎标记物 MHC-II 在给予 PF-06447475 的 G2019S+ 大鼠中似乎也不那么普遍。在 G2019S+ 大鼠中，用 PF-06447475 治疗可显着减少招募至 SNpc 的 CD68 细胞数量。 PF-06447475 有效抑制与 G2019S-LRRK2 表达相关的神经炎症增加。 TH 在背侧纹状体中表达，这与减轻 SNpc 神经变性的药物一致[3]。大鼠能够很好地耐受 PF-06447475[1]。
1. 在α-突触核蛋白诱导的神经退行性变大鼠模型（帕金森病模型）中：[3]

- 动物模型：10-12周龄Sprague-Dawley野生型大鼠（G2019S⁻）和G2019S-LRRK2转基因大鼠（G2019S⁺）。
- 治疗效果：以30 mg·kg⁻¹的剂量每日两次（b.i.d.）口服给予PF-06447475，持续4周，可减轻单侧颅内注射6×10⁹ rAAV2 α-突触核蛋白病毒颗粒诱导的多巴胺能神经退行性变；保护黑质致密部（SNpc）酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元（经无偏立体计数验证），维持背侧纹状体TH纤维密度，并减少神经炎症（降低SNpc中Iba1免疫反应分数面积和CD68阳性细胞募集）。
- 转基因大鼠中的协同效应：G2019S-LRRK2转基因大鼠在α-突触核蛋白过表达后，神经退行性变和炎症反应加剧，而PF-06447475处理可显著缓解该表型。
2. 脑穿透性：在大鼠中，PF-06447475的未结合脑浓度（Cbu）与未结合血浆浓度（Cpu）相当，表明其具有良好的脑穿透性。[1]

3. 大鼠体内药效学：Sprague-Dawley大鼠口服给予PF-06447475 14天（每日两次），可显著降低脑和肾脏组织中Ser(P)-935-LRRK2与总LRRK2的比值。[1]
酶活实验
1. LRRK2激酶活性FRET实验：[3]

以重组全长GST标签LRRK2蛋白为酶源，LRRKtide为替代激酶底物，在1 mM ATP存在下构建反应体系。向体系中加入不同浓度的PF-06447475，通过检测FRET信号变化评估化合物对LRRK2激酶活性的抑制作用，并基于信号变化计算半数最大抑制浓度（IC50）。
2. 人PBMCs ActivX实验：[1]

将人外周血单核细胞（PBMCs）与指定浓度的PF-06447475共同孵育，利用商业化ActivX实验试剂盒检测化合物与LRRK2激酶的结合情况，进而验证其对原代细胞中内源性LRRK2的抑制潜力。[1]
细胞实验
1. 氧化应激诱导细胞损伤及神经保护实验（人神经样分化细胞，NLCs）：[2]

先将间充质干细胞诱导分化为NLCs，细胞分为对照组、鱼藤酮处理组（50 μM，作用6小时）和PF-06447475干预组（1 μM，与鱼藤酮共处理或预处理）。孵育结束后，通过荧光探针检测ROS水平；流式细胞术或荧光染色检测线粒体膜电位（∆Ψₘ）；显微镜下观察细胞核形态，评估浓缩/碎裂情况；Western blot检测p-S935-LRRK2、总LRRK2、NF-κB、p53、c-Jun、caspase-3和AIF的表达水平。
2. LRRK2磷酸化抑制实验（小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞）：[3]

将Raw264.7细胞接种于培养板，贴壁过夜后，用系列浓度的PF-06447475处理24小时。提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜；膜与抗Ser(P)-935-LRRK2和总LRRK2的一抗孵育后，加入HRP标记二抗，化学发光显影蛋白条带，计算Ser(P)-935-LRRK2与总LRRK2的比值，确定IC50值。[3]
动物实验
和 30 mg/kg PF-06447475 (pobid)
G2019S+ 大鼠
1. α-突触核蛋白诱导的神经退行性变大鼠模型实验：[3]

- 动物：10 至 12 周龄雄性 Sprague-Dawley 野生型大鼠 (G2019S⁻) 和 G2019S-LRRK2 BAC 转基因大鼠 (G2019S⁺)。
- 模型诱导：单侧颅内注射 6 × 10⁹ 个 rAAV2 α-突触核蛋白病毒颗粒至大鼠黑质 (SNpc)。
- 给药：病毒转导后，PF-06447475以30 mg·kg⁻¹的剂量，每日两次（bid）灌胃给药，持续4周；对照组以相同途径和频率给予对照化合物。
- 样本采集：末次给药后90分钟或2小时处死大鼠。采集脑（黑质、纹状体）、肾脏、肺、肝脏和脾脏。
- 检测方法：采用Western blot法定量脑和肾组织中Ser(P)-935-LRRK2和总LRRK2的表达；对内脏组织进行组织学染色（H&E染色、Masson三色染色、LAMP2-DAB染色、CD68-DAB染色、油红O染色）；对黑质致密部（SNpc）中酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元进行无偏立体学计数；采用 LI-COR 分析法定量背侧纹状体中 TH 纤维密度。
2. 大鼠短期药效学和安全性研究：[1]

- 动物：每组 6 只 Sprague-Dawley 大鼠（3 只雄性，3 只雌性）。
- 给药：每日两次（bid）灌胃给予 PF-06447475 或溶剂对照，持续 14 天。
- 样本采集：末次给药后 90 分钟处死大鼠，迅速取出全脑和肾脏。
- 检测方法：制备组织蛋白裂解液，每泳道取 50 μg 总蛋白进行 Western blot 分析，以定量 Ser(P)-935-LRRK2 和总 LRRK2 的表达。[1]
药代性质 (ADME/PK)
1. 被动渗透性：在 RRCK 细胞中进行评估。[1]

2. P-糖蛋白 (P-gp) 外排比率：在 MDR1 细胞中测定。[1]

3. 肝微粒体稳定性：在大鼠肝微粒体中进行评估。[1]

4. 脑渗透性：在大鼠中，游离脑浓度 (Cbu) 与游离血浆浓度 (Cpu) 相当，表明具有良好的脑渗透性。[1]
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)
1. 大鼠急性及亚慢性毒性：口服给予PF-06447475，剂量为30 mg·kg⁻¹，每日两次，持续4周（或14天），未引起体重显著变化；肝脏、肾脏、肺脏和脾脏的组织学检查未见异常病理改变（例如炎症、组织损伤）。[3]
参考文献

[1]. Discovery and preclinical profiling of 3-[4-(morpholin-4-yl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]benzonitrile (PF-06447475), a highly potent, selective, brain penetrant, and in vivo active LRRK2 kinase inhibitor. J Med Chem. 2015 Jan 8;58(1):419-32.

[2]. Neuroprotective Effect of the LRRK2 Kinase Inhibitor PF-06447475 in Human Nerve-Like Differentiated Cells Exposed to Oxidative Stress Stimuli: Implications for Parkinson's Disease. Neurochem Res. 2016 Oct;41(10):2675-2692.

[3]. Leucine-rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Pharmacological Inhibition Abates α-Synuclein Gene-induced Neurodegeneration. J Biol Chem. 2015 Aug 7;290(32):19433-44.
其他信息
1. 背景：富亮氨酸重复激酶2 (LRRK2) 与帕金森病 (PD) 存在遗传关联。LRRK2 的 G2019S 错义突变会增强其激酶活性，而该激酶活性参与帕金森病中的氧化应激、神经退行性变和神经炎症。[1][2][3]

2. 药物特性：PF-06447475 是一种高效、选择性强、可穿透血脑屏障且具有体内活性的 LRRK2 激酶抑制剂，通过构效关系 (SAR) 优化和替代晶体学方法筛选，以提高其对激酶组的选择性。 [1]

3. 作用机制：PF-06447475 通过抑制 LRRK2 激酶活性，阻断 LRRK2 在 Ser935 位点的磷酸化，从而抑制氧化应激诱导的神经元凋亡以及 α-突触核蛋白介导的多巴胺能神经退行性变和神经炎症。[2][3]

4. 治疗潜力：PF-06447475 具有治疗帕金森病 (PD) 的潜力，因为它可以减轻 PD 相关病理变化（神经退行性变、神经炎症），并在临床前模型中保护神经元。[1][2][3]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C17H15N5O
分子量
305.33
精确质量
305.127
CAS号
1527473-33-1
相关CAS号
1527473-33-1
PubChem CID
72706840
外观&性状
Off-white to pink solid powder
密度
1.4±0.1 g/cm3
折射率
1.711
LogP
2
tPSA
77.83
氢键供体(HBD)数目
1
氢键受体(HBA)数目
5
可旋转键数目(RBC)
2
重原子数目
23
分子复杂度/Complexity
457
定义原子立体中心数目
0
InChi Key
BHTWDJBVZQBRKP-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C17H15N5O/c18-9-12-2-1-3-13(8-12)14-10-19-16-15(14)17(21-11-20-16)22-4-6-23-7-5-22/h1-3,8,10-11H,4-7H2,(H,19,20,21)
化学名
3-(4-morpholin-4-yl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)benzonitrile
别名
PF6447475;PF-06447475;PF-6447475; PF06447475;PF 6447475; PF 06447475
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO:≥ 33 mg/mL
Water:<1 mg/mL
Ethanol: N/A
溶解度 (体内实验)
配方 1 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (9.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 30.0 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。
配方 2 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (9.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 30.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。
请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 3.2751 mL 16.3757 mL 32.7514 mL
5 mM 0.6550 mL 3.2751 mL 6.5503 mL
10 mM 0.3275 mL 1.6376 mL 3.2751 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器
计算 重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？
  • 在分子量（MW）框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。
计算 重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：
  • 在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
  • 在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中
g/mol
计算 重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：
  • 分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
  • 摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。
/
计算 重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。
+
+
+
计算 重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

生物数据图片
  • PF-06447475


    Efficacy and pharmacodynamic properties of the LRRK2 kinase inhibitor PF-06447475.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

  • PF-06447475


    LRRK2 kinase inhibition is well tolerated in rats.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

  • PF-06447475


    PF-06447475 administration blocks α-synuclein-induced dopaminergic neurodegeneration.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

  • PF-06447475


    Microgliosis associated with G2019S-LRRK2 expression is attenuated by PF-06447475 in G2019S-LRRK2 rats.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

  • PF-06447475


    Reduced CD68 cell recruitment in G2019S-LRRK2 rats treated with PF-06447475.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

  • PF-06447475


    G2019S-LRRK2 expression enhances α-synuclein-induced dopaminergic neurodegeneration.2015 Aug 7;290(32):19433-44.

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