GLP-1 receptor
Danuglipron (PF-06882961) targets the human glucagon‑like peptide‑1 receptor (GLP‑1R).
Binding affinity (Ki): 80 nM using [³H]‑PF‑06883365 radioligand; 360 nM using [¹²⁵I]‑GLP‑1 radioligand.
cAMP potency (EC50): 13 nM in candidate selection (CS) cell line; 0.38 nM in screening assay (SA) with BETP; 4.6 nM in HEK293 cells expressing FAP‑GLP‑1R.
β‑arrestin recruitment (EC50): 490 nM (β‑arrestin2), 500 nM (β‑arrestin1) with Emax 36% and 32%, respectively.
Receptor internalization (EC50): 230 nM (Emax 83%). [2]

PF-06882961 能促进表达人源和猴源 GLP-1R 的 CHO 细胞中 cAMP 的积累，且 EC50 值相近。另一方面，PF-06882961 不会提高表达 GLP-1R 的小鼠、大鼠或兔细胞中的 cAMP 水平。[2]

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达那格列酮 (PF-06882961) 可作为 cAMP 信号通路的完全激动剂，同时也是 β-arrestin 募集和受体内化的部分激动剂。[2]
在稳定表达人源 GLP-1R 的 CHO 细胞中，该化合物在 BETP 存在下，可增加 cAMP 的产生，在 CS 细胞系（受体密度较低，约 500 fmol/mg）中 EC50 为 13 nM，在 SA 细胞系（受体密度较高，约 2200 fmol/mg）中 EC50 为 0.38 nM。 [2] 在β-arrestin募集实验（PathHunter）中，Danuglipron (PF-06882961) 对β-arr2 和β-arr1 的EC50值分别为490 nM和500 nM，Emax分别为36%和32%，而利拉鲁肽对β-arr2 的Emax为99%。[2] 使用稳定表达荧光激活蛋白 (FAP) 标记的GLP-1R的HEK293细胞，该化合物诱导受体内化，EC50为230 nM，Emax为83%；艾塞那肽和利拉鲁肽的内化作用更强（Emax分别为125%和117%）。 [2]
对表达 GFP 标记的 GLP-1R 的 HEK293 细胞进行共聚焦显微镜观察发现，用Danuglipron (PF-06882961)刺激 30 分钟后，受体在细胞内显著积累，洗脱 2 小时后可逆。[2]
该化合物不会增加表达小鼠、大鼠或兔 GLP-1R 的细胞中的 cAMP 水平，但在小鼠 GLP-1R S33W 突变体中活性恢复，证实了依赖于色氨酸 33 的物种选择性。[2]

PF-06882961 可降低猴子的食物摄入量，并增加葡萄糖刺激后的胰岛素释放。[2]
达格列隆具有口服生物利用度，可有效降低猴子的血糖水平和食物摄入量。静脉注射后，达格列隆在大鼠（CLp = 57.3 mL/min/kg）和猴子（CLp = 13.8 mL/min/kg）中均表现出中等至较高的血浆清除率 (CLp) 值，且在大鼠和猴子中的消除半衰期分别为 1.1 小时和 1.9 小时，相对较短。在动物体内，达格列隆三盐形式的口服生物利用度为低至中等，并呈剂量依赖性增加，足以用于研究达格列隆经标准0.5%甲基纤维素（含2%吐温80）灌胃给药的临床前体内疗效和安全性。[3] 由于达格列隆不激活啮齿动物的GLP-1受体，因此在食蟹猴中，通过静脉输注和口服给药，采用静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）检测了达格列隆对胰岛素和葡萄糖的治疗作用。输注速率和口服剂量是根据猴药代动力学（PK）研究中达到受体占有率（RO）所需的全身浓度预测的，该受体占有率范围涵盖了根据利拉鲁肽临床有效剂量（每日一次，1.8 mg）的人体血浆暴露量估算的RO。在静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）期间，静脉输注达格列隆可增加胰岛素分泌率和葡萄糖清除率（K值）（图88B-D）。达格列隆对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的增强作用呈浓度依赖性，且口服和静脉输注途径的效果相当（图88E）。与载体对照组相比，每日一次皮下注射达格列隆，连续2天，也可抑制猴子的食物摄入量（图88F）。选择皮下给药途径是为了减少口服给药时全身暴露量的变异性，并且比静脉给药更方便。[3]在食蟹猴的静脉葡萄糖耐量试验 (IVGTT) 中，静脉注射达那格列酮 (PF-06882961) 可浓度依赖性地增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖清除率 (K 值)。[2]在猴子中口服达那格列酮 (PF-06882961) 也可增强葡萄糖刺激的胰岛素释放 (AUC0-30 min)，其疗效与静脉输注相似。[2]每日一次口服给药，持续 2 天，可显著降低猴子的食物摄入量，与接受赋形剂治疗的猴子相比。 [2] 在 C57BL/6 小鼠中，皮下注射 10 mg/kg 的达格列酮 (PF-06882961) 并未改善腹腔葡萄糖耐量试验 (IPGTT) 期间的葡萄糖耐量，这与其对啮齿动物 GLP-1 受体缺乏活性相一致。[2] 在一项 I 期人体研究中，单次口服 3-300 mg 的达格列酮 (PF-06882961) 显示出剂量依赖性降低给药后 24 小时空腹血糖的趋势；300 mg 剂量组的空腹血糖降低幅度与安慰剂组相比具有统计学意义。[2]

生物学检测。Min6 Ca2+ 动员检测[3]
\n将 MIN6-c4 细胞以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种于黑色 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 20–24 小时。细胞加样时，吸出培养上清液，并向每个孔中加入 100 μL 检测缓冲液（Krebs-Ringer 缓冲液，10 mM HEPES，0.1% BSA，2.5 mM 葡萄糖）和等体积的钙 6 染料（FLIPR 钙 6 检测试剂盒，Molecular Devices，R8191），该染料溶解于相同的缓冲液中，具体操作按照制造商的说明进行。细胞在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 70 分钟，然后在室温下避光平衡 10 分钟。为了评估测试化合物对葡萄糖介导的细胞内Ca2+增加的影响，在FLIPR Tetra仪器（Molecular Devices公司）检测过程中，每个孔中加入50 μL含有75 mM葡萄糖（最终葡萄糖浓度为15 mM）和测试化合物或DMSO的检测缓冲液。对于低葡萄糖对照组，加入50 μL不含额外葡萄糖的饥饿缓冲液，使最终葡萄糖浓度保持在2.5 mM。通过计算3秒至372秒荧光读数曲线下的面积来量化钙离子流。

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\n在稳定表达人GLP-1R的PSC-HEK293细胞系中进行cAMP刺激试验[3]
\n使用即用型冻存细胞，在1536孔板中进行GLP-1R激动剂和正向变构调节剂的体外细胞试验。使用前，将冻存细胞在37℃下快速解冻，并用20 mL细胞缓冲液（1× HBSS；20 mM HEPES，0.1% BSA）洗涤（900 rpm，5分钟）。将细胞重悬于检测缓冲液（细胞缓冲液加2 mM IBMX）中，并调整细胞密度至100万个细胞/mL。向1536孔微孔板中加入2 μL细胞悬液（最终每孔2000个细胞）和2 μL激动剂检测化合物。对于PAM检测，采用了两种检测方法，即：(a) 增强剂检测，使用1 μL不同剂量的化合物和1 μL固定浓度（EC20）的GLP1(9–36)NH2；(b) 移位检测，使用1 μL不同剂量的GLP1(9–36)NH2和1 μL浓度分别为10 μM和3 μM的化合物。将含有2 μL细胞和化合物的混合物在室温下孵育30分钟。
\n使用Cisbio公司（产品编号：62AM4PEC）的基于HTRF（均相时间分辨荧光）的试剂盒测定细胞中的cAMP含量。加入用裂解缓冲液（试剂盒组分）稀释的HTRF试剂后，将培养板孵育1小时，然后测量665/620 nm处的荧光比值。使用内部软件 Biost@t-Speed 2.0 HTS 版本，采用四参数逻辑模型计算剂量-反应结果。

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\n人胰岛β细胞系 1.1B4 中的 cAMP 刺激试验[3]
\n使用人胰岛β细胞系 1.1B4 进行 GLP-1(7–36)NH2、GLP-1(9–36)NH2 和测试化合物的体外细胞试验。GLP-1R 激活后，1.1B4 细胞内会积累环磷酸腺苷 (cAMP)。使用具有 HTRF 读数的商业免疫分析技术测量 cAMP 的生成。在这些实验中，所有用于定量 cAMP 的试剂均由试剂盒（法国 Cisbio 公司，产品编号 62AM4PEC）提供，并按照供应商提供的方案进行操作。本研究采用了两种检测方法，分别是：(a) 增强剂检测，使用化合物浓度-反应曲线，并固定 GLP1(9–36)NH2 浓度为 10 nM；(b) 移位检测，使用 GLP1(9–36)NH2 浓度-反应曲线，并固定化合物浓度为 1 μM。将 20,000 个细胞接种于 96 孔微孔板中。过夜培养后，洗涤细胞两次，然后将 GLP-1R 配体或测试化合物的系列稀释液（含或不含相应固定浓度的测试化合物或 GLP1(9–36)NH2）加入细胞中。与测试剂孵育 30 分钟后，裂解细胞，并按照制造商的说明进行 cAMP 测定。数据点通过测量 665 nm 和 620 nm 处的荧光强度获得，计算 665/620 nm 比值，并以相对于阴性对照 (0%) 和阳性对照 (100%) 的百分比表示。阴性对照为检测缓冲液（1× HBSS，0.1% BSA，1 mM IBMX），阳性对照为 GLP-1(7–36)NH2。浓度-效应结果使用内部软件 Biost@t-Speed 2.0 LTS 版，采用四参数逻辑模型进行计算。使用 SAS 9.1.3 版本中的 Marquardt 算法进行非线性回归调整。

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为了评估结合亲和力，使用 [¹²⁵I]-GLP-1 或一种新型放射性标记的小分子探针 [³H]-PF-06883365（预期与 Danuglipron (PF-06882961) 结合于同一口袋）进行竞争性结合实验。将表达人 GLP-1R 的 CHO 细胞膜与递增浓度的未标记 Danuglipron (PF-06882961) 和固定浓度的放射性配体孵育。使用 Cheng-Prusoff 方程计算抑制常数 (Ki)。 Danuglipron (PF-06882961) 对 [¹²⁵I]-GLP-1 的 Ki 值为 360 nM，对 [³H]-PF-06883365 的 Ki 值为 80 nM。[2] 我们解析了其结构类似物 (PF-06883365) 与人 GLP-1R 结合的低温电子显微镜 (cryo-EM) 结构。该复合物采用稳定的 GLP-1R 构建体（StaR® 技术）制备。结构显示，胞外结构域上的色氨酸 33 (W33) 移动约 14 Å 以封闭小分子结合口袋的顶部，而精氨酸 380 (R380) 与激动剂的羧酸取代基相互作用。该结构信息解释了物种选择性和结合模式。[2]

将稳定表达hGLP-1R-绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的HEK293细胞（40万个细胞/孔）接种于6孔板中培养一整天，然后用PF-06882961刺激30分钟。本实验采用1 μM的激动剂浓度，该浓度已被证实可诱导最大程度的内吞作用。为检测内吞过程的可逆性，将细胞置于特定孔中，用含0.1% BSA的PBS缓冲液洗涤三次，然后在37℃下继续孵育两小时。用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟后，用含0.1% BSA的PBS缓冲液清洗细胞三次。

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对于cAMP功能测定，将稳定表达人GLP-1R的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（高密度SA细胞系或低密度CS细胞系）接种于384孔板中。在有或无10 μM BETP（正向变构调节剂）的情况下，将细胞与测试化合物孵育30分钟。使用均相时间分辨荧光（HTRF）试剂盒测定cAMP水平。Danuglipron (PF-06882961)在不同浓度下进行测试，以生成剂量反应曲线和EC50值。 [2]
对于β-arrestin募集实验，使用表达人GLP-1R和β-arrestin2或β-arrestin1酶受体片段的CHO细胞（PathHunter技术）。将细胞与化合物孵育90分钟，加入底物后通过化学发光检测募集情况。计算EC50和Emax。[2]
对于受体内化研究，使用稳定表达荧光激活蛋白（FAP）标记的人GLP-1R的HEK293细胞。将细胞与化合物处理30分钟，然后使用FAP结合染料和酶标仪定量内化。对表达GFP标记的人GLP-1R的HEK293细胞进行共聚焦显微镜观察；细胞用Danuglipron (PF-06882961)处理30分钟，洗涤后恢复2小时进行成像。[2]
为了测试物种选择性，将表达人、猴、小鼠、大鼠、兔GLP-1R或突变受体（小鼠S33W、人W33S）的CHO细胞暴露于Danuglipron (PF-06882961)或GLP-1，并测量cAMP的积累。[2]

雄性食蟹猴
1 mg/kg、5 mg/kg、100 mg/kg
静脉注射、灌胃

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动物药代动力学研究[3]
本研究采用颈静脉/颈动脉双插管的雄性Wistar-Han大鼠（约250 g）和雄性食蟹猴（约7 kg）。动物禁食过夜，并在整个研究期间（1.0或2.0小时）禁食，但可自由饮水。 达格列酮以1 mg/mL的浓度溶于5:95 (v/v)聚乙二醇400/12% (w/v)磺丁基-β-环糊精水溶液或10:50:40 (v/v/v)二甲基亚砜/聚乙二醇400/水混合溶液中，通过尾静脉缓慢推注给药于大鼠（n = 4），或通过股静脉缓慢推注给药于猴子（n = 2），剂量为1.0 mg/kg，给药体积为1 mL/kg。分别于给药前以及给药后0.083、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、7.0和24小时采集系列血样。将达那格列酮的结晶性2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇（Tris）盐形式，以均质悬浮液的形式，通过灌胃法分别给予大鼠（5和100 mg/kg，10 mL/kg）和猴子[5 mg/kg（5.0 mL/kg）和100 mg/kg（10 mL/kg）]。悬浮液为2:98 (v/v) Tween 80/0.5% (w/v) 甲基纤维素A4M的蒸馏水混合物。在灌胃给药前采集血样，并在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、7和24小时采集系列血样。药代动力学研究中的血样经离心分离得到血浆。所有血浆样本均冷冻保存直至分析。对于大鼠和猴子的样本，将等分血浆（20–50 μL）转移至96孔板中，并在每个孔中加入含有维拉帕米（猴子）或特非那定（大鼠）作为内标的乙腈（150–200 μL）。将上清液在氮气下干燥，并用100 μL水复溶，无需蒸发。提取后，采用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析样本，并根据补充信息中所述的标准曲线插值法确定血浆中达那格列酮的浓度。

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临床前药代动力学参数的测定[3]
采用非房室模型分析法测定动物体内的药代动力学参数。在大鼠和猴子中，口服达格列酮后血浆中的最大血浆浓度 (Cmax) 直接从实验数据中确定，Tmax 定义为 Cmax 首次出现的时间。血浆浓度-时间曲线下面积（AUC0–∞）采用线性梯形法则估算。全身血浆清除率 (CLp) 计算为静脉给药剂量除以 AUC0–∞iv。末端速率常数 (kel) 通过对数线性浓度-时间曲线进行线性回归计算，末端消除半衰期 (t1/2) 计算为 0.693/kel。动物体内表观稳态分布容积 (Vdss) 计算为静脉或口服给药剂量除以 AUC0–∞ 与 kel 的乘积。动物口服给药的绝对生物利用度 (F) 采用公式 F = AUC0–∞po/AUC0–∞iv × doseiv/dosepo 计算。动物药理学研究中使用的详细方案见补充方法。

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在小鼠腹腔葡萄糖耐量试验 (IPGTT) 中，C57BL/6 小鼠禁食过夜，然后在腹腔注射葡萄糖负荷 (2 g/kg) 前 60 分钟皮下注射达那格列酮 (PF-06882961) (10 mg/kg) 或利拉鲁肽 (0.2 mg/kg)。在不同时间点测量血糖，并计算曲线下面积 (AUC)。[2]
在食蟹猴研究中，动物禁食过夜。对于静脉葡萄糖耐量试验 (IVGTT)，将达格列酮 (PF-06882961) 静脉输注至目标血清浓度（例如，总浓度 3.0 μM，游离浓度 55 nM），或口服给药（剂量未指定）。静脉注射葡萄糖（250 mg/kg，50% 溶液），并采集血样进行葡萄糖和胰岛素测定。计算葡萄糖清除率（K 值）。作为对照，皮下注射利拉鲁肽。[2]
在食物摄入量研究中，猴子每天口服一次达格列酮 (PF-06882961) 或赋形剂，持续 2 天，并测量食物摄入量。 [2]
在药代动力学研究中，对大鼠和猴子（每组n=2）分别静脉注射（剂量未指定）和口服达格列酮（PF-06882961）以确定其生物利用度。[2]
在人体I期研究（NCT03309241）中，健康成年受试者在空腹状态下（100 mg剂量组在进食状态下除外）单次口服达格列酮（PF-06882961）（3-300 mg）或安慰剂片剂。采集血样进行药代动力学和葡萄糖分析。[2]

在大鼠和猴子中，达那格列酮 (PF-06882961) 的口服生物利用度为低至中等，并呈剂量依赖性增加。[2] 在健康志愿者中，空腹单次口服 3 至 300 mg 后，血浆暴露量（AUCinf 和 Cmax）呈近似剂量比例增加。平均末端半衰期 (t½) 为 4.3 至 6.1 小时。达峰时间 (Tmax) 中位数为给药后 2.0 至 6.0 小时。[2] 当与食物同服（100 mg 剂量）时，暴露量 (AUCinf) 和半衰期与空腹状态相似，表明食物对药物动力学无显著影响。 [2]代谢稳定性：达那格列酮 (PF-06882961)在人肝微粒体和人肝细胞中显示出较低的固有清除率 (CLint)（未提供具体数值）。[2]亲脂性：PF-06882961 的 logD7.4 值未明确给出，但其含酸类似物的 logD7.4 值低至 2.3，表明其极性有所提高。[2]

体外 hERG（人醚-a-go-go 相关基因）通道抑制：达格列酮 (PF-06882961) 的 IC50 = 4.3 μM。[2]
在 I 期人体研究中，单次 3-300 mg 的剂量总体耐受性良好。未报告严重或重度不良事件，也未发生因不良事件导致的停药。最常见的治疗相关不良事件为恶心、呕吐和食欲下降，这与 GLP-1 受体激动剂的作用机制一致。与较低剂量或安慰剂相比，300 mg 剂量组报告不良事件的受试者比例更高。未报告低血糖事件，所有给药后血糖水平均保持在正常范围内。[2]
选择性：达格列酮 (PF-06882961) 对相关 B 类 GPCR 显示出良好的选择性（表 S9，未提供具体数值）。 [2]

[1]. Endocrinol Metab (Seoul). 2021 Feb;36(1):22-29

[2]. bioRxiv. 2020 Sep 30.

[3]. J Med Chem . 2022 Jun 23;65(12):8208-8226.

[4]. J Med Chem. 2020 Mar 12;63(5):2292-2307.

PF-06882961 正在临床试验 NCT03985293 中进行研究（一项为期 16 周的研究，旨在评估 PF-06882961 在 2 型糖尿病成人患者中的疗效和安全性）。

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达格列酮 (PF-06882961) 是一种非肽类小分子 GLP-1 受体激动剂，分子量为 555.6 g/mol。[1]
它表现出偏向性激动作用：是 cAMP/蛋白激酶 A (PKA) 通路的完全激动剂，也是 β-arrestin 通路的部分激动剂（对 β-arrestin 的募集具有部分活性）。[1][2]
该化合物的活性需要 GLP-1 受体胞外结构域上的色氨酸 33 (W33)，这是一个灵长类特异性残基。这解释了其在啮齿动物中缺乏活性，并使其具有物种选择性。[2]
临床开发：达那格列酮 (PF-06882961) 已完成一项 I 期首次人体试验 (NCT03309241)，结果显示其安全性、耐受性和降血糖作用。需要开展进一步研究以评估其对体重和心血管结局的长期疗效。[2]
类似物 (PF-06883365) 与 GLP-1R 结合的冷冻电镜结构显示，羧酸取代基与精氨酸 380 相互作用，而 W33 封闭了结合口袋的顶部，从而稳定了激动剂的构象。 [2]
与口服索玛鲁肽的比较：达格列酮（PF-06882961）无需渗透促进剂（SNAC），且给药不受食物影响，因此可能提供更方便的口服给药方案。[1][2]

C31H30FN5O4

555.599410533905

555.23

C, 67.01; H, 5.44; F, 3.42; N, 12.61; O, 11.52

2230198-02-2

2230198-02-2 (free acid); 2230198-03-3 (tris)

134611040

Off-white to light yellow solid powder

1.4

114Ų

1

9

9

41

941

1

C1CO[C@@H]1CN2C3=C(C=CC(=C3)C(=O)O)N=C2CN4CCC(CC4)C5=NC(=CC=C5)OCC6=C(C=C(C=C6)C#N)F

HYBAKUMPISVZQP-DEOSSOPVSA-N

InChI=1S/C31H30FN5O4/c32-25-14-20(16-33)4-5-23(25)19-41-30-3-1-2-26(35-30)21-8-11-36(12-9-21)18-29-34-27-7-6-22(31(38)39)15-28(27)37(29)17-24-10-13-40-24/h1-7,14-15,21,24H,8-13,17-19H2,(H,38,39)/t24-/m0/s1

2-[[4-[6-[(4-cyano-2-fluorophenyl)methoxy]pyridin-2-yl]piperidin-1-yl]methyl]-3-[[(2S)-oxetan-2-yl]methyl]benzimidazole-5-carboxylic acid

PF06882961; Danuglipron; PF 06882961; PF-06882961

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Ethanol: ~100 mg/mL
DMSO: ~10 mg/mL (~18 mM)