GLP-1 receptor

肽型GLP-1受体激动剂治疗2型糖尿病（T2DM）的成功促使我们寻找能够激活GLP-1受体（GLP-1R）的口服生物可利用小分子，作为T2DM的有效靶点。本文报道了一种基于3，4，5，6-四氢-1H-1，5-新氨基偶氮并[4，5-b]吲哚支架的有效和选择性的GLP-1R正变构调节剂（PAM）的发现和表征。由HTS对该系列的优化得到GLP-1R配体结合模型的支持。生物体外测试显示最佳化合物19具有良好的ADME和药理学特性。体内药代动力学和药理学研究的表征表明，在强效内源性配体GLP-1（7-36）NH2的活性低得多的内源性降解产物GLP1（9-36）NH2中，19激活GLP-1R作为阳性变构调节剂（PAM）。虽然这些数据表明了小分子GLP-1R-PAM治疗T2DM的潜力，但仍需要对临床候选药物进行进一步优化[2]。

胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的激动导致血糖降低和体重减轻，是治疗2型糖尿病（T2D）和肥胖的一种治疗策略。我们开发了一种口服小分子GLP-1R激动剂达努格立隆（PF-06882961），并在人源化小鼠模型中发现其与注射肽GLP-1R兴奋剂具有相当的疗效。然后，我们完成了一项安慰剂对照、随机、双盲、多次递增剂量的1期研究（NCT03538743），在该研究中，我们招募了98名服用背景二甲双胍的T2D患者，并将他们随机分组，在8个队列中接受多次递增剂量达努格立隆或安慰剂28天。主要结果是不良事件评估、安全实验室测试、生命体征和12导联心电图。大多数不良事件是轻微的，最常见的是恶心、消化不良和呕吐。各组间的实验室值均无临床意义的AE。在第28天，达努格立隆治疗后心率普遍升高，但未报告心率不良事件。与安慰剂相比，在第28天，达努列普隆治疗的收缩压略有下降，舒张压变化相似。没有临床意义的心电图检查结果。在T2D的这项研究中，达努格立隆通常耐受性良好，其安全性与GLP-1R激动剂的作用机制一致[4]。

生物分析。Min6 Ca2+动员测定[3]
将MIN6-c4细胞以每孔5×104个细胞的密度接种到黑色96孔板中，并在37°C和5%CO2下培养20-24小时。对于细胞负载，吸取培养上清液，并根据制造商的说明将100μL的测定缓冲液（Krebs–Ringer缓冲液，10mM HEPES，0.1%BSA，2.5mM葡萄糖）和等体积的钙6染料（FLIPR钙6测定试剂盒，Molecular Devices，R8191）溶解在同一缓冲液中，添加到每个孔中。将细胞在37°C/5%CO2下孵育70分钟，并在黑暗中在室温下再平衡10分钟。为了评估受试化合物对葡萄糖介导的细胞内Ca2+增加的影响，在FLIPR Tetra仪器（分子装置）上检测期间，每个孔添加50μL的含有75 mM葡萄糖（最终浓度为15 mM葡萄糖）和受试化合物或DMSO的测定缓冲液。对于低血糖对照，添加50μL不含额外葡萄糖的饥饿缓冲液，以将最终葡萄糖浓度保持在2.5 mM。通过计算3 s至372 s的荧光读数曲线下的面积来量化钙通量。

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稳定表达人GLP-1R的PSC-HEK293细胞系中的cAMP刺激测定[3]
使用解冻和使用冷冻细胞在1536孔板中进行GLP-1R激动剂和阳性变构调节剂的体外细胞测定。使用前，将冷冻细胞在37°C下快速解冻，并用20mL细胞缓冲液（1×HBSS；20mM HEPES，0.1%BSA）洗涤（在900rpm下5分钟）。将细胞重悬于测定缓冲液（细胞缓冲液加2mM IBMX）中，并将其调节至100万个细胞/mL的细胞密度。向1536孔微量滴定板中加入2μL细胞（最终2000个细胞/孔）和2μL化合物，用于激动剂测定。对于PAM测定，应用了两种测定形式，即（a）用1μL不同剂量的化合物和1μL固定浓度（EC20）的GLP1（9–36）NH2进行增强子测定，以及（b）用1µL不同剂量GLP1（9-16）NH2和1μL 10μM和3μM化合物进行移位测定。将含有2μL每个细胞和化合物的混合物在室温下孵育30分钟
使用来自Cisbio Corp.的试剂盒（目录号62AM4PEC）基于HTRF（均匀时间分辨荧光）测定细胞的cAMP含量。在加入在裂解缓冲液（试剂盒组分）中稀释的HTRF试剂后，将板温育1小时，然后测量665/620nm的荧光比。使用内部软件计算剂量-反应结果Biost@t-Speed2.0版HTS，使用四参数逻辑模型

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人胰腺β细胞系1.1B4中的cAMP刺激测定[3]
使用人胰腺β细胞系1.1B4进行GLP-1（7-36）NH2、GLP1（9-36）NH2和测试化合物的体外细胞测定。在GLP-1R激活后，1.1B4细胞积聚细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）。使用具有HTRF读数的商业免疫测定技术来测量环AMP的形成。在这些实验中，定量cAMP所需的所有试剂在试剂盒（目录号62AM4PEC，来自Cisbio Corp.，France）中提供，并根据供应商提供的方案应用。应用了两种测定形式，即（a）具有化合物浓度-反应曲线和固定浓度为10 nM的GLP1（9–36）NH2的增强子测定和（b）具有GLP1（9－36）NH2浓度-响应曲线和固定剂量为1μM的化合物的转移测定。20 000个细胞接种到96孔微量滴定板中。过夜培养后，将细胞洗涤两次，并将连续稀释的GLP-1R配体或试验化合物（含或不含各自固定浓度的试验化合物或GLP1（9–36）NH2）转移到细胞中。在与测试试剂孵育30分钟后，根据制造商的描述裂解细胞并制备用于cAMP测定。通过在665和620nm处的荧光测量、665/620nm比率的计算以及相对于阴性（0%）和阳性（100%）对照的效果百分比的表达来获得数据点。阴性对照为测定缓冲液（1×HBSS，0.1%BSA，1 mM IBMX），阳性对照为GLP-1（7-36）NH2。浓度-响应结果用内部软件计算Biost@t-Speed2.0版本LTS，使用四参数逻辑模型。使用SAS版本9.1.3中的Marquardt算法通过非线性回归获得调整。

稳定表达与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合的 hGLP-1R（400,000 个细胞/孔）的 HEK293 细胞在 6 孔板上生长一整天，然后用 PF-06882961 刺激半分钟。在这些研究中，使用的激动剂浓度为 1 μM，已被证明可引起最大内化。为了测试内吞过程的可逆性，将细胞置于特定的孔中，用含有0.1% BSA的PBS冲洗3次，然后在37°C下再孵育2小时。用4％多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟后，用含有0.1％BSA的PBS清洗细胞3次。

雄性食蟹猴
1 mg/kg、5 mg/kg、100 mg/kg
静脉注射、灌胃

[1]. 20th SCI/RSC Medicinal Chemistry Symposium.

[2]. Design, Synthesis, and Pharmacological Evaluation of Potent\nPositive Allosteric Modulators of the Glucagon-like Peptide-1 Receptor\n(GLP-1R). J Med Chem. 2020 Mar 12;63(5):2292-2307..

[3]. POSSIBLE SIDE EFFECTS AND RISKS OF THE STUDY DRUG AND PROCEDURES.

[4].Nat Med. 2021 Jun;27(6):1079-1087.

肽类GLP-1受体激动剂在治疗2型糖尿病（T2DM）方面的成功应用，促使我们寻找能够激活GLP-1受体（GLP-1R）的口服生物利用度高的小分子，GLP-1R是T2DM的一个已被充分验证的靶点。本文报道了一种基于3,4,5,6-四氢-1H-1,5-表亚氨基氮杂环辛并[4,5-b]吲哚骨架的高效选择性GLP-1R正向变构调节剂（PAM）的发现和表征。该系列化合物经高通量筛选（HTS）优化后，其性能优化得到了GLP-1R配体结合模型的支持。体外生物学测试表明，最佳化合物 19 具有良好的 ADME 和药理学特性。体内药代动力学和药理学研究表明，化合物 19 在活性低得多的内源性降解产物 GLP1(9-36)NH2（强效内源性配体 GLP-1(7-36)NH2 的产物）存在下，可作为正向变构调节剂 (PAM) 激活 GLP-1 受体。尽管这些数据表明小分子 GLP-1R PAM 在 2 型糖尿病 (T2DM) 治疗中具有潜力，但仍需进一步优化才能成为临床候选药物。[2] 激动胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP-1R) 可降低血糖和减轻体重，是治疗 2 型糖尿病 (T2D) 和肥胖症的一种治疗策略。我们研发了口服小分子GLP-1受体激动剂danuglipron（PF-06882961），并在人源化小鼠模型中发现其疗效与注射用肽类GLP-1受体激动剂相当。随后，我们完成了一项安慰剂对照、随机、双盲、多剂量递增的I期临床研究（NCT03538743）。该研究纳入了98例接受二甲双胍治疗的2型糖尿病患者，并将其随机分为8个队列，分别接受为期28天的多剂量递增danuglipron或安慰剂治疗。主要终点包括不良事件（AE）评估、安全性实验室检查、生命体征和12导联心电图。大多数不良事件为轻度，最常见的不良事件为恶心、消化不良和呕吐。各组实验室检查结果均未出现具有临床意义的不良事件。在第28天，达格列酮治疗组患者的心率普遍升高，但未报告心率相关不良事件。与安慰剂组相比，达格列酮治疗组患者的收缩压略有下降，舒张压的变化与安慰剂组相似。未发现具有临床意义的心电图异常。在这项针对2型糖尿病患者的研究中，达格列酮总体耐受性良好，其安全性与GLP-1受体激动剂的作用机制相符。[4]

C35H41FN6O7

676.7345

555.23

C, 62.12; H, 6.11; F, 2.81; N, 12.42; O, 16.55

2230198-03-3

2230198-02-2 (free acid);2230198-03-3 (tris);

154702463

Solid powder

200

5

13

12

49

995

1

C1CO[C@@H]1CN2C3=C(C=CC(=C3)C(=O)O)N=C2CN4CCC(CC4)C5=NC(=CC=C5)OCC6=C(C=C(C=C6)C#N)F.C(C(CO)(CO)N)O

JEJPAGACGZQFHN-JIDHJSLPSA-N

InChI=1S/C31H30FN5O4.C4H11NO3/c32-25-14-20(16-33)4-5-23(25)19-41-30-3-1-2-26(35-30)21-8-11-36(12-9-21)18-29-34-27-7-6-22(31(38)39)15-28(27)37(29)17-24-10-13-40-245-4(1-6,2-7)3-8/h1-7,14-15,21,24H,8-13,17-19H2,(H,38,39)6-8H,1-3,5H2/t24-/m0./s1

(S)-2-((4-(6-((4-cyano-2-fluorobenzyl)oxy)pyridin-2-yl)piperidin-1-yl)methyl)-1-(oxetan-2-ylmethyl)-1H-benzo[d]imidazole-6-carboxylic acid 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

PF-06882961 tris Danuglipron PF 06882961 PF06882961 PF-06882961 Tris salt

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: >10 mM

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。