GLP-1 receptor
PF-06882961 Tris targets the glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). GLP-1R is a G protein-coupled receptor that is activated by the incretin hormone GLP-1. GLP-1 is released from intestinal L-cells in response to food intake and stimulates insulin secretion from pancreatic β-cells, inhibits glucagon secretion, slows gastric emptying, and promotes satiety. GLP-1R is a well-validated target for the treatment of type 2 diabetes and obesity. PF-06882961 Tris is a positive allosteric modulator (PAM) of GLP-1R, meaning it binds to a site on the receptor that is distinct from the orthosteric binding site of GLP-1 and enhances the receptor's response to GLP-1. This allosteric modulation allows for oral bioavailability, which is a significant advantage over injectable peptide-based GLP-1R agonists.

肽类GLP-1受体激动剂在治疗2型糖尿病（T2DM）方面的成功应用，促使我们寻找能够激活GLP-1受体（GLP-1R）的口服生物利用度高的小分子，GLP-1R是T2DM的一个已被充分验证的靶点。本文报道了一种基于3,4,5,6-四氢-1H-1,5-表亚氨基氮杂环辛并[4,5-b]吲哚骨架的高效选择性GLP-1R正向变构调节剂（PAM）的发现和表征。该系列化合物经高通量筛选（HTS）优化后，其性能优化得到了GLP-1R配体结合模型的支持。体外生物学测试表明，最佳化合物 19 具有良好的 ADME 和药理学特性。体内药代动力学和药理学研究表明，化合物 19 在活性低得多的内源性降解产物 GLP1(9-36)NH2（强效内源性配体 GLP-1(7-36)NH2 的产物）存在下，可作为正向变构调节剂 (PAM) 激活 GLP-1R。尽管这些数据表明小分子 GLP-1R PAM 在 2 型糖尿病 (T2DM) 治疗中具有潜力，但仍需进一步优化以使其成为临床候选药物 [2]。
体外研究表明，PF-06882961 Tris 是一种强效且选择性的 GLP-1R 正向变构调节剂 (PAM)。该化合物是通过对一系列基于3,4,5,6-四氢-1H-1,5-表亚氨基氮杂环辛并[4,5-b]吲哚骨架的化合物进行优化而发现的，并得到了GLP-1R配体结合模型的支持。体外生物学测试表明该化合物具有良好的ADME和药理学特性。该化合物在活性低得多的内源性降解产物GLP-1(9-36)NH2存在的情况下仍能激活GLP-1R。这表明该化合物即使在GLP-1或其代谢物浓度很低的情况下也能增强其活性，这可能是其疗效的原因之一。该化合物良好的体外特性支持其进入体内研究阶段。

胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激动剂可降低血糖并减轻体重，是治疗2型糖尿病（T2D）和肥胖症的一种治疗策略。我们开发了一种口服小分子GLP-1R激动剂danuglipron（PF-06882961），并在人源化小鼠模型中发现其疗效与注射用肽类GLP-1R激动剂相当。随后，我们完成了一项安慰剂对照、随机、双盲、多剂量递增的I期临床研究（NCT03538743）。该研究纳入了98例接受二甲双胍治疗的T2D患者，并将其随机分为8个队列，分别接受为期28天的多剂量递增danuglipron或安慰剂治疗。主要终点包括不良事件（AE）评估、安全性实验室检查、生命体征和12导联心电图。大多数不良事件为轻度，最常见的不良事件为恶心、消化不良和呕吐。各组实验室检查值均未发现具有临床意义的不良事件。第28天接受达格列隆治疗的患者心率普遍升高，但未报告心率相关的不良事件。与安慰剂组相比，第28天接受达格列隆治疗的患者收缩压略有下降，舒张压变化相似。未发现具有临床意义的心电图异常。在本项针对2型糖尿病患者的研究中，达格列隆总体耐受性良好，其安全性与GLP-1R激动剂的作用机制一致[4]。
体内研究表明，PF-06882961 Tris在人源化小鼠模型中显示出疗效，其疗效与注射用肽类GLP-1R激动剂相当。一项 I 期临床试验 (NCT03538743) 已完成，该试验将 98 名接受二甲双胍治疗的 2 型糖尿病患者随机分为两组，分别接受达格列隆或安慰剂治疗，疗程为 28 天，剂量递增。主要终点包括不良事件 (AE) 评估、安全性实验室检查、生命体征和 12 导联心电图。大多数不良事件为轻度，其中最常见的为恶心、消化不良和呕吐。各组实验室检查结果均未出现具有临床意义的不良事件。达格列隆治疗组在第 28 天时心率普遍升高，但未报告心率相关的不良事件。收缩压略有下降。这些结果表明，PF-06882961 Tris 在人体中具有良好的耐受性和安全性。该化合物的疗效和安全性支持其作为 2 型糖尿病和肥胖症口服治疗药物的持续开发。

生物学检测。Min6 Ca2+ 动员检测[3]
将 MIN6-c4 细胞以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种于黑色 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 20–24 小时。细胞加样时，吸出培养上清液，并向每个孔中加入 100 μL 检测缓冲液（Krebs-Ringer 缓冲液，10 mM HEPES，0.1% BSA，2.5 mM 葡萄糖）和等体积的钙 6 染料（FLIPR 钙 6 检测试剂盒，Molecular Devices，R8191），该染料溶解于相同的缓冲液中，具体操作按照制造商的说明进行。细胞在 37 °C/5% CO2 条件下孵育 70 分钟，然后在室温下避光平衡 10 分钟。为了评估测试化合物对葡萄糖介导的细胞内Ca2+增加的影响，在FLIPR Tetra仪器（Molecular Devices公司）检测过程中，每个孔中加入50 μL含有75 mM葡萄糖（最终葡萄糖浓度为15 mM）和测试化合物或DMSO的检测缓冲液。对于低葡萄糖对照组，加入50 μL不含额外葡萄糖的饥饿缓冲液，使最终葡萄糖浓度保持在2.5 mM。通过计算3秒至372秒荧光读数曲线下的面积来量化钙离子流。

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稳定表达人GLP-1R的PSC-HEK293细胞系中的cAMP刺激试验[3]
使用即用型冻存细胞，在1536孔板中进行GLP-1R激动剂和正向变构调节剂的体外细胞试验。使用前，将冻存细胞在37℃下快速解冻，并用20 mL细胞缓冲液（1× HBSS；20 mM HEPES，0.1% BSA）洗涤（900 rpm，5分钟）。将细胞重悬于检测缓冲液（细胞缓冲液加2 mM IBMX）中，并调整细胞密度至100万个细胞/mL。向1536孔微孔板中加入2 μL细胞悬液（最终每孔2000个细胞）和2 μL激动剂检测化合物。对于PAM检测，采用了两种检测方法，即：(a) 增强剂检测，使用1 μL不同剂量的化合物和1 μL固定浓度（EC20）的GLP1(9–36)NH2；(b) 移位检测，使用1 μL不同剂量的GLP1(9–36)NH2和1 μL浓度分别为10 μM和3 μM的化合物。将含有2 μL细胞和化合物的混合物在室温下孵育30分钟。
使用Cisbio公司（产品编号：62AM4PEC）的基于HTRF（均相时间分辨荧光）的试剂盒测定细胞中的cAMP含量。加入用裂解缓冲液（试剂盒组分）稀释的HTRF试剂后，将反应板孵育1小时，然后测量665/620 nm处的荧光比值。使用内部软件 Biost@t-Speed 2.0 HTS 版本，采用四参数逻辑模型计算剂量-反应结果。

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人胰岛β细胞系 1.1B4 中的 cAMP 刺激试验[3]
使用人胰岛β细胞系 1.1B4 进行 GLP-1(7–36)NH2、GLP-1(9–36)NH2 和测试化合物的体外细胞试验。GLP-1R 激活后，1.1B4 细胞内会积累环磷酸腺苷 (cAMP)。使用具有 HTRF 读数的商业免疫分析技术测量 cAMP 的生成。在这些实验中，所有用于定量 cAMP 的试剂均由试剂盒（法国 Cisbio 公司，产品编号 62AM4PEC）提供，并按照供应商提供的方案进行操作。本研究采用了两种检测方法，分别是：(a) 增强剂检测，使用化合物浓度-反应曲线，并固定 GLP1(9–36)NH2 浓度为 10 nM；(b) 移位检测，使用 GLP1(9–36)NH2 浓度-反应曲线，并固定化合物浓度为 1 μM。将 20,000 个细胞接种于 96 孔微孔板中。过夜培养后，洗涤细胞两次，然后将 GLP-1R 配体或测试化合物的系列稀释液（含或不含相应固定浓度的测试化合物或 GLP1(9–36)NH2）加入细胞中。与测试剂孵育 30 分钟后，裂解细胞，并按照制造商的说明进行 cAMP 测定。数据点通过在 665 nm 和 620 nm 处进行荧光测量获得，计算 665/620 nm 比值，并以相对于阴性对照 (0%) 和阳性对照 (100%) 的效应百分比表示。阴性对照为检测缓冲液（1× HBSS，0.1% BSA，1 mM IBMX），阳性对照为 GLP-1(7–36)NH2。浓度-效应结果使用内部软件 Biost@t-Speed 2.0 LTS 版，采用四参数逻辑模型进行计算。使用 SAS 9.1.3 版中的 Marquardt 算法进行非线性回归调整。
PF-06882961 Tris 的体外检测通常涉及测量其激活 GLP-1R 的能力。这通常使用基于细胞的报告基因检测方法。使用表达 GLP-1R 和在 cAMP 反应元件 (CRE) 控制下的荧光素酶报告基因的细胞。将细胞用不同浓度的PF-06882961 Tris处理，同时加入或不加入亚最大浓度的GLP-1。GLP-1R的激活导致细胞内cAMP水平升高，进而激活CRE-荧光素酶报告基因。测量荧光素酶活性，并确定增强作用的EC₅₀值。也可以进行结合实验来测定化合物与GLP-1R的亲和力。这些实验通常使用放射性标记的GLP-1或通过表面等离子共振(SPR)技术，利用固定化的GLP-1R进行。

将稳定表达hGLP-1R-绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的HEK293细胞（40万个细胞/孔）接种于6孔板中培养一整天，然后用PF-06882961刺激30分钟。本实验采用1 μM的激动剂浓度，该浓度已被证实可诱导最大程度的内吞作用。为检测内吞过程的可逆性，将细胞置于特定孔中，用含0.1% BSA的PBS缓冲液洗涤三次，然后在37℃下继续孵育两小时。用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟后，用含0.1% BSA的PBS缓冲液清洗细胞三次。
对于体外细胞实验，PF-06882961 Tris对GLP-1R激活的影响通常使用表达GLP-1R的细胞系进行评估，例如稳定转染GLP-1R和CRE-荧光素酶报告基因的HEK293细胞。将细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的PF-06882961 Tris处理，同时加入或不加入亚最大浓度的GLP-1（例如10 nM）。孵育4-6小时后，裂解细胞并测定荧光素酶活性。根据剂量反应曲线确定增强作用的EC₅₀值。通过测试该化合物对一系列相关受体的活性，可以评估其对 GLP-1R 相对于其他受体的选择性。此外，还可以使用 cAMP ELISA 或均相时间分辨荧光 (HTRF) 测定法直接测量该化合物对 cAMP 生成的影响。

雄性食蟹猴
1 mg/kg、5 mg/kg、100 mg/kg
静脉注射、灌胃
在人源化小鼠模型中评估了PF-06882961 Tris的体内疗效。在该模型中，小鼠是人GLP-1R转基因小鼠。小鼠经口服不同剂量的PF-06882961 Tris治疗，并测量血糖水平。评估该化合物降低血糖的能力。同时监测体重。将该化合物的疗效与注射用肽类GLP-1R激动剂进行比较。该化合物还在一项I期人体临床试验中进行了评估。在该试验中，接受二甲双胍治疗的2型糖尿病患者被随机分配接受达格列隆或安慰剂，疗程为28天，剂量递增。测量了各种安全性和疗效指标，包括不良事件、生命体征、实验室检查和心电图。这些研究提供了有关该化合物体内疗效和安全性的关键数据。

PF-06882961 Tris 的药代动力学特性表明其具有口服生物利用度。该化合物口服后可被吸收并进入体循环。在 I 期临床试验中，该化合物采用口服给药。现有文献中未详细描述该化合物的半衰期、分布容积和清除率。然而，该化合物的口服生物利用度是其区别于注射用肽类 GLP-1R 激动剂的关键特征。该化合物的代谢可能涉及肝细胞色素 P450 酶。该化合物的排泄途径可能为肾脏和胆汁排泄。有关该化合物药代动力学特征的更多详细信息，请参阅临床试验出版物。

PF-06882961 Tris 的毒理学数据显示其总体耐受性良好。在 I 期临床试验中，大多数不良事件为轻度，最常见的不良事件为恶心、消化不良和呕吐。各组实验室检查结果均未发现具有临床意义的不良事件。达格列酮治疗 28 天后，心率普遍升高，但未报告心率相关的不良事件。收缩压略有下降。在大鼠研究中，该化合物在最高剂量水平下显示出轻度至中度的心脏损伤、中度至重度的胸腺损伤以及轻度至中度的胃溃疡。这些作用与 GLP-1 受体激动剂的药理学特征一致，并可能构成剂量限制因素。需要进一步的毒理学研究来全面评估该化合物的安全性。

[1]. 20th SCI/RSC Medicinal Chemistry Symposium.

[2]. Design, Synthesis, and Pharmacological Evaluation of Potent\nPositive Allosteric Modulators of the Glucagon-like Peptide-1 Receptor\n(GLP-1R). J Med Chem. 2020 Mar 12;63(5):2292-2307..

[3]. POSSIBLE SIDE EFFECTS AND RISKS OF THE STUDY DRUG AND PROCEDURES.

[4].Nat Med. 2021 Jun;27(6):1079-1087.

肽类GLP-1受体激动剂在2型糖尿病（T2DM）治疗中的成功应用，促使人们寻找具有高口服生物利用度且能够激活GLP-1受体（GLP-1R）的小分子药物，GLP-1R是T2DM的公认靶点。本文报道了一种基于3,4,5,6-四氢-1H-1,5-表亚氨基氮杂环辛烷[4,5-b]吲哚骨架的高效选择性GLP-1R正向变构调节剂（PAM）的发现和表征。通过高通量筛选（HTS）和GLP-1R配体结合模型，对该系列化合物的性能进行了优化。体外生物学实验表明，最佳化合物19具有良好的吸附-排泄（ADME）特性和药理学性质。体内药代动力学和药理学研究表明，化合物 19 可在活性低得多的内源性降解产物 GLP1(9-36)NH2（强效内源性配体 GLP-1(7-36)NH2 的产物）存在的情况下，作为正向变构调节剂 (PAM) 激活 GLP-1 受体。尽管这些数据表明小分子 GLP-1R PAM 在治疗 2 型糖尿病 (T2DM) 方面具有潜力，但在成为临床候选药物之前，仍需进一步优化。[2] 激活胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP-1R) 可降低血糖和减轻体重，这是治疗 2 型糖尿病 (T2D) 和肥胖症的一种策略。我们开发了一种口服小分子 GLP-1 受体激动剂达格列隆 (PF-06882961)，并发现其在人源化小鼠模型中的疗效与注射用肽类 GLP-1 受体激动剂相当。随后，我们完成了一项安慰剂对照、随机、双盲、多剂量递增的I期临床试验（NCT03538743）。该研究纳入了98例正在服用二甲双胍的2型糖尿病患者，并将他们随机分为8个队列，分别接受多剂量递增的达格列净或安慰剂治疗，疗程为28天。主要终点包括不良事件（AE）评估、安全性实验室检查、生命体征和12导联心电图。大多数不良事件为轻度，最常见的是恶心、消化不良和呕吐。所有实验室检查均未观察到具有临床意义的不良事件。第28天，达格列净组的心率普遍升高，但未报告与心率相关的不良事件。与安慰剂组相比，达格列净组的收缩压略低，而舒张压的变化与安慰剂组相似。未发现具有临床意义的心电图异常。在这项针对2型糖尿病患者的研究中，达格列净总体耐受性良好，其安全性与GLP-1受体激动剂的作用机制一致。[4] PF-06882961 Tris是一种口服生物利用度高的GLP-1R小分子变构激动剂，目前正在开发用于治疗2型糖尿病和肥胖症。它已完成I期临床试验，但尚未获准临床应用。

C35H41FN6O7

676.7345

555.23

C, 62.12; H, 6.11; F, 2.81; N, 12.42; O, 16.55

2230198-03-3

2230198-02-2 (free acid);2230198-03-3 (tris);

154702463

Solid powder

200

5

13

12

49

995

1

C1CO[C@@H]1CN2C3=C(C=CC(=C3)C(=O)O)N=C2CN4CCC(CC4)C5=NC(=CC=C5)OCC6=C(C=C(C=C6)C#N)F.C(C(CO)(CO)N)O

JEJPAGACGZQFHN-JIDHJSLPSA-N

InChI=1S/C31H30FN5O4.C4H11NO3/c32-25-14-20(16-33)4-5-23(25)19-41-30-3-1-2-26(35-30)21-8-11-36(12-9-21)18-29-34-27-7-6-22(31(38)39)15-28(27)37(29)17-24-10-13-40-245-4(1-6,2-7)3-8/h1-7,14-15,21,24H,8-13,17-19H2,(H,38,39)6-8H,1-3,5H2/t24-/m0./s1

(S)-2-((4-(6-((4-cyano-2-fluorobenzyl)oxy)pyridin-2-yl)piperidin-1-yl)methyl)-1-(oxetan-2-ylmethyl)-1H-benzo[d]imidazole-6-carboxylic acid 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

PF-06882961 tris Danuglipron PF 06882961 PF06882961 PF-06882961 Tris salt

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: >10 mM

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。