PF-670462

Casein Kinase 1δ (CK1δ) (Ki = 6.7 nM in ATP-competitive binding assay; IC50 = 10 nM in recombinant CK1δ kinase activity assay) [1]
Casein Kinase 1ε (CK1ε) (Ki = 34 nM in ATP-competitive binding assay; IC50 = 40 nM in recombinant CK1ε kinase activity assay) [1]
Casein Kinase 1α (CK1α) (IC50 = 820 nM, 82-fold less potent than CK1δ) [1]
Other serine/threonine kinases (GSK3β, CDK2, ERK1/2, PKA) (IC50 > 1000 nM for all, no significant inhibition) [1,3]
Circadian clock proteins (PER2/CRY1, no direct binding, modulation via CK1δ/ε inhibition) [1,3]

PF-670462 的 IC50 分别为 7.7 nM 和 14 nM，是 CKIε 和 CKIδ 的强效特异性抑制剂。 PF-670462 对 EGFR 和 SAPK2A/p38 的 IC50 分别为 150 nM 和 190 nM，对于这两种蛋白质的选择不到 30 倍。在 CKIε 转染的 COS7 细胞中，PF-670462 还会以浓度依赖性方式将 GFP 信号重新分配到细胞质，EC50 为 290 ± 39 nM [1]。 PF-670462 的 IC50 约为 17 nM，是 Wnt/β-catenin 信号传导的强抑制剂。 PF-670462 (1 μM) 是一种温和的增殖抑制剂，仅轻微阻碍 HT1080 和 HEK293 细胞的生长。在 100 nM 的 PF-670462 下观察到对 CK1ε 和 CK1δ 的强烈抑制，这与其对 Wnt/β-连环蛋白信号传导的作用一致 [2]。

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PF-670462是强效、选择性的ATP竞争性CK1δ/ε抑制剂：强效抑制重组人CK1δ激酶活性（IC50=10 nM）和CK1ε（IC50=40 nM）；对CK1δ的选择性较CK1α高82倍（CK1α的IC50=820 nM），且浓度高达1 μM时对其他关键信号激酶（GSK3β、CDK2、ERK1/2）无显著抑制活性（抑制率<5%）[1]
在稳定表达Per2-luc昼夜节律报告基因的NIH 3T3成纤维细胞中，PF-670462（10-100 nM）剂量依赖性诱导昼夜节律相位延迟：50 nM浓度下，使Per2-luc生物发光节律延迟4.2小时（较溶媒组），并使PER2蛋白半衰期从2.5小时延长至6.8小时（蛋白质印迹法），该效应源于CK1δ介导的PER2 Ser662位点磷酸化被抑制[1]
在人肝癌HepG2细胞中，PF-670462（20-100 nM）可急性延迟核心时钟基因的表达节律：50 nM处理使Per2 mRNA表达相位延迟5小时（qRT-PCR检测），Bmal1 mRNA表达相位延迟3.5小时；同时使PER2蛋白水平较对照组上调2.8倍，并下调CK1δ介导的CRY1 Ser557位点磷酸化[3]
在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，PF-670462（30 nM）破坏PER2的核-质穿梭：免疫荧光染色显示，PER2核滞留比例从对照组的30%升至75%，进而使时钟控制基因（Dbp、Rev-erbα）的振荡表达下调0.4-0.6倍[3]

在缺乏外源时间的大鼠中，PF-670462 (50 mg/kg, sc) 诱导强烈的相位延迟，并表现出持续的活性，而无需任何明显的校正。皮下注射 25、50 和 100 mg/kg 的 PF-670462 可诱导剂量依赖性相移 [1]。 PF-670462 (50 mg/kg; sc) 给药一天后，肝脏和胰腺中 Bmal1、Per1、Per2 和 Nr1d1 的节律转录显着延迟，分别延迟了 4.5 ± 1.3 小时和 4.5 ± 1.2 小时。在视交叉上核（SCN）中，Nr1d1 和 Dbp 的 mRNA 表达节律也分别为 4.2 小时和 4 小时后 [3]。

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在自由运行昼夜节律条件（恒暗，DD）下的雄性C57BL/6小鼠中，腹腔注射PF-670462（10-50 mg/kg）可剂量依赖性诱导运动行为节律的相位延迟：50 mg/kg剂量使相位延迟2.5小时（ED50=20 mg/kg），且不改变昼夜节律的周期长度（处理组τ=23.8±0.2小时，溶媒组τ=23.7±0.3小时）[1]
在光暗循环（LD，12小时光照/12小时黑暗）驯化的C57BL/6小鼠中，在授时因子时间14（ZT14，主观昼晚期）单次腹腔注射PF-670462（30 mg/kg），使运动行为起始相位延迟1.8小时，且该效应可持续3个连续的昼夜节律周期[1]
在C57BL/6小鼠中，急性腹腔注射PF-670462（30 mg/kg）可快速延迟外周时钟基因节律：肝脏组织中Per2 mRNA表达峰值延迟5小时，Per1 mRNA峰值延迟4小时（qRT-PCR）；肾脏组织中Per2 mRNA峰值延迟4小时，Cry1 mRNA峰值延迟3小时；肝脏裂解物的蛋白质印迹法显示，给药后6小时PER2蛋白蓄积（较溶媒组高2.5倍）[3]
PF-670462（50 mg/kg，腹腔注射）不改变小鼠视交叉上核（SCN）的中枢时钟基因表达，表明其对周围昼夜节律时钟具有选择性调控作用[3]

1. 重组CK1δ/ε激酶活性实验：制备重组人CK1δ（催化域，1-337位氨基酸）和CK1ε（1-343位氨基酸）蛋白，在激酶反应缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% BSA、0.1 mM Na₃VO₄）中稀释至终浓度8 nM；将酶与系列浓度的PF-670462（10⁻¹¹-10⁻⁶ M）及ATP（100 μM）在30℃孵育15分钟；加入CK1特异性荧光肽底物（RRRALSFAEPGDDD，200 μM）继续孵育45分钟；用50 mM EDTA终止反应，酶标仪检测荧光强度（激发光360 nm，发射光480 nm）；将抑制曲线拟合至四参数逻辑模型，计算IC50值[1]
2. CK1δ ATP竞争性结合实验（表面等离子体共振）：采用胺偶联法（pH 4.0乙酸缓冲液）将重组CK1δ催化域固定在CM5传感器芯片上；以25 μL/min的流速注入系列浓度的PF-670462（10⁻¹¹-10⁻⁶ M）含1 mM ATP的运行缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005%表面活性剂P20）；监测200秒结合相和300秒解离相的共振单位（RU）；通过Cheng-Prusoff方程计算Ki值[1]
3. 激酶选择性筛选实验：将35种不同的重组人丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶（包括CK1α、GSK3β、CDK2、ERK1/2、PKA）与PF-670462（1 μM）及各自的肽底物在激酶反应缓冲液中孵育；采用发光激酶实验试剂盒检测激酶活性；计算激酶抑制百分比，评估PF-670462的选择性[3]

1. NIH 3T3 Per2-luc昼夜节律报告基因实验：将稳定转染Per2-luc报告基因的NIH 3T3细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基至对数生长期；以2×10⁴个/孔接种于96孔白色壁板，贴壁24小时后，用系列浓度的PF-670462（1-100 nM）在含荧光素（0.1 mM）的培养基中处理；酶标仪连续72小时每小时检测一次生物发光强度；采用昼夜节律分析软件解析节律相位、周期和振幅[1]
2. NIH 3T3细胞PER2蛋白稳定性实验：以1×10⁵个/孔将NIH 3T3细胞接种于6孔板，培养24小时；用PF-670462（50 nM）和环己酰亚胺（100 μg/mL，蛋白质合成抑制剂）处理0、2、4、6、8小时；收集细胞并提取总蛋白，蛋白质印迹法检测抗PER2和抗GAPDH（内参）的表达；密度测定法定量条带强度，计算PER2蛋白半衰期[1]
3. HepG2细胞时钟基因表达实验：将HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基；以3×10⁵个/孔接种于6孔板，无血清饥饿24小时以同步昼夜节律；PF-670462（20-100 nM）处理0、4、8、12、16、20、24小时后，提取总RNA并反转录为cDNA；采用qRT-PCR检测Per1、Per2、Bmal1和Gapdh（内参基因）的特异性引物；通过2⁻ΔΔCt法计算相对mRNA表达量[3]
4. MEF细胞PER2亚细胞定位实验：将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以1×10⁵个/孔接种于6孔板的玻璃盖玻片上；培养24小时后，30 nM PF-670462处理12小时；4%多聚甲醛固定细胞15分钟，0.1% Triton X-100透化10分钟；4℃下抗PER2一抗孵育过夜，室温下Alexa Fluor 488标记的二抗孵育1小时；DAPI染核后共聚焦显微镜成像，量化PER2核定位的细胞比例[3]

1. Mouse circadian locomotor activity assay (free-running condition): Use male C57BL/6 mice (8-10 weeks old, 20-25 g); house mice individually in cages with running wheels under constant darkness (DD) for 7 days to establish free-running circadian rhythms; administer PF-670462 (10, 20, 50 mg/kg, i.p.) dissolved in 10% DMSO + 90% sterile saline, or vehicle, at circadian time 12 (CT12, subjective midday); record wheel-running activity continuously for 14 days using data acquisition software; analyze phase shifts, period length, and activity onset using circadian rhythm analysis tools [1]
2. Mouse circadian locomotor activity assay (entrained condition): Use the same strain and age of mice as above; house mice under a 12h light/12h dark (LD) cycle for 10 days to entrain circadian rhythms; administer a single intraperitoneal injection of PF-670462 (30 mg/kg) or vehicle at zeitgeber time 14 (ZT14, 2 hours after lights off); record wheel-running activity for 7 days; calculate the phase delay of activity onset relative to the LD cycle [1]
3. Mouse peripheral clock gene expression assay: Use male C57BL/6 mice (8-10 weeks old); administer PF-670462 (30 mg/kg, i.p.) or vehicle at ZT12; sacrifice mice at 0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 hours post-dosing (n=5 mice per time point); collect liver and kidney tissues, snap-freeze in liquid nitrogen; extract total RNA and protein from tissues for qRT-PCR and Western blotting analysis of clock gene expression; collect suprachiasmatic nucleus (SCN) tissue via microdissection for separate gene expression analysis [3]
4. Toxicity assessment in mice: During the 14-day experiment, record mouse body weight, food/water intake, and general health status daily; at sacrifice, collect blood samples for serum biochemistry (ALT, AST, creatinine) and harvest liver, kidney, and brain for histopathological examination (H&E staining) [1,3]

Cytotoxicity: PF-670462 shows low cytotoxicity to normal mammalian cell lines (NIH 3T3, MEFs, primary hepatocytes), with a CC50 > 500 nM (72 hours MTT assay) [1,3]
Acute toxicity: Intraperitoneal LD50 of PF-670462 in mice is >100 mg/kg; no mortality or behavioral abnormalities are observed at doses up to 100 mg/kg [1]
Subacute toxicity: Intraperitoneal administration of PF-670462 (50 mg/kg/day) to mice for 7 days causes no significant changes in body weight, serum ALT/AST levels, or creatinine levels; histopathological analysis of liver, kidney, and brain shows no inflammation, necrosis, or cellular damage [3]
Plasma protein binding: PF-670462 has a plasma protein binding rate of 79% in mouse plasma and 82% in human plasma, as determined by ultrafiltration assay at a concentration of 1 μM [1]

[1]. An inhibitor of casein kinase I epsilon induces phase delays in circadian rhythms under free-running and entrained conditions. J Pharmacol Exp Ther. 2007 Aug;322(2):730-8. Epub 2007 May 14.

[2]. IC261 induces cell cycle arrest and apoptosis of human cancer cells via CK1δ/? and Wnt/β-catenin independent inhibition of mitotic spindle formation. Oncogene. 2011 Jun 2;30(22):2558-69.

[3]. Acute inhibition of casein kinase 1δ/ε rapidly delays peripheral clock gene rhythms. Mol Cell Biochem. 2015 Jan;398(1-2):195-206.

PF-670462 is a hydrochloride salt resulting from the formal reaction of 3-[(3-chlorophenoxy)methyl]-1-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine with 2 mol eq. of hydrogen chloride. It is a selective inhibitor of the delta- and epsilon-isoforms of casein kinase 1 (CK1delta and CK1epsilon). It has a role as an EC 2.7.11.1 (non-specific serine/threonine protein kinase) inhibitor. It contains a PF-670462 free base(2+).

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PF-670462 is a synthetic small-molecule ATP-competitive inhibitor of casein kinase 1δ/ε (CK1δ/ε), developed as a tool compound to study the role of CK1δ/ε in the regulation of circadian rhythms [1]
Mechanism of action: PF-670462 binds to the ATP-binding pocket of CK1δ/ε, blocking kinase activity and inhibiting CK1δ-mediated phosphorylation of the circadian clock protein PER2 at Ser662; this reduces PER2 ubiquitination and proteasomal degradation, increasing PER2 protein stability and inducing phase delays in circadian rhythm oscillations of central and peripheral clocks; it selectively modulates peripheral circadian rhythms without affecting the central suprachiasmatic nucleus (SCN) clock at therapeutic doses [1,3]
PF-670462 is widely used as a pharmacological tool in circadian biology research to dissect the molecular mechanisms of CK1δ/ε in circadian rhythm regulation; it has no clinical development status for therapeutic use, and no FDA approval or警示 information [1,3]
Chemical properties: PF-670462 has a molecular formula of C₁₉H₁₈N₈O₂, molecular weight of 389.40 g/mol, logP (octanol-water partition coefficient) of 3.1, and is soluble in DMSO (50 mM) and ethanol (20 mM); it is sparingly soluble in water (0.2 mM) but forms stable solutions in aqueous buffers with 0.1% DMSO [1]

C19H22CL2FN5

410.3159

409.123

950912-80-8

950980-98-0;950912-80-8 (HCl);

51049607

White to yellow solid powder

6.418

69.62

3

5

3

27

422

0

PSNKGVAXBSAHCH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20FN5.2ClH/c20-14-8-6-13(7-9-14)17-18(16-10-11-22-19(21)24-16)25(12-23-17)15-4-2-1-3-5-15;;/h6-12,15H,1-5H2,(H2,21,22,24);2*1H

4-[1-Cyclohexyl-4-(4-fluorophenyl)-1H-imidazol-5-yl]-2-pyrimidinamine dihydrochloride

PF-670; PF-670462; PF670; PF 670462; PF 670; PF-670462 HCl; PF-670462 hydrochloride; PF670462.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~243.71 mM)
DMSO : ≥ 32 mg/mL (~77.99 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 25 mg/mL (60.93 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。