PHA-665752

c-Met (IC50 = 9 nM); RON (IC50 = 68 nM); Flk1 (IC50 = 200 nM)

体外活性：PHA-665752 显着抑制 c-Met 激酶活性，Ki 为 4 nM，与各种酪氨酸和丝氨酸-苏氨酸激酶相比，对 c-Met 的选择性高出 50 倍以上。 PHA-665752 有效抑制 HGF 刺激的 c-Met 自磷酸化，IC50 为 25-50 nM。 PHA-665752 还显着阻断 HGF 和 c-Met 依赖性功能，例如细胞运动和细胞增殖，IC50 分别为 40-50 nM 和 18-42 nM。此外，PHA-665752 还可有效抑制多种肿瘤细胞系中 HGF 刺激的 c-Met 下游介质（例如 Gab-1、ERK、Akt、STAT3、PLC-γ 和 FAK）的组成型磷酸化。 PHA-665752 抑制 TPR-MET 转化的 BaF3 细胞的细胞生长，IC50 <60 nM，并在 0.2 μM 时抑制组成型细胞运动和迁移达 92.5%。 PHA665752 (0.2 μM) 抑制 c-Met 还会诱导 33.1% 的细胞凋亡和 G1 细胞周期停滞，处于 G1 期的细胞从 42.4% 增加到 77.0%。 PHA665752可以与雷帕霉素配合抑制TPR-MET转化的BaF3细胞和非小细胞肺癌H441细胞的细胞生长。激酶测定：c-Met 激酶结构域 GST 融合蛋白用于 c-Met 测定。 PHA-665752 抑制 c-Met 的 IC50 值基于 ATP 和二价阳离子（MgCl2 或 MnCl2 10-20 mM）存在下激酶肽底物或聚谷氨酸的磷酸化。确定c-Met的线性范围（即速率保持等于初始速率的时间段），并在此范围内进行动力学测量和IC50测定。细胞测定：对于增殖测定，细胞（S114、GTL-16、NCI-H441 和 BxPC-3）在含有 0.1% FBS 的培养基中生长 48 小时，然后用不同浓度的 HGF 中的 PHA-665752 处理（ 50 ng/mL）在含有 2% FBS 的培养基中。 18小时后，将细胞与BrdUrd一起孵育1小时，固定，并用抗BrdUrd过氧化物酶缀合抗体染色，并在630 nm处读取板的读数。对于细胞凋亡测定，细胞在存在和不存在 HGF (50 ng/mL) 和不同浓度的 PHA-665752 的情况下在含有 2% FBS 的培养基中生长 72 小时。 72小时后，加入含有溴化乙锭和吖啶橙的混合物，通过荧光显微镜对凋亡细胞（亮橙色细胞或细胞碎片）进行计数。

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c-Met受体酪氨酸激酶及其配体肝细胞生长因子（HGF）与多种人类癌症的发展和进展有关，是癌症治疗的有吸引力的靶点。PHA-665752被鉴定为c-Met激酶（K（i）4 nM）催化活性的小分子ATP竞争性活性位点抑制剂。与一组不同的酪氨酸和丝氨酸苏氨酸激酶相比，PHA-665752对c-Met的选择性也超过50倍。在细胞研究中，PHA-665752能有效抑制HGF刺激和组成型c-Met磷酸化，以及HGF和c-Met驱动的表型，如细胞生长（增殖和存活）、细胞运动、侵袭和/或各种肿瘤细胞的形态。此外，PHA-665752以与给定肿瘤细胞的表型反应相关的模式抑制多个肿瘤细胞系中HGF刺激的c-Met下游信号转导介体的组成性磷酸化，包括Gab-1、细胞外调节激酶、Akt、信号转导子和转录激活子3、磷脂酶cγ和粘着斑激酶。[1]

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PHA665752特异性抑制BaF3中的细胞生长。TPR-MET细胞（IC（50）<0.06微摩尔/升）诱导凋亡和细胞周期阻滞。BaF3的组成细胞运动和迁移。TPR-MET细胞也受到抑制。PHA665752抑制TPR-MET的特异性磷酸化以及雷帕霉素途径哺乳动物靶点下游靶点的磷酸化。当与PHA665752结合时，雷帕霉素显示出协同抑制BaF3生长的作用。TPR-MET和c-MET表达的H441 NSCLC细胞。 结论：PHA665752是一种有效的小分子选择性c-MET抑制剂，对TPR MET转化的细胞具有高度的生物活性和生化活性。PHA665752对H441 NSCLC细胞也有活性。c-MET抑制剂可以与雷帕霉素协同治疗非小细胞肺癌，这种组合对表达c-MET的癌症的体内研究是值得的。[2]

PHA-665752 的给药剂量为 7.5、15 和 30 mg/kg/天时，可分别诱导 S114 异种移植物剂量依赖性肿瘤生长抑制 20%、39% 和 68%。 PHA665752 治疗可显着降低小鼠异种移植物中 NCI-H69、NCI-H441 和 A549 的肿瘤生长，分别达 99%、75% 和 59%。由于减少血管内皮生长因子的产生并增加血管生成抑制剂血小板反应蛋白-1 的产生，PHA665752 还可显着抑制血管生成 >85%。

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c-Met受体酪氨酸激酶正在成为包括癌症在内的许多实体瘤的新靶点。PHA-665752被鉴定为c-Met激酶催化活性的ATP竞争性小分子抑制剂。在此，我们发现用PHA666552治疗小鼠异种移植物中的NCI-H69（小细胞肺癌癌症）和NCI-H441（非小细胞肺癌癌症）致瘤性分别降低了99%和75%。通过小鼠肿瘤的磁共振成像也观察到肿瘤大小的减小。PHA6665752抑制来源于非小细胞肺癌癌症细胞系（NCI-H441和A549）和小细胞肺癌癌症细胞系（NC I-H69）的小鼠异种移植物中自磷酸化和c-Cbl结合位点的c-Met磷酸化。PHA665752在所有上述细胞系中也抑制了血管生成>85%，并引起了血管生成转换，导致血管内皮生长因子的产生减少，血管生成抑制剂凝血酶敏感蛋白-1的产生增加。这些研究表明了用ATP竞争性小分子抑制剂选择性靶向c-Met的可行性，并表明PHA6665752可能为癌症提供一种新的治疗方法。[3]

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在体内研究中，单剂量PHA-665752抑制肿瘤异种移植物中的c-Met磷酸化长达12小时。在耐受良好的剂量下，c-Met磷酸化的抑制与重复给药方案中剂量依赖性的肿瘤生长抑制/生长延迟有关。有趣的是，在胃癌异种移植物模型中证明了强大的细胞还原活性。总的来说，这些结果证明了用ATP竞争性小分子选择性靶向c-Met的可行性，并表明了靶向c-Met在人类癌症中的治疗潜力[1]。

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c-Met 测定使用含有 c-Met 激酶结构域的 GST 融合蛋白。基于 ATP 和二价阳离子（MgCl₂ 或 MnCl₂ 10–20 mM）存在下激酶肽底物或聚谷氨酸的磷酸化，PHA-测定了 665752 抑制 c-Met 的 IC50 值。对于c-Met，建立线性范围（即速率保持等于初始速率的持续时间），并在此范围内进行动力学测量和IC50计算。

细胞在 0.1% FBS 培养基中生长 48 小时以进行增殖测定。然后，在含有 2% FBS 的培养基中用不同浓度的 HGF 中的 PHA-665752 (50 ng/mL) 处理细胞。 18 小时后，固定细胞，用抗 BrdUrd 过氧化物酶偶联抗体染色，然后与 BrdUrd 一起孵育 1 小时。然后在 630 nm 处读取板。细胞在含有或不含 HGF (50 ng/mL) 和不同浓度的 PHA-665752 的 2% FBS 培养基中生长 72 小时，以进行细胞凋亡测定。 72小时后，加入含有吖啶橙和溴化乙锭的混合物，用荧光显微镜计数凋亡细胞（亮橙色细胞或细胞碎片）的数量。

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测定PHA665752处理对TPR MET转化细胞的细胞生长、运动和迁移、凋亡和细胞周期阻滞的影响。此外，还测定了PHA665752对MET及其下游效应器p-AKT和p-S6K磷酸化的影响。最后，在PHA665752和雷帕霉素存在下测试TPR-MET转化细胞的生长。H441非小细胞癌症（NSCLC）细胞（具有活化的c-Met）也针对PHA666552和雷帕霉素进行了测试[2]。

Female athymic mice (nu/nu) bearing S114 or GTL-16 tumor xenografts
~30 mg/kg/day
Injection via bolus i.v.

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Treatment of Nude Mice for Studying the Effect of c-Met Tyrosine Kinase Inhibitors on Tumorigenicity and Immunohistochemistry of Tumors[3]
NCI-H441, A549, and NCI-H69 cells were cultured and harvested with trypsin/EDTA. The viability of these cells was determined by trypan blue and only cell populations with 90% or greater viability were used for this investigation. The tumorigenicity of these lung cancer cells was determined by intradermally injecting 5 × 106 viable cells in balanced salt solution into the flank or leg region of nude mice to produce s.c. tumors. Once daily intratumoral injections of PHA665752, were given 8 days after the lung cancer cells were injected when tumors were visible. One group of animals was given PHA665752 (16.5 μg in 100 μL of 2% DMSO) and group 2 was injected with diluent (2% DMSO) alone. The mice were euthanized at the indicated times and tumors were measured with calipers, fixed in 4% formalin, embedded in paraffin, and stained with H&E.[3]
Immunohistochemical staining of tumors was done using monoclonal antibodies against CD31, VEGF, TSP-1, and phosphospecific antibodies to c-Met pY1230/1234/1235 and pY1003. The immunostaining procedures used have been previously described by Ma et al. Appropriate negative controls for the immunostaining were prepared by omitting the primary antibody step and substituting it with nonimmune rabbit serum. To estimate the number of blood vessels in tumors before and after treatment, 10 microscopic fields were counted at 20× magnification and the number of blood vessels were evaluated. All of the slides were reviewed and scored by two investigators independently.[3]

[1]. Cancer Res . 2003 Nov 1;63(21):7345-55.

[2]. Clin Cancer Res . 2005 Mar 15;11(6):2312-9.

[3]. Cancer Res . 2007 Apr 15;67(8):3529-34.

PHA-665752 is a member of the class of indolones that is 1,3-dihydro-2H-indol-2-one which is substituted by a (2,6-dichlorobenzyl)sulfonyl group at position 5 and by a (1H-pyrrol-2-yl)methylidene group at position 2, the pyrrole ring of which is substituted by methyl groups at positions 3 and 5, and by a [2-(pyrrolidin-1-ylmethyl)pyrrolidin-1-yl]carbonyl group at position 4 (the Z,R isomer). It has a role as a c-Met tyrosine kinase inhibitor and an antineoplastic agent. It is a member of indolones, a pyrrolecarboxamide, a N-acylpyrrolidine, a sulfone, a dichlorobenzene, an enamide, a secondary carboxamide and a tertiary carboxamide.

C32H34CL2N4O4S

641.61

640.167

C, 59.90; H, 5.34; Cl, 11.05; N, 8.73; O, 9.97; S, 5.00

477575-56-7

10461815

Yellow to orange solid powder

1.4±0.1 g/cm3

890.2±65.0 °C at 760 mmHg

492.2±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.656

4

110.96

2

5

7

43

1180

1

ClC1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1C([H])([H])S(C1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])/C(/C(N2[H])=O)=C(\[H])/C1=C(C([H])([H])[H])C(=C(C([H])([H])[H])N1[H])C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@]1([H])C([H])([H])N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O)(=O)=O)Cl

OYONTEXKYJZFHA-SSHUPFPWSA-N

InChI=1S/C32H34Cl2N4O4S/c1-19-29(35-20(2)30(19)32(40)38-14-6-7-21(38)17-37-12-3-4-13-37)16-24-23-15-22(10-11-28(23)36-31(24)39)43(41,42)18-25-26(33)8-5-9-27(25)34/h5,8-11,15-16,21,35H,3-4,6-7,12-14,17-18H2,1-2H3,(H,36,39)/b24-16-/t21-/m1/s1

(3Z)-5-[(2,6-dichlorophenyl)methylsulfonyl]-3-[[3,5-dimethyl-4-[(2R)-2-(pyrrolidin-1-ylmethyl)pyrrolidine-1-carbonyl]-1H-pyrrol-2-yl]methylidene]-1H-indol-2-one

PHA-665752; PHA665752; PHA-665752 hydrate; TCMDC-125885; UNII-0VXU5T5R3J; (R,Z)-5-((2,6-dichlorobenzyl)sulfonyl)-3-((3,5-dimethyl-4-(2-(pyrrolidin-1-ylmethyl)pyrrolidine-1-carbonyl)-1H-pyrrol-2-yl)methylene)indolin-2-one; PHA 665752

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (3.90 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+castor oil: 5 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。