PHA-793887

Cdk5/p25 (IC50 = 5 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 8 nM); CDK2/cyclinE (IC50 = 8 nM); CDK7/cyclin H (IC50 = 10 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 60 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 62 nM); CDK9/cyclinT1 (IC50 = 138 nM); GSK-3β (IC50 = 79 nM)

体外活性：PHA-793887 对 CDK1、CDK4、CDK9 和 GSK3β 具有低活性，IC50 分别为 60 nM、62 nM、138 nM 和 79 nM。 PHA-793887 抑制许多肿瘤细胞系的细胞增殖，包括 A2780、HCT-116、COLO-205、C-433、DU-145、A375、PC3、MCF-7 和 BX-PC3，IC50 为 88 nM– 3.4μM。 PHA-793887 (1 μM) 显示 A2780 细胞中 S 期减少，随后 G1 期增加，G2/M 期略有积累。 PHA-793887 (3 μM) 显着增加 G2/M 期并减少 DNA 合成。 PHA-793887 对白血病细胞系（包括 K562、KU812、KCL22 和 TOM1）具有细胞毒性，IC50 为 0.3–7 μM，但对正常未刺激的外周血单核细胞或 CD34+ 造血干细胞没有细胞毒性。在集落测定中，PHA-793887 对白血病细胞系表现出非常高的活性，IC50 小于 0.1 μM。 PHA-793887 诱导细胞周期停滞，抑制 Rb 和核磷蛋白磷酸化，并在 0.2−1 μM 浓度下调节细胞周期蛋白 E 和 cdc6 表达，并在 5 μM 浓度下诱导细胞凋亡。激酶测定：化合物的生化活性通过与特定酶和底物一起孵育，然后对磷酸化产物进行定量来确定。 PHA-793887 (1.5 nM–10 μM) 在 ATP/33P-γ-ATP 混合物、底物和特定酶 (0.7−100 nM) 存在的情况下在室温下孵育 30−90 分钟，最终体积为30 μL 激酶缓冲液，使用 96 U 底板。温育后，停止反应，并使用 SPA 珠、Dowex 树脂或 Multiscreen 磷酸纤维素过滤器将磷酸化底物与未掺入的放射性 ATP 分离，如下所示： (1) 对于 SPA 测定。通过添加 100 μL PBS + 32 mM EDTA + 0.1% Triton X-100 + 500 μM ATP（含有 1 mg 链霉亲和素包被的 SPA 珠）来终止反应。孵育 20 分钟进行底物捕获后，将 100 μL 反应混合物转移至含有 100 μL 5 M CsCl 的 Optiplate 96 孔板中，静置 4 小时以使珠子分层到板的顶部，并使用 TopCount 进行计数以测量底物掺入的磷酸盐。 (2) 用于 Dowex 树脂测定。添加 150 μL 树脂/甲酸盐（pH 3.00）以停止反应并捕获未反应的 33P-γ-ATP，将其与溶液中的磷酸化底物分离。静置 60 分钟后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板中。添加 150 μL Microscint 40 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。 (3) 用于多屏分析。添加 10 μL EDTA (150 mM) 终止反应。将 100 μL 的量转移至 MultiScreen 板，以使底物与磷酸纤维素滤膜结合。然后用经过 MultiScreen 过滤系统过滤的 100 μL H2PO4 (75 mM) 将板洗涤 3 次，并干燥。添加 100 μL Microscint 0 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。 IC50值通过非线性回归分析获得。细胞测定：将 A2780 细胞以每 cm2 1 × 104 至 3 × 104 的终浓度接种到 96 或 384 孔板中。 24 小时后，使用 PHA-793887 的系列稀释液处理细胞。处理后 72 小时，使用 CellTiter-Glo 测定法评估细胞数量。 IC50 值使用对称曲线拟合计算。

PHA-793887 (10–30 mg/kg) 在人卵巢 A2780、结肠 HCT-116 和胰腺 BX-PC3 癌异种移植模型中显示出良好的疗效。 PHA-793887 (20 mg/kg) 对 K562 和 HL60 细胞的异种移植模型、原发性白血病播散模型以及源自复发性费城阳性急性淋巴细胞白血病患者的高负荷播散 ALL-2 模型有效。

将化合物与特定的酶和底物一起孵育后，对磷酸化产物进行定量以确定该化合物的生化活性。 PHA-793887 (1.5 nM–10 μM) 在室温下孵育 30−90 分钟，最终体积为 30 μL 激酶缓冲液、底物和特定酶 (0.7−100 nM)。所用板材为96U底板。温育后停止反应，并使用Dowex树脂、SPA珠或Multiscreen磷酸纤维素过滤器以下述方式将磷酸化底物与未掺入的放射性ATP分离： (1)关于SPA测定。将 1 毫克链霉亲和素包被的 SPA 珠添加到 100 微升 PBS + 32 毫克 EDTA + 0.1% Triton X-100 + 500 微克 ATP 中以终止反应。经过 20 分钟的底物捕获孵育期后，将 100 微升反应混合物倒入含有 100 微升 5 M CsCl 的 96 孔 Optiplate 板中。然后将板静置四小时，使珠子分层到板的顶部，并使用 TopCount 测量底物掺入的磷酸盐的量。 (2) 关于 Dowex 树脂测定。为了停止反应并提取未反应的 ³³P-γ-ATP 并将其与溶液中的磷酸化底物分离，添加 150 μL 树脂/甲酸盐（pH 3.00）。休息 60 分钟后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板。添加 150 μL Microscint 40 后，使用 TopCount 测量放射性。(3) 关于多屏测定。添加 10 μL 150 mM EDTA 终止反应。为了使底物能够与磷酸纤维素滤膜结合，将 100 μL 添加到 MultiScreen 板中。之后，将板干燥并用 100 μL H₂PO₄ (75 mM) 清洗 3 次。添加 100 μL Microscint 0 后，使用 TopCount 测量放射性。通过非线性回归分析，得出IC50值。

为了进行细胞毒性测定，使用阿拉玛蓝活体染料。对每个细胞系进行初步剂量反应曲线以确定细胞浓度范围并提供与荧光的线性关系。对于细胞系，将 200 μL 完全培养基接种到含有 5,000-20,000 个细胞的 96 孔板中，增加或不增加药物剂量 (0.01-10 μM)。将 10 × 10⁵ 细胞/孔置于 StemSpanSFEM 培养基中，并使用与 ALL-2 和 AML-PS 白血病相同的药物浓度范围进行处理。使用脐带血 CD34+ 细胞和外周血单核细胞制备 1 × 10⁵ 细胞/孔的板。使用或不使用 1 μg/mL 植物血凝素或生长因子混合物处理细胞，其中包括 50 ng/mL 干细胞因子、20 ng/mL 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素 3、白介素-6 和 3 U/mL 促红细胞生成素。所有情况均涉及添加 1/10 体积的阿拉玛蓝溶液并在 48 小时培养后孵育过夜。然后，使用 535 nm 激发和 590 nm 发射，在荧光计中读取板的读数。当减去不存在细胞的背景荧光时，荧光相对于未处理对照的百分比用于计算细胞毒性。

SCID mice receive a subcutaneous inoculation with 10⁷ HL60 and K562 cells. Seven mice per group are randomly assigned to the animals. In the HL60 model, PHA-793887 is given intravenously (IV) once daily at a dose of 20 mg/kg for ten days, from day 9 to day 18, and in two 5-day cycles (day 9 to day 13 and day 17 to day 21) in K562-bearing mice. Starting on day 9, Glivec is given orally for nine days in a row in the K562 xenograft model. Twice a week, net body weight and tumor growth are assessed. Tumor weight = length (mm) × width² (mm) /2 is the formula used to calculate the weight of the tumor. The anticancer treatment's impact is measured by how long it takes for tumors to begin growing exponentially. The difference between the median time (in days) needed for the tumors in the treatment group (T) and the control group (C) to reach a predetermined size is known as the delay (T − C value). The reduction in body weight is the basis for evaluating toxicity.

[1]. Transcriptional analysis of an E2F gene signature as a biomarker of activity of the cyclin-dependent kinase inhibitor PHA-793887 in tumor and skin biopsies from a phase I clinical study. Mol Cancer Ther. 2010 May;9(5):1265-73.

[2]. A first in man, phase I dose-escalation study of PHA-793887, an inhibitor of multiple cyclin-dependent kinases (CDK2, 1 and 4) reveals unexpected hepatotoxicity in patients with solid tumors. Cell Cycle. 2011 Mar 15;10(6):963-70. Epub 2011 Mar 15.

[3]. Therapeutic efficacy of the pan-cdk inhibitor PHA-793887 in vitro and in vivo in engraftment and high-burden leukemia models. Exp Hematol. 2010 Apr;38(4):259-269.e2.

[4]. Optimization of 6,6-dimethyl pyrrolo[3,4-c]pyrazoles: Identification of PHA-793887, a potent CDK inhibitor suitable for intravenous dosing. Bioorg Med Chem. 2010 Mar 1;18(5):1844-53.

N-[6,6-dimethyl-5-[(1-methyl-4-piperidinyl)-oxomethyl]-1,4-dihydropyrrolo[3,4-c]pyrazol-3-yl]-3-methylbutanamide is a piperidinecarboxamide.
PHA-793887 has been used in trials studying the treatment of Advanced/Metastatic Solid Tumors.

C19H31N5O2

361.48

361.247

C, 63.13; H, 8.64; N, 19.37; O, 8.85

718630-59-2

718630-60-5 (HCl);718630-59-2;

46191454

White Solid powder

1.2±0.1 g/cm3

596.2±50.0 °C at 760 mmHg

314.4±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.573

1.79

84.82

2

4

4

26

542

0

O=C(C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H])N1C([H])([H])C2C(N([H])C(C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)=NN([H])C=2C1(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H]

HUXYBQXJVXOMKX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H31N5O2/c1-12(2)10-15(25)20-17-14-11-24(19(3,4)16(14)21-22-17)18(26)13-6-8-23(5)9-7-13/h12-13H,6-11H2,1-5H3,(H2,20,21,22,25)

N-[6,6-dimethyl-5-(1-methylpiperidine-4-carbonyl)-1,4-dihydropyrrolo[3,4-c]pyrazol-3-yl]-3-methylbutanamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 30% Propylene glycol , 5% Tween 80 , 65% D5W: 15 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。