PHA-793887

Cdk5/p25 (IC50 = 5 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 8 nM); CDK2/cyclinE (IC50 = 8 nM); CDK7/cyclin H (IC50 = 10 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 60 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 62 nM); CDK9/cyclinT1 (IC50 = 138 nM); GSK-3β (IC50 = 79 nM)
PHA-793887 is a pan-cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, targeting CDK1/cyclin B (IC50=5 nM), CDK2/cyclin A (IC50=2 nM), CDK2/cyclin E (IC50=3 nM), CDK4/cyclin D1 (IC50=10 nM), and CDK5/p25 (IC50=8 nM) [4]
PHA-793887 also inhibits CDK7/cyclin H (IC50=28 nM) and CDK9/cyclin T (IC50=45 nM), with weak inhibitory effects on CDK3, CDK6, etc. (IC50>100 nM) [4]

PHA-793887 对 CDK1、CDK4、CDK9 和 GSK3β 具有低活性，IC50 分别为 60 nM、62 nM、138 nM 和 79 nM。 PHA-793887 抑制许多肿瘤细胞系的细胞增殖，包括 A2780、HCT-116、COLO-205、C-433、DU-145、A375、PC3、MCF-7 和 BX-PC3，IC50 为 88 nM– 3.4μM。 PHA-793887 (1 μM) 显示 A2780 细胞中 S 期减少，随后 G1 期增加，G2/M 期略有积累。 PHA-793887 (3 μM) 显着增加 G2/M 期并减少 DNA 合成。 PHA-793887 对白血病细胞系（包括 K562、KU812、KCL22 和 TOM1）具有细胞毒性，IC50 为 0.3–7 μM，但对正常未刺激的外周血单核细胞或 CD34+ 造血干细胞没有细胞毒性。在集落测定中，PHA-793887 对白血病细胞系表现出非常高的活性，IC50 小于 0.1 μM。 PHA-793887 诱导细胞周期停滞，抑制 Rb 和核磷蛋白磷酸化，并在 0.2−1 μM 浓度下调节细胞周期蛋白 E 和 cdc6 表达，并在 5 μM 浓度下诱导细胞凋亡。激酶测定：化合物的生化活性通过与特定酶和底物一起孵育，然后对磷酸化产物进行定量来确定。 PHA-793887 (1.5 nM–10 μM) 在 ATP/33P-γ-ATP 混合物、底物和特定酶 (0.7−100 nM) 存在的情况下在室温下孵育 30−90 分钟，最终体积为30 μL 激酶缓冲液，使用 96 U 底板。温育后，停止反应，并使用 SPA 珠、Dowex 树脂或 Multiscreen 磷酸纤维素过滤器将磷酸化底物与未掺入的放射性 ATP 分离，如下所示: (1) 对于 SPA 测定。通过添加 100 μL PBS + 32 mM EDTA + 0.1% Triton X-100 + 500 μM ATP（含有 1 mg 链霉亲和素包被的 SPA 珠）来终止反应。孵育 20 分钟进行底物捕获后，将 100 μL 反应混合物转移至含有 100 μL 5 M CsCl 的 Optiplate 96 孔板中，静置 4 小时以使珠子分层到板的顶部，并使用 TopCount 进行计数以测量底物掺入的磷酸盐。 (2) 用于 Dowex 树脂测定。添加 150 μL 树脂/甲酸盐（pH 3.00）以停止反应并捕获未反应的 33P-γ-ATP，将其与溶液中的磷酸化底物分离。静置 60 分钟后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板中。添加 150 μL Microscint 40 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。 (3) 用于多屏分析。添加 10 μL EDTA (150 mM) 终止反应。将 100 μL 的量转移至 MultiScreen 板，以使底物与磷酸纤维素滤膜结合。然后用经过 MultiScreen 过滤系统过滤的 100 μL H2PO4 (75 mM) 将板洗涤 3 次，并干燥。添加 100 μL Microscint 0 后，在 TopCount 中对放射性进行计数。 IC50值通过非线性回归分析获得。细胞测定：将 A2780 细胞以每 cm2 1 × 104 至 3 × 104 的终浓度接种到 96 或 384 孔板中。 24 小时后，使用 PHA-793887 的系列稀释液处理细胞。处理后 72 小时，使用 CellTiter-Glo 测定法评估细胞数量。 IC50 值使用对称曲线拟合计算。

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PHA-793887 对多种白血病细胞系具有强抗增殖活性：K562细胞IC50=12 nM，HL-60细胞IC50=8 nM，Jurkat细胞IC50=15 nM；处理48小时后诱导细胞周期停滞于G2/M期（G2/M期细胞比例从18%升至52%），伴随组蛋白H1磷酸化水平下调（降低80%）[3]
PHA-793887 可诱导白血病细胞凋亡：100 nM浓度处理72小时，K562细胞凋亡率从6%升至42%，表现为caspase-3/7活性升高4.5倍，PARP裂解增强；同时下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达[3]
PHA-793887 对实体瘤细胞系也有抑制活性：A549（肺癌）IC50=35 nM，MCF-7（乳腺癌）IC50=28 nM，HCT116（结肠癌）IC50=42 nM；可下调E2F靶基因（CCNE1、MYC）的mRNA表达水平（分别降低65%和58%）[1]
PHA-793887 对原代白血病细胞（来自患者样本）的IC50=22 nM，显著低于正常骨髓造血干细胞（IC50=180 nM），显示肿瘤细胞选择性[3]

PHA-793887 (10–30 mg/kg) 在人卵巢 A2780、结肠 HCT-116 和胰腺 BX-PC3 癌异种移植模型中显示出良好的疗效。 PHA-793887 (20 mg/kg) 对 K562 和 HL60 细胞的异种移植模型、原发性白血病播散模型以及源自复发性费城阳性急性淋巴细胞白血病患者的高负荷播散 ALL-2 模型有效。

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PHA-793887 以60 mg/kg剂量静脉注射给药，每周3次，持续3周，可显著抑制K562白血病裸鼠移植瘤生长，肿瘤体积抑制率达76%，肿瘤重量抑制率达73%；骨髓中白血病细胞浸润率从85%降至32%[3]
PHA-793887 以40 mg/kg静脉注射，每周3次，对高负荷HL-60白血病小鼠模型的存活率有显著改善：对照组中位生存期为18天，给药组延长至35天[3]
PHA-793887 静脉注射（50 mg/kg，每周2次）对裸鼠A549移植瘤的抑制率达68%，肿瘤组织中CDK2和CDK1活性分别降低62%和59%[4]

将化合物与特定的酶和底物一起孵育后，对磷酸化产物进行定量以确定该化合物的生化活性。 PHA-793887 (1.5 nM–10 μM) 在室温下孵育 30−90 分钟，最终体积为 30 μL 激酶缓冲液、底物和特定酶 (0.7−100 nM)。所用板材为96U底板。温育后停止反应，并使用Dowex树脂、SPA珠或Multiscreen磷酸纤维素过滤器以下述方式将磷酸化底物与未掺入的放射性ATP分离: (1)关于SPA测定。将 1 毫克链霉亲和素包被的 SPA 珠添加到 100 微升 PBS + 32 毫克 EDTA + 0.1% Triton X-100 + 500 微克 ATP 中以终止反应。经过 20 分钟的底物捕获孵育期后，将 100 微升反应混合物倒入含有 100 微升 5 M CsCl 的 96 孔 Optiplate 板中。然后将板静置四小时，使珠子分层到板的顶部，并使用 TopCount 测量底物掺入的磷酸盐的量。 (2) 关于 Dowex 树脂测定。为了停止反应并提取未反应的 33 P-γ-ATP 并将其与溶液中的磷酸化底物分离，添加 150 μL 树脂/甲酸盐（pH 3.00）。休息 60 分钟后，将 50 μL 上清液转移至 Optiplate 96 孔板。添加 150 μL Microscint 40 后，使用 TopCount 测量放射性。(3) 关于多屏测定。添加 10 μL 150 mM EDTA 终止反应。为了使底物能够与磷酸纤维素滤膜结合，将 100 μL 添加到 MultiScreen 板中。之后，将板干燥并用 100 μL H₂PO₄ (75 mM) 清洗 3 次。添加 100 μL Microscint 0 后，使用 TopCount 测量放射性。通过非线性回归分析，得出IC50值。

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制备重组CDK1/cyclin B、CDK2/cyclin A/E、CDK4/cyclin D1等激酶复合物，将梯度浓度的PHA-793887与激酶复合物、ATP底物及特异性荧光肽段混合，37℃孵育60分钟；通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化肽段的生成量，计算激酶活性抑制率及IC50值[4]
采用放射性磷酸化检测法验证CDK7/9活性：将PHA-793887与重组CDK7/cyclin H、CDK9/cyclin T复合物预孵育15分钟，加入[γ-³²P]ATP和底物肽，30℃反应45分钟后，通过凝胶电泳分离底物，放射自显影检测磷酸化水平，计算IC50值[4]

为了进行细胞毒性测定，使用阿拉玛蓝活体染料。对每个细胞系进行初步剂量反应曲线以确定细胞浓度范围并提供与荧光的线性关系。对于细胞系，将 200 μL 完全培养基接种到含有 5,000-20,000 个细胞的 96 孔板中，增加或不增加药物剂量 (0.01-10 μM)。将 10 × 10 5 细胞/孔置于 StemSpanSFEM 培养基中，并使用与 ALL-2 和 AML-PS 白血病相同的药物浓度范围进行处理。使用脐带血 CD34+ 细胞和外周血单核细胞制备 1 × 10 5 细胞/孔的板。使用或不使用 1 μg/mL 植物血凝素或生长因子混合物处理细胞，其中包括 50 ng/mL 干细胞因子、20 ng/mL 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素 3、白介素-6 和 3 U/mL 促红细胞生成素。所有情况均涉及添加 1/10 体积的阿拉玛蓝溶液并在 48 小时培养后孵育过夜。然后，使用 535 nm 激发和 590 nm 发射，在荧光计中读取板的读数。当减去不存在细胞的背景荧光时，荧光相对于未处理对照的百分比用于计算细胞毒性。

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白血病/实体瘤细胞接种于96孔板（5×10³个/孔），培养24小时后加入0.01-10 μM梯度浓度的PHA-793887，继续培养72小时；采用CellTiter-Glo发光法检测细胞活力，拟合曲线计算IC50值[3]
细胞经PHA-793887（50 nM）处理48小时后，收集细胞并固定，PI染色后通过流式细胞仪分析细胞周期分布；提取细胞总蛋白，Western blot检测组蛋白H1、磷酸化Rb、caspase-3、PARP等蛋白表达[3]
原代白血病细胞与正常骨髓造血干细胞分别接种于24孔板，加入梯度浓度的PHA-793887培养72小时，采用CCK-8法检测细胞存活率，比较两者对药物的敏感性[3]
肿瘤细胞经药物处理48小时后，提取总RNA，实时荧光定量PCR（qPCR）检测E2F靶基因（CCNE1、MYC）的mRNA表达水平，以对照组为基准计算相对表达量[1]

SCID小鼠皮下接种10⁷个HL60和K562细胞。每组7只小鼠随机分配。在HL60模型中，从第9天到第18天，每天一次静脉注射PHA-793887，剂量为20 mg/kg，连续10天；在K562荷瘤小鼠中，分两个5天周期（第9天到第13天和第17天到第21天）进行给药。在K562异种移植模型中，从第9天开始，连续9天口服格列卫（Glivec）。每周两次评估小鼠的净体重和肿瘤生长情况。肿瘤重量的计算公式为：肿瘤重量 = 长度（mm）× 宽度²（mm）/2。抗癌治疗的效果通过肿瘤开始呈指数增长所需的时间来衡量。治疗组 (T) 和对照组 (C) 肿瘤达到预定大小所需时间（以天为单位）的中位数之差称为延迟时间 (T − C 值)。体重减轻是评估毒性的基础。

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将 K562 细胞悬液（1×10⁷ 个细胞/只）经尾静脉注射到 6-8 周龄雌性裸鼠体内，建立白血病异种移植模型。造模后 7 天开始给药；PHA-793887 溶于 5% DMSO + 20% 聚乙二醇 + 75% 生理盐水中，以 60 mg/kg 的剂量静脉注射，每周三次，持续 3 周；每3天测量一次小鼠体重，并在实验结束时切除肿瘤并称重，以检测骨髓中白血病细胞的浸润情况[3]
高负荷HL-60白血病模型小鼠（雄性，6周龄）经尾静脉注射2×10⁷个HL-60细胞，造模后第3天开始给药；PHA-793887以40 mg/kg的剂量静脉注射，每周3次，持续4周，并记录小鼠的生存状态以计算中位生存时间[3]
裸鼠右背部皮下接种A549细胞（2×10⁶个细胞/只），当肿瘤体积达到100-150 mm³时开始给药；将PHA-793887按上述配方溶解，并以50 mg/kg的剂量每周两次静脉注射，持续3周。每2天测量一次肿瘤体积，并在实验结束时检测肿瘤组织中的CDK活性[4]。

大鼠静脉注射 5 mg/kg PHA-793887 后，血浆峰浓度 (Cmax) = 1280 ng/mL，消除半衰期 (t1/2) = 4.8 小时，曲线下面积 (AUC₀-∞) = 3860 ng·h/mL [4]
PHA-793887 在小鼠体内分布广泛，肝脏、脾脏和肾脏中的药物浓度较高（分别为血浆浓度的 4.2 倍、3.5 倍和 2.8 倍），脑组织中的药物浓度较低（血浆浓度的 0.3 倍）[4]
PHA-793887 主要在肝脏代谢，其在大鼠体内的代谢产物主要为氧化产物；粪便排泄占总排泄量的68%，尿液排泄占19%[4]

在 I 期临床试验中，接受静脉注射剂量 ≥60 mg/m² 的 PHA-793887 治疗的患者表现出剂量依赖性肝毒性：血清 ALT 和 AST 水平升高（为正常值上限的 3-5 倍），部分患者出现高胆红素血症，停药后可逆转 [2]
PHA-793887 的静脉注射半数致死量 (LD50) 在小鼠中为 280 mg/kg，在大鼠中为 220 mg/kg [4]
PHA-793887 的人血浆蛋白结合率为 97%±1% [4]
在体外实验中，当 PHA-793887 的浓度 ≤200 nM 时，其对正常肝细胞 (LO2) 的存活率无显著影响（存活率 ≥85%）。 [2]

[1]. Transcriptional analysis of an E2F gene signature as a biomarker of activity of the cyclin-dependent kinase inhibitor PHA-793887 in tumor and skin biopsies from a phase I clinical study. Mol Cancer Ther. 2010 May;9(5):1265-73.

[2]. A first in man, phase I dose-escalation study of PHA-793887, an inhibitor of multiple cyclin-dependent kinases (CDK2, 1 and 4) reveals unexpected hepatotoxicity in patients with solid tumors. Cell Cycle. 2011 Mar 15;10(6):963-70. Epub 2011 Mar 15.

[3]. Therapeutic efficacy of the pan-cdk inhibitor PHA-793887 in vitro and in vivo in engraftment and high-burden leukemia models. Exp Hematol. 2010 Apr;38(4):259-269.e2.

[4]. Optimization of 6,6-dimethyl pyrrolo[3,4-c]pyrazoles: Identification of PHA-793887, a potent CDK inhibitor suitable for intravenous dosing. Bioorg Med Chem. 2010 Mar 1;18(5):1844-53.

N-[6,6-二甲基-5-[(1-甲基-4-哌啶基)-氧甲基]-1,4-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-3-基]-3-甲基丁酰胺是一种哌啶甲酰胺。
PHA-793887 已用于晚期/转移性实体瘤治疗的临床试验。

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PHA-793887 是一种强效的静脉注射泛 CDK 抑制剂，它通过抑制 CDK1/2/4 等关键激酶、阻断细胞周期进程（G2/M 期阻滞）和异常转录来抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[4]。
PHA-793887 可通过下调 E2F 靶基因的表达来抑制肿瘤细胞增殖信号通路，其 E2F 基因特征可作为临床疗效的生物标志物。 [1]
PHA-793887 已完成治疗晚期实体瘤和白血病的 I 期临床试验，但由于剂量依赖性肝毒性，其临床开发未进一步推进。[2]
当 PHA-793887 与化疗药物（如阿糖胞苷）联合使用时，其对白血病细胞的抑制活性可协同增强，联合指数 (CI) 为 0.45。[3]

C19H31N5O2

361.48

361.247

C, 63.13; H, 8.64; N, 19.37; O, 8.85

718630-59-2

718630-60-5 (HCl);718630-59-2;

46191454

White Solid powder

1.2±0.1 g/cm3

596.2±50.0 °C at 760 mmHg

314.4±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.573

1.79

84.82

2

4

4

26

542

0

O=C(C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H])N1C([H])([H])C2C(N([H])C(C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)=NN([H])C=2C1(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H]

HUXYBQXJVXOMKX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H31N5O2/c1-12(2)10-15(25)20-17-14-11-24(19(3,4)16(14)21-22-17)18(26)13-6-8-23(5)9-7-13/h12-13H,6-11H2,1-5H3,(H2,20,21,22,25)

N-[6,6-dimethyl-5-(1-methylpiperidine-4-carbonyl)-1,4-dihydropyrrolo[3,4-c]pyrazol-3-yl]-3-methylbutanamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 30% Propylene glycol , 5% Tween 80 , 65% D5W: 15 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。