Piclamilast   中文名称: 吡拉米司特

PDE4 (IC50 = 16 nM in pig aorta); PDE4 (IC50 = 2 nM in eosinophil soluble); PDE1 (IC50 = >100 μM); PDE2 (IC50 = 40 μM); PDE3 (IC50 = >100 μM); PDE5 (IC50 = 14 μM)

Piclamilast（RP 73401，1 μM，30 分钟）磷酸化 c-Jun Ser63 并激活 AP-1，从而显着阻止 23 个基因的改变 [2]。对于 PDE1、PDE2、PDE3 和 PDE5[2] 的 RT-PCR，请使用 Piclamilast(RP 73401)。

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目的：活性氧（ROS）参与了许多炎症性疾病的发病机制，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）。它们可以通过激活转录因子，包括NF-κB和激活蛋白1 (AP-1)，来改变参与细胞损伤的基因的表达。在体内和体外COPD模型中，磷酸二酯酶4 （PDE4）抑制剂具有抗炎和抗氧化作用。本研究分析了PDE4选择性抑制剂Piclamilast对暴露于H(2)O(2)的A549细胞中全局基因表达谱的调节作用。
主要方法：采用高密度Affymetrix微阵列分析基因表达变化，RT-PCR验证。用BrdU掺入法研究细胞增殖。采用膜联蛋白v -异硫氰酸荧光素流式细胞术检测细胞凋亡。ELISA法检测C-Jun磷酸化水平，荧光素酶法检测AP-1活化水平。
关键发现：我们的研究结果表明，H(2)O(2)修饰了几个与凋亡、细胞周期控制和细胞信号传导相关的基因的表达，包括IL8、FAS、HIG2、CXCL2、CDKN25和JUNB。Piclamilast预处理通过AP-1激活和c-Jun Ser63磷酸化的机制显著抑制了23个基因的变化。功能实验证实了我们的结果，提出了与PDE4抑制剂抗氧化性能相关的新靶点。
意义：这是首次在全球基因表达水平上证明选择性PDE4抑制剂的抗氧化作用的研究，结果支持AP-1作为参与上皮细胞对氧化损伤的炎症反应的基因表达的关键调节因子的重要性。[2]

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N-（3,5-二氯吡啶-4-酰基）-3-环戊氧基-4-甲氧基苯甲酰胺（Piclamilast）抑制磷酸二酯酶IV，可增强全反式维甲酸（ATRA）、维甲酸受体α (rar α)或维甲酸受体X激动剂在NB4和其他类维甲酸敏感的髓性白血病细胞类型中诱导的髓细胞分化。耐atra NB4。R2细胞对Piclamilast和视黄酸受体X激动剂也有部分反应。用piclamilast或ATRA处理NB4细胞可激活cAMP信号通路和cAMP依赖性蛋白激酶的核易位。这导致camp响应元件结合蛋白磷酸化的短暂增加，随后是系统的下调。ATRA + piclamilast对cAMP通路的调节无加性作用，其联合作用对cAMP调控基因具有复杂的影响。Piclamilast通过camp依赖性蛋白激酶依赖性磷酸化增强配体依赖性的反激活和rar α的降解。在pml - rar α的情况下也观察到增强的交互激活。在NB4细胞中，增加的反活化可能是髓细胞成熟增强和许多类视黄酮依赖基因表达增强的基础。Piclamilast和/或ATRA对两种参与髓细胞成熟的转录因子cEBP和STAT1的表达有重要影响。STAT1的诱导和激活与细胞分化的增强直接相关。最后，ERK和cAMP靶蛋白Epac不参与ATRA + Piclamilast激活的成熟程序。[3]

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选择化合物（3ab,ag,kg）与RP73401对高亲和力罗利普兰结合位点的亲和力进行了研究，并与呕吐效应进行了比较（表3）。3ab,ag，kg对高亲和力罗利普兰结合位点的亲和力比RP73401低（Ki值（nM）： 3ab 6.2, 3ag 3.5, 3kg 2.6, Piclamilast/RP73401 0.85）。值得注意的是，3kg显示出结合亲和力的Ki值与PDE4抑制的IC50值之间的最大差距（比值= 0.050），这可能意味着迄今为止报道的PDE4抑制剂之间的治疗比率有所提高。[4]

在白化动物中，Piclamilast（RP 73401，10 mg/kg，30 分钟）不会改变其自身写入的 MST。在白化动物中，piclamilast 加 ATRA 比单独使用 ATRA 更有效地增加 MST（40 天；间隔 34-45 天）[3]。

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Piclamilast + ATRA的体内活性为了评估Piclamilast对ATRA细胞分化活性的增强作用是否有治疗作用，我们将NB4细胞腹腔移植于SCID小鼠。动物分别接受载药、ATRA、Piclamilast和这两种化合物的联合治疗，并评估其生存情况。图11为各实验组动物的Kaplan-Meier生存曲线。给药动物的MST为27天（间隔24-30天）。Piclamilast不影响白血病动物的MST(25天；间隔20-26天)。正如预期的那样，ATRA对动物的存活有显著影响，使MST增加到37天（根据Cox回归模型，间隔为33-42天，p < 0.0001）。Piclamilast + ATRA在提高MST (40 d；间隔34-45天)。这意味着在ATRA的情况下，与使用运载工具治疗的动物相比，寿命增加了37%，在ATRA + piclamilast的情况下，寿命增加了48%。在任何实验组中，我们都没有观察到显示主要全身性毒性的迹象，例如治疗相关的致死率或显著的体重减轻。[3]

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Antispasmogenic活性。[3]
我们根据PDE4抑制效力（IC50 < 3 nM）选择了10种化合物，以评估它们对麻醉豚鼠抗原诱导的支气管收缩（iv）和组胺诱导的支气管收缩（id）的抑制能力。选择Piclamilast作为参比化合物（ED50 = 0.033 mg/kg）进行抗原应答，iv；0.20 mg/kg组胺反应，id)。在具有等效PDE4抑制作用的3af−ah中，3ag对静脉给药抗原诱导的支气管收缩表现出最好的抑制活性（ED50 (mg/kg): 3af 0.18, 3ag 0.022, 3ah 0.17），对心率的影响最小（表2）。3ab，kg对静脉给药抗原反应也具有良好的抗痉挛活性，ED50值分别为0.12和0.063 mg/kg。3-羟甲基类似物18lg显示出非常弱的抗原反应降低（1 mg/kg， iv降低33%），尽管18lg具有与3,4-双（羟甲基）类似物3ag相同的PDE4抑制活性（IC50 = 0.70 nM）。为了评估心血管副作用，我们同时研究了所选化合物对心率的影响，并证实3ab、ag、kg在静脉注射剂量为0.1 mg/kg时（分别为0、1和3次/分钟），心率几乎没有增加。在组胺诱导的支气管收缩模型中，化合物3kg具有最有效的抗痉挛活性（ED50 = 0.033 mg/kg, id），且活性高于Piclamilast/RP73401 （ED50 = 0.20 mg/kg, id）。关于3kg抗痉挛活性的更详细信息将在其他地方发表。

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高亲和力罗利普兰结合位点的亲和力和催吐作用。[3]
我们最终根据抗痉挛活性选择了三种化合物（3ab,ag,kg），用于评估雪貂和狗的吐痰作用以及对高亲和力罗利普兰结合位点的亲和力。如表3所示，3ab、ag、kg在剂量为10或30 mg/kg时均未引起呕吐作用，而Piclamilast/RP73401在剂量为3 mg/kg时明显引起呕吐。以0.3 mg/kg的剂量静脉注射匹拉米司特时，狗的呕吐效果也明显弱于匹拉米司特/RP73401 (3kg， 8只试验动物均无呕吐；RP73401, 8只试验动物中6只出现呕吐)。

生物方法。[4]
磷酸二酯酶同工酶的分离。对Reeves et al. 13的方法进行了改进，以分离PDE同工酶。简单地说，用戊巴比妥杀死雄性豚鼠，立即切除心脏和肺，并用冰冷的生理盐水冲洗。去除后的心室和肺样品在固体CO2上冷冻，保存在- 80°C待用。使用Polytron PT-20，将组织样品在20 mM Bis-Tris/2 mM EDTA/5 mM 2-巯基乙醇/2 mM benzamidine/10 μM lepeptin /10 μM pepstatin A， pH 6.5的溶液中切碎并匀浆。在匀浆前立即将溶解于二甲基亚砜（DMSO）中的苯甲磺酰氟（PMSF）加入缓冲液中，使其最终浓度为0.1 mM。匀浆液在35000g下离心45分钟，所得上清液应用于Resource-Q柱。PDEs通过连续50 ~ 1000 mM醋酸钠梯度（pH 6.5，含20 mM Bis-Tris， 2 mM EDTA， 5 mM 2-巯基乙醇，2 mM苄脒，0.1 mM PMSF）从色谱柱中洗脱。收集部分，测定cAMP和cGMP PDE活性。将从心室提取的含有高水平1、2或3型PDE活性的馏分和从肺提取的4或5型PDE活性的馏分合并。合并后的PDE馏分用乙二醇稀释至77%，保存在- 20°C。

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磷酸二酯酶活性测定。[4]
PDE活性由Thompson等人改进的方法测定。14反应混合物含有50 mM Tris-HCl， pH 8.0, 5 mM MgCl2, 4 mM 2-巯基乙醇。在评估1 - 5型PDE中检测的不同试剂的抑制剂效果时，调整测定中的蛋白质浓度，以确保在没有抑制剂的情况下，底物（[3H]cAMP或[3H]cGMP）的水解不超过有效底物的20%。底物浓度为1.0 μM。所有被检查的药剂都溶解在DMSO中。加入底物后，将内容物混合并在30°C下孵育30分钟。在三到四种不同的抑制剂浓度下进行三次试验，绘制每种浓度下测定结果的平均值，并以图形确定IC50值。给出的IC50值来自有代表性的实验。

RT-PCR[2]
细胞类型：人 A549 II 型肺上皮细胞。 IC50 值分别为 >100 μM、40 μM、>100 μM 和 14 μM [4]。
测试浓度：1 μM (H2O2 200 μM)。
孵化持续时间：30 分钟。
实验结果：防止 H2O2 诱导的 A549 细胞基因表达水平发生变化。

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细胞活力测定 [3]
细胞类型： NB4 细胞。
测试浓度：30μM。
孵化持续时间：3天。
实验结果：在 ATRA 处理的 NB4 细胞中观察到 STAT1 诱导显着增强。导致表达NBT-R活性的细胞数量显着增加。

动物/疾病模型： SCID（重症联合免疫缺陷）小鼠[3]。
剂量： 10 mg/kg（与 ATRA 联合使用）。
剂量： 每日注射。
实验结果： 在白血病动物中，与单独使用 ATRA 相比，联合用药能更有效地延长中位生存期（MST）（40 天；间隔 34-45 天）。

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\n\n体内实验——在体内实验中，将细胞悬浮于 199 Hanks 培养基中，并将 0.1 ml（1 × 10⁶ 个细胞/只小鼠）腹腔注射到 SCID 小鼠体内。吡克拉米司特 溶解于 0.5% 羧甲基纤维素、0.01% Tween 80 溶液中，并以 10 mg/kg 的剂量注射。将ATRA溶解于同一溶液中，并以15 mg/kg的剂量注射。接种后1天，每只动物腹腔注射100 μl药物，持续治疗13天（每周5次，每日一次）。分析动物存活率数据时，考虑以下参数：中位生存时间（MST）和寿命延长百分比（MST治疗组/MST对照组×100）-100。结果的统计分析采用Cox回归模型[3]。\n\n

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\n\n麻醉豚鼠组胺诱导支气管收缩。[4]
\n使用体重250-700 g的雄性Hartley豚鼠。豚鼠在α-氯醛糖（120 mg/kg，静脉注射）麻醉下进行气管插管，并以10 mL/kg/次的空气流量、60次/分钟的频率进行通气。使用三碘化镓胺（5 mg/kg，静脉注射）抑制自主呼吸。采用压力传感器测量肺泡充气压力（PIP），作为支气管痉挛的指标，并将测量结果记录在Linearcorder上。同时，使用心电图仪监测心率，以心电图R波（标准肢体导联II）为触发信号。每隔10分钟经侧隐静脉静脉注射盐酸组胺（2 μg/kg）诱导支气管收缩。将测试化合物悬浮于含吐温80的生理盐水中，并在注射组胺前1分钟静脉注射。\n

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\n\n麻醉豚鼠抗原诱导支气管收缩。[4]
\n用弗氏完全佐剂乳化的10 mg卵清蛋白（OA）对2.0-2.5 kg的兔子进行免疫，每周4次肌内注射OA，制备抗卵清蛋白兔抗血清。在最后一次免疫后7天采集血清，并冷冻于-70℃以下直至使用。通过豚鼠4小时PCA反应试验测定，所得抗血清的抗体滴度>10000倍。实验采用体重250-700 g的雄性Hartley豚鼠。豚鼠经静脉注射抗OA兔抗血清（0.5 mL/kg）致敏；20-28小时后，用抗原（30 μg/kg，静脉注射）进行激发。豚鼠在α-氯醛糖（120 mg/kg，静脉注射）麻醉下进行气管插管，并以10 mL/kg/次的空气流量、60次/分钟的频率进行通气。用三碘化镓胺（5 mg/kg，静脉注射）抑制自主呼吸。采用Konzett和Rössler的方法，使用连接至气管插管的差压传感器测量肺力学变化。抗原激发引起的呼吸溢出量的增加以夹闭气管后获得的最大溢出量的百分比表示。测试化合物在抗原激发前2分钟静脉注射。药物作用以抑制抗原诱导的支气管收缩50%的剂量（ED50）表示。\n

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\n\n罗利普兰结合研究。[4]
\n将雄性哈特利豚鼠脑组织置于10倍体积的冰冷20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲液（含2 mM MgCl2和0.1 mM DTT）中，用Polytron PT-10匀浆器匀浆。将匀浆液在4℃下以45000g离心30分钟。沉淀物用10 mL缓冲液重悬洗涤，并再次离心回收。最终沉淀物悬浮于Tris缓冲液中，并于-80℃保存备用。将混合物与 3 nM [3H]-(±)-罗利普兰、药物和 200 mg 膜制剂在反应缓冲液（25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM MgCl2、0.05 mM 5'-AMP）中于 30 °C 孵育 60 分钟后，进行竞争性结合实验。将混合物快速过滤到 Unifilter GF/B 96 孔板上，分离结合的和游离的放射性配体。用冰冷的缓冲液（25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM MgCl2）洗涤膜四次。立即干燥孔板，并使用 TopCount 微孔板闪烁计数器测定结合的放射性。在 10 μM (±)-罗利普兰存在下测定非特异性结合。

代谢/代谢物
RP73401 已知的人类代谢物包括 N-(3,5-二氯吡啶-4-基)-3-(3-羟基环戊基)氧基-4-甲氧基苯甲酰胺。

[1]. Selective type IV phosphodiesterase inhibitors as antiasthmatic agents. The syntheses and biological activities of 3-(cyclopentyloxy)-4-methoxybenzamides and analogues. J Med Chem. 1994 May 27;37(11):1696-703.

[2]. Piclamilast inhibits the pro-apoptotic and anti-proliferative responses of A549 cells exposed to H(2)O(2) via mechanisms involving AP-1 activation. Free Radic Res. 2012 May;46(5):690-9.

[3]. Phosphodiesterase IV inhibition by piclamilast potentiates the cytodifferentiating action of retinoids in myeloid leukemia cells. Cross-talk between the cAMP and the retinoic acid signaling pathways. J Biol Chem . 2004 Oct 1;279(40):42026-40.

[4]. Novel, potent, and selective phosphodiesterase-4 inhibitors as antiasthmatic agents: synthesis and biological activities of a series of 1-pyridylnaphthalene derivatives. J Med Chem. 1999 Mar 25;42(6):1088-99.

匹克拉米司特是一种单羧酸酰胺，由3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯甲酸的羧基与3,5-二氯吡啶-4-胺的伯氨基缩合而成。它是一种磷酸二酯酶IV抑制剂，具有抗哮喘、支气管扩张和抗炎作用。它属于单羧酸酰胺、苯甲酰胺类、氯吡啶类和芳香醚类化合物。
匹克拉米司特 (RP-73,401) 是一种选择性PDE4抑制剂，其抗炎作用与其他PDE4抑制剂相当。目前已对其在治疗慢性阻塞性肺疾病、支气管肺发育不良和哮喘等疾病中的应用进行了研究。吡克拉米司特的结构最早在1995年的一项欧洲专利申请中阐明，其结构功能与西洛米司特和罗氟米司特相似。

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本文描述了一系列由罗利普兰设计的苯甲酰胺衍生物的合成及其生物活性，这些衍生物是环磷酸腺苷特异性磷酸二酯酶（PDE IV）的选择性抑制剂。研究了烷氧基、酰胺键和苯甲酰胺N-苯基环的变化对猪主动脉胞质PDE IV抑制作用的影响。结果表明，一些高效且选择性的PDE IV抑制剂已被鉴定。对活性最强的化合物进行了进一步评估，以考察其对体外豚鼠嗜酸性粒细胞来源的PDE IV和超氧阴离子（O2-）生成的抑制活性。此外，还检测了部分化合物对麻醉豚鼠组胺诱导的支气管痉挛的抑制活性。 3-(环戊氧基)-N-(3,5-二氯-4-吡啶基)-4-甲氧基苯甲酰胺 (15j) 在所有测试中均表现出极高的活性，可能具有治疗哮喘的潜力。[1]

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在1-吡啶基萘系列化合物中揭示了高效选择性PDE4抑制剂的结构要求，并选择最佳化合物 (3kg，T-2585·HCl) 进行进一步的生物学评价（PDE4抑制IC50 = 0.13 nM，PDE3/4选择性比 = 14000）。化合物3kg在豚鼠中表现出强效的解痉活性（静脉注射，降低抗原诱导的支气管收缩的ED50 = 0.063 mg/kg；十二指肠内注射，降低组胺诱导的支气管收缩的ED50 = 0.033 mg/kg），且心血管效应较小。此外，在雪貂口服给药和犬静脉注射给药后，3kg 引起的催吐作用明显弱于 RP73401（3kg，4 只雪貂在 10 mg/kg 剂量口服给药时均未呕吐，8 只犬在 0.3 mg/kg 剂量静脉注射给药时也未呕吐；Piclamilast/RP73401，8 只雪貂中有 4 只在 3 mg/kg 剂量口服给药时呕吐，8 只犬中有 6 只在 0.3 mg/kg 剂量静脉注射给药时呕吐）；这与 3kg 对高亲和力罗利普兰结合位点的亲和力较低相符（3kg，2.6 nM；RP73401，0.85 nM）。这可能意味着3kg的治疗指数有所提高，因为其结合亲和力的Ki值与PDE4抑制的IC50值之间存在较大的差异（比值=0.050）。[4]

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STAT1、cEBP家族的转录因子以及MAP激酶ERK受类视黄酸调控，并参与髓系细胞成熟过程。我们的数据与STAT1在ATRA启动、PDE4抑制剂增强的粒细胞成熟过程中发挥作用的观点相符。事实上，STAT1的含量及其激活状态与ATRA+匹克拉米司特增强NB4细胞粒细胞成熟相关。尽管匹克拉米司特和ATRA通过不同的分子机制诱导cEBPβ和cEBPε，但在大多数时间点，这两种化合物对这些分子靶点的相互作用并不明显。唯一的例外是分化过程早期（6 小时）观察到的 cEBPβ 诱导增强。这种效应可能对 NB4 细胞的粒细胞成熟具有一定意义。值得注意的是，吡克拉米司特和 ATRA 不仅诱导作为转录激活因子的 cEBPβ 形式（LAP1 和 LAP2），而且还诱导据称具有转录抑制作用的 LIP。与 PKA 以负向方式调节 ERK 通路的观点一致，吡克拉米司特降低了 MAP 激酶的磷酸化和激活。有趣的是，吡克拉米司特和 ATRA 联合用药对 ERK 磷酸化的持续下调可能与抑制细胞生长有关，这种抑制作用在用该联合用药处理 NB4 细胞时比单独使用吡克拉米司特或 ATRA 更为明显。然而，使用 U0126 抑制剂获得的数据表明，ERK 激活并非 APL 细胞髓系成熟的必要条件。总之，我们的结果一致阐明了 cAMP 和类视黄醇信号转导通路之间相互作用的分子机制。此外，它们还表明 PDE IV 是未来针对髓系白血病分化治疗的重要药理学靶点。[3]

C18H18CL2N2O3

381.253122806549

380.069

C, 56.71; H, 4.76; Cl, 18.60; N, 7.35; O, 12.59

144035-83-6

154575

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

447.8±45.0 °C at 760 mmHg

224.6±28.7 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.626

5.25

63.68

1

4

5

25

438

0

ClC1C=NC=C(C=1NC(C1C=CC(=C(C=1)OC1CCCC1)OC)=O)Cl

RRRUXBQSQLKHEL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H18Cl2N2O3/c1-24-15-7-6-11(8-16(15)25-12-4-2-3-5-12)18(23)22-17-13(19)9-21-10-14(17)20/h6-10,12H,2-5H2,1H3,(H,21,22,23)

3-(Cyclopentyloxy)-N-(3,5-dichloropyridin-4-yl)-4-methoxybenzamide

Piclamilast; RP-73401; RP 73-401; Piclamilast; 144035-83-6; Cpodpmb; 3-(Cyclopentyloxy)-N-(3,5-dichloropyridin-4-yl)-4-methoxybenzamide; RP 73401; 3-(Cyclopentyloxy)-N-(3,5-dichloro-4-pyridyl)-4-methoxybenzamide; RP-73,401; Piclamilast [INN]; RP 73401; RP 73 401; RP73401; RP 73401;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~131.15 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。