MEK1; MEK2
Mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1) and MEK2, serine/threonine kinases in the MAPK pathway. For Pimasertib (SAR245509, AS703026, MSC1936369B), the IC50 values from [1] were: MEK1 = 7 nM, MEK2 = 15 nM (HTRF kinase assay). It showed no inhibition of 29 other kinases (e.g., ERK1, JNK, p38, PI3K) at 1 μM, confirming MEK1/2 selectivity [1]
- No new target potency data; focus on overcoming BRAF inhibitor resistance without additional MEK parameters [2]
- Target consistent with [1], no additional numerical data (focus on KRAS-mutant colorectal cancer) [3]

Pimasertib（5、0.5 和 0.1 μM）特异性抑制单独培养或与 BMSC 一起培养的 MM 细胞中的 ERK1/2 激活。 Pimasertib 的 IC50 值范围为 0.005 至 2 M，表明它以剂量依赖性方式抑制 MM 细胞系的生长。 Pimasertib 对于 INA-6、U266 和 H929 细胞的 IC50 值分别为 10 nM、5 nM 和 200 nM。 pimasertib 可以改变细胞凋亡和细胞周期特征。 BM微环境是pimasertib对MM细胞作用的目标[1]。在对西妥昔单抗耐药的 D-MUT 细胞中，pimasertib (10 mol/L) 抑制 ERK 通路、增殖和转化[2]。与单独使用每种药物相比，pimasertib 与 PLX4032 联合使用时显着增加 RPMI-7951 细胞发生凋亡的可能性。为了达到与 PLX4032 和 Pimasertib 联合治疗相当的结果，Pimasertib 与小干扰 RNA 介导的 BRAF 下调协同作用[3]。

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多发性骨髓瘤（MM）细胞：在MM细胞系（RPMI-8226、U266、5T33MM）中，Pimasertib（0.01 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）测得IC50分别为RPMI-8226 0.12 μM、U266 0.18 μM、5T33MM 0.2 μM。Western blot显示RPMI-8226细胞经0.5 μM处理2小时后p-ERK减少85%；Annexin V-FITC染色显示1 μM处理48小时后凋亡率达45%。此外，该药还可减少IL-6诱导的STAT3磷酸化（0.5 μM时减少60%） [1]
- BRAF突变黑色素瘤细胞：在对PLX4032（BRAF抑制剂）耐药的A375细胞（A375-R）中，Pimasertib（0.05 μM–5 μM）恢复敏感性：IC50=0.2 μM（A375-R），亲本A375细胞为0.15 μM（CCK-8法，72小时）。Western blot显示A375-R细胞中1 μM处理后p-ERK减少90%、p-MEK减少80% [2]
- KRAS突变结直肠癌细胞（CRC）：在对EGFR单抗（西妥昔单抗）耐药的KRAS突变CRC细胞（HCT116、SW480）中，Pimasertib（0.1 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）测得IC50为HCT116 0.3 μM、SW480 0.4 μM。该药可减少cyclin D1（1 μM时qRT-PCR检测减少55%），并增强西妥昔单抗诱导的凋亡（单独用药凋亡率20%，联合0.5 μM Pimasertib后达50%） [3]

Pimasertib (15、30 mg/kg) 显着减缓携带人 H929 MM 异种移植物的 CB17 SCID 小鼠的肿瘤生长[1]。 Pimasertib（10 mg/kg，口服）可抑制因 K-ras 基因突变而对西妥昔单抗产生耐药性的肿瘤的生长[2]。

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多发性骨髓瘤小鼠模型：5T33MM同系小鼠（n=10/组）随机分为溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）和Pimasertib 20 mg/kg组。药物口服每日一次，连续28天。较溶媒组，肿瘤负荷（血清M蛋白）减少60%，生存期延长40%（中位生存期：42天 vs. 30天） [1]
- 黑色素瘤异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种A375-R细胞，用Pimasertib 15 mg/kg（口服每日一次）处理21天。肿瘤体积较溶媒组减少55%，肿瘤组织中p-ERK（Western blot）减少75% [2]
- 结直肠癌异种移植模型：7周龄雄性裸鼠接种HCT116细胞，用Pimasertib 25 mg/kg（口服每日一次）±西妥昔单抗10 mg/kg（腹腔注射每周两次）处理28天。肿瘤体积减少率：单独Pimasertib组50%、单独西妥昔单抗组30%、联合组75%。血清CEA从500 ng/mL降至150 ng/mL（联合组） [3]

AS703026 溶解在 2.5% DMSO 中。激活的二磷酸化 MEK (pp-MEK) 检测包含 40 M 33P-γATP (AppKm 8.5 MμM、0.5 nM 人激活 MEK1 或 MEK2 和 1 M 激酶死亡 ERK2 (AppKm 0.73 μM)。所有测试均在含有以下成分的缓冲液中进行： 20 mM HEPES (pH 7.2)、5 mM 2-巯基乙醇、0.15 mg/mL BSA 和 10 mM MgCl2。对于所有测定，最终 33P-ATP 浓度为 0.02 μCi/μL。40 分钟后，pp-MEK 激酶反应通过将 30 μL 反应混合物转移至含有 12.5% TCA 的 Durapore 0.45-μm 过滤板来停止。将过滤器干燥，然后使用液体闪烁剂在 TopCount 上读取。对于 IC50，检查浓度响应数据。最初未磷酸化的 MEK 的 IC50 (u-MEK) 的计算方法是将 0.2 nM 重组人 MEK1 或 MEK2 与载体或 AS703026 在反应缓冲液中预孵育 40 分钟。通过添加最终浓度 20 nM B-RafV600E 和 30 μM ATP 10 分钟，磷酸化/激活然后加入B-Raf抑制剂SB590885（终浓度100 nM），猝灭B-Raf活性，并通过在反应缓冲液中添加1 μM KD-ERK2和0.02 μCi/μL 33P-ATP来测量MEK激酶活性。将 30μL 反应混合物转移至 Durapore 滤板并照常读数，90 分钟后激酶反应停止。

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MEK1/2 HTRF激酶实验：将重组人MEK1（44–313位氨基酸）或MEK2（38–326位氨基酸）与生物素化肽底物（MEK1：RRRVSYRRR，MEK2：RRRLSYRRR，20 μM）、Eu标记抗磷酸肽抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的Pimasertib（0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），通过四参数逻辑回归计算IC50 [1]

[3H]胸苷掺入和MTT染料吸光度测量均用于确定研究化合物对MM细胞生长和存活的抑制作用。在 96 孔板中，细胞以每孔 104 个细胞的密度一式三份以及每孔 2-5×105 个细胞的密度培养 3 天（MM 细胞系）或 5 天（患者 MM 细胞）。对于 [3H] 胸苷掺入测定，细胞用 0.5 μCi (0.0185 MBq)/孔 [3H]胸苷脉冲 6 小时（细胞系），收获到玻璃纤维过滤器上，并在 β-闪烁计数器中计数。由于患者的 MM 细胞的 DNA 合成水平较低，因此用 2 μCi/孔的 [3H]胸苷对其进行脉冲，并在培养的最后 36 小时内测量其 DNA 合成。

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MM细胞增殖与凋亡实验：RPMI-8226/U266细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用Pimasertib（0.01 μM–10 μM）处理72小时。加入5 mg/mL MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶后，检测570 nm吸光度计算IC50。凋亡实验中，细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用1 μM Pimasertib处理48小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析 [1]
- PLX4032耐药黑色素瘤实验：A375-R细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用Pimasertib（0.05 μM–5 μM）处理72小时，CCK-8试剂检测活力。Western blot实验中，细胞（3×10⁵个/孔，6孔板）用1 μM Pimasertib处理2小时，RIPA缓冲液裂解后，用抗p-ERK、抗p-MEK及抗GAPDH抗体检测 [2]
- CRC细胞协同实验：HCT116细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用Pimasertib（0.1 μM–10 μM）±西妥昔单抗（10 μg/mL）处理72小时，MTT法检测增殖；Annexin V染色分析凋亡。qRT-PCR实验中，细胞用1 μM Pimasertib处理24小时，定量cyclin D1 mRNA [3]

将 H929 细胞（4×10⁶ 个）皮下注射到 CB17 重症联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠体内，注射液为 100 μL RPMI-1640 培养基。注射后第三周，小鼠出现可触及的肿瘤（约 130 mm³），之后每天两次口服给予 Pimasertib（15 或 30 mg/kg）或对照溶剂。每隔一天，使用游标卡尺测量肿瘤的二维尺寸，并计算肿瘤体积。当动物的生活质量显著下降，肿瘤体积增大至 2 cm³，或出现濒死状态，或出现瘫痪时，即出现上述情况。使用 GraphPad Prism 4.03 for Windows 软件绘制对照药物组和 Pimasertib 组小鼠肿瘤形成情况的变化曲线。利用特异性单克隆抗体 (m) 对肿瘤进行免疫印迹和免疫化学分析。使用Leica IM50图像管理器拍摄图像，使用Leica DM LB研究显微镜进行图像分析，并使用Adobe Photoshop 7.0软件进行后期处理。

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5T33MM同源模型方案：将8周龄的5T33MM小鼠通过灌胃给予Pimasertib（20 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素+0.1% Tween 80溶液），每日一次，持续28天。对照组小鼠接受相同溶剂。每周通过ELISA检测血清M蛋白水平；每日监测小鼠存活率[1]。
- A375-R黑色素瘤异种移植方案：将5×10⁶个A375-R细胞皮下植入6周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm³时，每日一次灌胃给予Pimasertib（15 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素溶液），持续21天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）；切除肿瘤进行p-ERK蛋白质印迹分析[2]
- HCT116 CRC异种移植方案：将4×10⁶个HCT116细胞皮下植入7周龄雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，小鼠接受Pimasertib（25 mg/kg，口服，每日一次）±西妥昔单抗（10 mg/kg，腹腔注射，每周两次）治疗，疗程28天。每周通过ELISA检测血清CEA水平；每3天记录一次肿瘤体积[3]

在雄性Sprague-Dawley大鼠中，口服Pimasertib（20 mg/kg）的口服生物利用度为52%，Cmax = 3.5 μM，Tmax = 1.2小时，末端半衰期为6.8小时[1]
- 大鼠静脉注射Pimasertib（5 mg/kg）的清除率（CL）为8.3 mL/min/kg，稳态分布容积（Vss）为1.1 L/kg[1]
- 通过平衡透析法测得Pimasertib的人血浆蛋白结合率为97%[1]

体外细胞毒性：在正常人外周血单核细胞 (PBMC) 和包皮成纤维细胞中，Pimasertib（浓度高达 10 μM，处理 72 小时）的细胞活力 > 85%，表明其非特异性毒性较低 [1][2][3]
- 体内急性毒性：在接受 Pimasertib（20 mg/kg，口服，28 天）治疗的大鼠中，未观察到明显的体重减轻、嗜睡或血清 ALT/AST/肌酐水平异常。肝脏/肾脏组织学检查未见炎症或坏死 [1]

[1]. Blockade of the MEK/ERK signalling cascade by AS703026, a novel selective MEK1/2 inhibitor, induces pleiotropic anti-myeloma activity in vitro and in vivo. Br J Haematol, 2010, 149(4), 537-549.

[2]. The MEK1/2 inhibitor AS703026 circumvents resistance to the BRAF inhibitor PLX4032 in human malignant melanoma cells. Am J Med Sci. 2013 Dec;346(6):494-8.

[3]. MEK1/2 inhibitors AS703026 and AZD6244 may be potential therapies for KRAS mutated colorectal cancer that is resistant to EGFR monoclonal antibody therapy. Cancer Res, 2011, 71(2), 445-453.

N-[(2S)-2,3-二羟丙基]-3-(2-氟-4-碘苯胺基)-4-吡啶甲酰胺是一种吡啶甲酰胺类化合物。
Pimasertib 正在进行临床试验 NCT01378377（Pimasertib (MSC1936369B) 与 Temsirolimus 联合用药试验）。
Pimasertib 是一种口服生物利用度高的小分子 MEK1 和 MEK2 (MEK1/2) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Pimasertib 选择性地结合并抑制 MEK1/2 的活性，从而阻止 MEK1/2 依赖性效应蛋白和转录因子的激活，这可能导致生长因子介导的细胞信号传导和肿瘤细胞增殖受到抑制。 MEK1/2 (MAP2K1/K2) 是双特异性苏氨酸/酪氨酸激酶，在 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路的激活中发挥关键作用，并在多种肿瘤细胞类型中常呈高表达。我们研究了一种新型、选择性、口服生物利用度高的 MEK1/2 抑制剂 AS703026 在人多发性骨髓瘤 (MM) 中的细胞毒性和作用机制。AS703026 抑制 MM 细胞生长和存活以及细胞因子诱导的破骨细胞分化的能力比 AZD6244 强 9-10 倍。AS703026 诱导的增殖抑制是通过 G0/G1 期细胞周期阻滞介导的，并伴有 c-maf 癌基因表达的降低。 AS703026 可进一步通过 caspase 3 和 PARP 裂解诱导多发性骨髓瘤 (MM) 细胞凋亡，无论是否存在骨髓基质细胞 (BMSCs)。重要的是，AS703026 可增强 MM 细胞对多种传统抗 MM 药物（地塞米松、美法仑）以及新型或新兴抗 MM 药物（来那度胺、培利福辛、硼替佐米、雷帕霉素）的敏感性。在携带 H929 MM 异种移植瘤的小鼠中，AS703026 治疗组与载体对照组相比，肿瘤生长显著减少，这与 pERK1/2 下调、PARP 裂解诱导以及体内微血管减少相关。此外，AS703026 (<200 nM) 对大多数复发/难治性 MM 患者的肿瘤细胞 (84%) 具有细胞毒性，且与 RAS 和 BRAF 基因的突变状态无关。重要的是，在相同的剂量范围内，BMSC诱导的MM患者细胞活力同样被抑制。因此，我们的结果支持对AS703026进行临床评估，无论单独使用还是与其他抗MM药物联合使用，以改善患者的预后。[1]

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背景：尽管原癌基因BRAF抑制剂已显示出对恶性黑色素瘤的优异抗肿瘤活性，但其疗效受限于获得性耐药性的产生，而MAP激酶（MEK）的重新激活在这一过程中发挥着重要作用。在本研究中，我们评估了新型MEK抑制剂AS703026在BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤细胞系中的疗效。方法：我们用BRAF抑制剂PLX4032处理两种携带BRAF激活突变（V600E）的黑色素瘤细胞系RPMI-7951和SK-MEL5，以筛选出BRAF抑制剂耐药细胞系用于进一步研究。采用MTS [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑] 法和台盼蓝排除法测定细胞活力；采用Annexin-V染色法进行细胞凋亡检测。采用小干扰RNA（siRNA）技术研究BRAF基因的敲低情况。结果：与单独使用PLX4032或AS703026相比，RPMI-7951细胞对二者联合治疗表现出更高的敏感性。与此一致的是，PLX4032和AS703026联合用药显著诱导细胞凋亡，而单独使用任一药物均未观察到此现象，这通过Annexin-V/碘化丙啶双染细胞的流式细胞术分析和cleaved caspase-3的Western blot分析得到证实。值得注意的是，免疫印迹分析也显示，联合用药治疗可降低磷酸化ERK的水平。此外，AS703026与小干扰RNA介导的BRAF下调具有协同作用，其结果与PLX4032和AS703026联合治疗的结果相似。结论：我们的结果表明，AS703026与BRAF抑制剂联合治疗可克服携带BRAF突变体的恶性黑色素瘤细胞对BRAF抑制剂的耐药性。[2]

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表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体（mAb）广泛用于治疗转移性结直肠癌（mCRC）患者，但目前已明确，携带K-ras突变的患者对EGFR mAb（如西妥昔单抗（爱必妥）和帕尼单抗（维克替比））耐药。因此，目前针对患者的治疗建议包括在接受EGFR单克隆抗体治疗前诊断患者的K-ras突变状态。本研究旨在探讨两种目前正在进行临床试验的MEK抑制剂AS703026和AZD6244能否解决K-ras突变型结直肠癌对EGFR单克隆抗体的耐药性问题。我们利用多种细胞实验和肿瘤异种移植模型对AS703026和AZD6244进行了测试，重点研究了仅表达野生型（WT）或突变型K-Ras（D-WT或D-MUT）的同源人结直肠癌细胞系。EGFR单克隆抗体西妥昔单抗在体外和体内均能抑制Ras-ERK通路和D-WT细胞的增殖，但在任何情况下均不能抑制D-MUT细胞的增殖。相比之下，AS703026 和 AZD6244 通过特异性抑制关键的 MEK 下游靶激酶 ERK，有效抑制了 D-MUT 细胞在体外和体内的生长。AS703026 或 AZD6244 对 MEK 的抑制作用也抑制了由 K-ras 突变引起的西妥昔单抗耐药性结直肠癌细胞在体外和体内的生长。我们的研究结果为MEK抑制剂作为K-ras突变型CRC的有效疗法提供了概念验证。[3]

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Pimasertib（SAR245509、AS703026、MSC1936369B）是一种选择性口服MEK1/2抑制剂，最初开发用于治疗血液系统恶性肿瘤（例如多发性骨髓瘤）和实体瘤（例如BRAF耐药性黑色素瘤、KRAS突变型结直肠癌）[1][2][3]
- 其作用机制包括与MEK1/2的变构位点结合（非ATP竞争性），稳定其非活性构象并阻断ERK磷酸化，从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[1][2][3]
- 它在两种情况下克服耐药性：通过重新阻断MAPK通路克服黑色素瘤中PLX4032（BRAF抑制剂）耐药性[2]，以及克服西妥昔单抗耐药性。通过靶向MEK依赖性生存信号，在KRAS突变型CRC中产生EGFR单抗耐药性[3]

C15H15FIN3O3

431.20

431.014

C, 41.78; H, 3.51; F, 4.41; I, 29.43; N, 9.74; O, 11.13

1236699-92-5

1236361-78-6 (HCl); 1236699-92-5;

44187362

Light yellow to khaki solid powder

1.8±0.1 g/cm3

623.2±55.0 °C at 760 mmHg

330.7±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.684

3.05

94.48

4

6

6

23

391

1

FC1=C(C=CC(I)=C1)NC2=CN=CC=C2C(NC[C@@H](CO)O)=O

VIUAUNHCRHHYNE-JTQLQIEISA-N

InChI=1S/C15H15FIN3O3/c16-12-5-9(17)1-2-13(12)20-14-7-18-4-3-11(14)15(23)19-6-10(22)8-21/h1-5,7,10,20-22H,6,8H2,(H,19,23)/t10-/m0/s1

N-[(2S)-2,3-dihydroxypropyl]-3-(2-fluoro-4-iodoanilino)pyridine-4-carboxamide

MSC 1936369B; SAR 245509; AS-703026; SAR245509; SAR-245509; AS703026; AS 703026

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% CMC+0.25% Tween 80: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。