B-Raf (V600E) (IC50 = 13 nM); B-Raf (IC50 = 160 nM); BRK (IC50 = 130 nM); ; FRK (IC50 = 1300 nM); Csk (IC50 = 1500 nM); Src (IC50 = 1700 nM); FAK (IC50 = 1700 nM); FGFR (IC50 = 1900 nM); KDR (IC50 = 2300 nM); HGK (IC50 = 2800 nM); CSF1R (IC50 = 3300 nM); Aurora A (IC50 = 3400 nM)
PLX-4720 is a highly selective inhibitor of the oncogenic mutant BRAF kinase (BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ). In recombinant human BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ kinase assays, it exhibits an IC₅₀ of 13 nM; it has minimal activity against wild-type BRAF (IC₅₀ > 10 μM) and other RAF family members (e.g., CRAF, IC₅₀ = 3.2 μM) [1]
- PLX-4720 shows no significant inhibition of non-RAF kinases, including EGFR (IC₅₀ > 50 μM), MEK1 (IC₅₀ > 10 μM), and AKT (IC₅₀ > 20 μM), confirming its specificity for BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ [1]

PLX-4720 对野生型 B-Raf 的选择性 >10 倍，对其他激酶（包括 Frk、Src、Fak、FGFR 和 Aurora A）的选择性 >100 倍，IC50 为 1.3-3.4 μM。 PLX-4720 显着降低表达 B-RafV600E 的细胞系中的 ERK 磷酸化，但不降低表达野生型 B-Raf 的细胞中的 ERK 磷酸化 (IC50 = 14–46 nM)。 PLX-4720 显着减缓携带 B-RafV600E 癌基因的肿瘤细胞系（包括 COLO205、A375、WM2664 和 COLO829）的扩增，GI50 值分别为 0.31 μM、0.50 μM、1.5 μM 和 1.7 μM。此外，1 μM PLX-4720 处理仅导致 B-RafV600E 阳性 1205Lu 细胞的细胞周期停滞和细胞凋亡，而对 B-Raf 野生型 C8161 细胞没有影响[1]。与 PTEN 细胞系（4 倍）相比，PLX-4720 处理（10 μM）使 PTEN+ 细胞中 BIM 的表达显着增加 > 14 倍，这解释了 PTEN 细胞对 PLX-4720 的抵抗能力诱导细胞凋亡[2]。

---

BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ黑色素瘤细胞增殖抑制：在人BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ阳性黑色素瘤细胞系（A375、SK-MEL-28）中，PLX-4720（0.001-10 μM）可浓度依赖性抑制细胞增殖：0.021 μM使A375细胞活力降低50%（IC₅₀=21 nM），1 μM时抑制率达95%。该效应伴随0.1 μM剂量下磷酸化ERK1/2（p-ERK，下游MAPK标志物）水平降低90%（Western blot检测） [1]
- PTEN缺失黑色素瘤细胞耐药性：在PTEN敲除A375细胞（PTEN⁻/⁻）中，PLX-4720（0.01-5 μM）抗增殖活性降低：IC₅₀从PTEN⁺/⁺细胞的21 nM升至PTEN⁻/⁻细胞的150 nM。这种耐药性由促凋亡蛋白BIM表达抑制介导——PTEN⁻/⁻细胞BIM水平较PTEN⁺/⁺细胞低60%，BIM过表达可恢复敏感性（IC₅₀=30 nM） [2]
- BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ甲状腺癌细胞抑制：在人BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ阳性乳头状甲状腺癌细胞（BCPAP）中，PLX-4720（0.05-5 μM）抑制增殖（IC₅₀=45 nM），0.5 μM时使促血管生成蛋白血小板反应蛋白1（TSP-1）分泌减少70%（ELISA检测），同时通过抑制TSP-1阻断内皮细胞迁移（0.5 μM时抑制80%） [3]
- NRP1介导的适应性耐药：在神经纤毛蛋白1（NRP1）过表达的SK-MEL-28细胞中，PLX-4720（0.01-10 μM）疗效降低：1 μM仅使活力减少40%（亲本细胞中为95%）。NRP1敲低（siRNA）可恢复敏感性，1 μM时活力减少85% [4]

在 B-RafV600E 依赖性 COLO205 肿瘤异种移植物中，口服 20 mg/kg/天的 PLX-4720 会导致显着的肿瘤生长延迟和消退，即使剂量高达 1 g/天，对小鼠也没有明显有害的副作用。公斤。虽然对含有野生型 B-Raf 的 C8161 异种移植物没有影响，但每日两次 100 mg/kg 的 PLX-4720 几乎完全根除含有 B-RafV600E 的 1205Lu 异种移植物。当PLX-4720应用于携带V600E突变的细胞时，抗肿瘤作用与MAPK通路的阻断相关[1]。使用 30 mg/kg/天的 PLX-4720 治疗可显着抑制 8505c 异种移植肿瘤的生长超过 90%，并显着降低远处肺转移[3]。

---

黑色素瘤异种移植模型：在荷A375 BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ黑色素瘤异种移植瘤的裸鼠中，口服PLX-4720（25、50、100 mg/kg/天，每日一次）可剂量依赖性抑制肿瘤生长：100 mg/kg在第28天较溶媒组使肿瘤体积减少90%，40%的小鼠出现完全肿瘤退缩。肿瘤p-ERK水平降低95%（免疫组化），无显著体重下降（<5%） [1]
- PTEN缺失黑色素瘤异种移植：在荷PTEN⁻/⁻ A375异种移植瘤的裸鼠中，口服PLX-4720（100 mg/kg/天）疗效降低：第28天肿瘤体积仅减少35%（PTEN⁺/⁺异种移植瘤中为90%）。与BIM激动剂（10 mg/kg，腹腔注射）联用可将抑制率恢复至75% [2]
- 甲状腺癌异种移植模型：在荷BCPAP甲状腺癌异种移植瘤的SCID鼠中，口服PLX-4720（75 mg/kg/天）在第35天使肿瘤体积减少65%，并通过抑制TSP-1降低瘤内微血管密度（减少50%，CD31染色）。未观察到显著肝肾功能毒性（血清ALT/AST及肌酐在正常范围） [3]

在 20 mM Hepes (pH 7.0)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.01% Tween-20、100 nM 生物素-MEK 蛋白、不同 ATP 浓度以及增加浓度的 PLX-4720 中，进行 20 μL 反应每种酶（0.1 ng）。在第 2、5、8、10、20 和 30 分钟时，使用 5 μL 含有 20 mM hepes (pH 7.0)、200 mM 氯化钠、80 mM EDTA 和 0.3% BSA 的溶液停止反应。 AlphaScreen Protein A 检测试剂盒的磷酸化 MEK 抗体、链霉亲和素包被的供体珠和 Protein A 受体珠也包含在终止溶液中。将抗体和珠子在室温避光条件下在终止溶液中预孵育 30 分钟。最终抗体稀释度为1/2000，最终珠浓度为10 μg/mL。室温孵育一小时后，在 PerkinElmer AlphaQuest 读数器上读取测定板的读数。

---

重组BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ激酶实验：将重组人BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ或野生型BRAF蛋白（40 ng/孔）与激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH7.5、5 mM MgCl₂、1 mM EGTA、2 mM DTT、10 μM ATP）、生物素化MEK1衍生肽（底物，2 μM）及不同浓度的PLX-4720（0.001-50 μM）在30°C孵育45 min。采用均相时间分辨荧光（HTRF）实验（铕标记抗磷酸化MEK抗体+链霉亲和素-APC）检测磷酸化底物。激酶活性归一化为溶媒对照组，通过非线性回归计算IC₅₀值 [1]

PLX-4720 以不同浓度应用于细胞 24、48 和 72 小时。 MTT 测定或 CellTiter-Glo 发光细胞活力测定用于测量细胞增殖。收集上清液和细胞，沉淀并用 70% 乙醇固定以进行细胞周期分析。将细胞在 0.5 mg/mL RNase I 中于 37°C 孵育 1 小时，以去除任何残留的 RNA 污染，然后用碘化丙啶 (10 μg/mL) 染色。随后，使用 EPICS XL 设备检查样品。收集培养基和细胞，沉淀，并用膜联蛋白-FITC 和碘化丙啶染色，以确定细胞凋亡的水平。然后使用 EPICS XL 仪器分析样品。

---

黑色素瘤细胞增殖实验：A375/SK-MEL-28细胞以4×10³个细胞/孔接种于96孔板，用含10% FBS的DMEM培养。贴壁24 h后加入PLX-4720（0.001-10 μM），孵育72 h。MTT法（570 nm吸光度）检测细胞活力。Western blot实验中，细胞经药物处理24 h后用RIPA缓冲液裂解，用抗p-ERK、抗总ERK及抗GAPDH抗体检测 [1]
- PTEN缺失细胞BIM表达实验：PTEN⁺/⁺和PTEN⁻/⁻ A375细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用PLX-4720（0.1 μM）处理48 h。细胞裂解后，通过Western blot（抗BIM抗体）分析BIM表达。BIM过表达实验中，细胞转染BIM表达质粒（2 μg/孔）24 h后给药，CCK-8法检测活力 [2]
- 甲状腺癌细胞TSP-1分泌实验：BCPAP细胞以1×10⁵个细胞/孔接种于24孔板，用PLX-4720（0.05-5 μM）处理72 h。收集上清液，夹心ELISA法（450 nm检测）测定TSP-1浓度。Transwell实验评估内皮细胞迁移：上室接种HUVECs并加入药物处理后的BCPAP上清液，6 h后计数迁移细胞 [3]
- NRP1介导耐药实验：SK-MEL-28细胞转染NRP1过表达质粒或siRNA（2 μg/孔）24 h后接种于96孔板，加入PLX-4720（0.01-10 μM），72 h后MTT法检测活力。Western blot（抗NRP1抗体）验证NRP1表达 [4]

将2×10⁶个转移性黑色素瘤细胞皮下注射到SCID小鼠的侧腹部，大约两周后肿瘤体积达到0.125 mm³。随后，小鼠接受100 mg/kg PLX4720（灌胃）或载体对照，每日两次，持续15天。每72小时测量一次肿瘤体积。以治疗第一天的肿瘤体积为基准，计算各组的平均肿瘤大小。在治疗15天后处死小鼠，取出肿瘤，进行福尔马林固定、石蜡包埋和免疫组织化学检查。

---

A375黑色素瘤异种移植方案：将A375细胞（6×10⁶个细胞/只）皮下注射到6-7周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到 80–100 mm³ 时，将小鼠随机分为 4 组（每组 n=7）：载体组（0.5% 甲基纤维素 + 0.1% Tween 80，口服）、PLX-4720 25 mg/kg 组（口服，每日一次）、PLX-4720 50 mg/kg 组（口服，每日一次）、PLX-4720 100 mg/kg 组（口服，每日一次）。每日给药，持续 28 天。每 3 天测量一次肿瘤体积（V = π×L×W²/6）和体重。研究结束时，切除肿瘤进行 p-ERK 免疫组织化学染色 [1]
- PTEN⁻/⁻ A375 异种移植方案：将 PTEN⁻/⁻ A375 细胞（6×10⁶ 个细胞/只）皮下植入雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到 100 mm³ 时，将小鼠分为 3 组（每组 n=6）：载体组、PLX-4720 100 mg/kg（口服，每日一次）组、PLX-4720 100 mg/kg + BIM 激动剂 10 mg/kg（腹腔注射，每日一次）组。治疗持续 28 天，每 3 天测量一次肿瘤体积 [2]
- BCPAP 甲状腺癌异种移植方案：将 BCPAP 细胞（8×10⁶ 个细胞/只）皮下注射到 8 周龄雄性 SCID 小鼠体内。当肿瘤体积达到 120 mm³ 时，将小鼠随机分为 2 组（每组 n=5）：载体组、PLX-4720 75 mg/kg（口服，每日一次）组。治疗持续 35 天。每 4 天测量一次肿瘤体积；研究结束时，收集肿瘤组织进行CD31染色（微血管密度），并分析血清中的肝肾功能标志物[3]

急性毒性：裸鼠口服PLX-4720（剂量高达200 mg/kg/天，持续14天）后，未观察到死亡或严重毒性（例如，惊厥、器官损伤）。据报道，剂量为150-200 mg/kg时出现轻度短暂性腹泻（发生率<10%），但无明显体重减轻（<5%）[1]。慢性毒性：SCID小鼠口服PLX-4720（剂量为75 mg/kg/天，持续35天）后，血清ALT/AST水平（肝脏标志物）和肌酐（肾脏标志物）均在正常范围内。肝脏、肾脏或心脏组织未观察到组织病理学变化[3]
- 血浆蛋白结合：在小鼠血浆中（通过超滤法测定），PLX-4720 在浓度为 0.01–10 μM 时具有约 98% 的蛋白结合率，且与浓度无关[1]

[1]. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(8), 3041-3046.

[2]. PTEN loss confers BRAF inhibitor resistance to melanoma cells through the suppression of BIM expression. Cancer Res, 2011, 71(7), 2750-2760.

[3]. B-Raf(V600E) and thrombospondin-1 promote thyroid cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(23), 10649-10654.

[4]. Neuropilin-1 upregulation elicits adaptive resistance to oncogene-targeted therapies. J Clin Invest. 2018 Aug 31;128(9):3976-3990.

PLX-4720 是一种吡咯并吡啶类化合物，是维莫非尼（vemurafenib）的衍生物，其中对氯苯基被氯取代。它是一种强效且选择性的 Raf 激酶 B-Raf(V600E) 抑制剂。PLX-4720 可作为 B-Raf 抑制剂和抗肿瘤药物。它是一种吡咯并吡啶类化合物，属于磺酰胺类、二氟苯类化合物、有机氯化合物和芳香酮类化合物。

---

BRAF(V600E) 是目前已知最常见的致癌蛋白激酶突变。此外，靶向“活性”蛋白激酶的抑制剂在抗癌治疗中展现出显著的疗效。因此，我们致力于开发靶向 B-Raf，特别是 V600E 等位基因的特异性激酶抑制剂。通过结构导向的药物发现方法，我们发现了一种强效且选择性的活性 B-Raf 抑制剂。 PLX4720 是一种 7-氮杂吲哚衍生物，其对 B-Raf(V600E) 的抑制 IC50 为 13 nM，定义了一类在生化和细胞实验中均具有显著选择性的激酶抑制剂。与其他多种激酶相比，PLX4720 优先抑制活性 B-Raf(V600E) 激酶，并且其强效的细胞毒性作用也仅限于携带 V600E 等位基因的细胞。与高度选择性相一致，PLX4720 能有效抑制携带 B-Raf(V600E) 的肿瘤细胞系中的 ERK 磷酸化，但在缺乏致癌性 B-Raf 的细胞中则无此作用。在黑色素瘤模型中，PLX4720 仅在 B-Raf(V600E) 阳性细胞中诱导细胞周期阻滞和凋亡。在B-Raf(V600E)依赖性肿瘤异种移植模型中，口服PLX4720可显著延缓肿瘤生长，包括肿瘤消退，且未观察到毒性反应。本文所述工作涵盖了从最初鉴定到动物模型中的结构和生物学研究，再到开发出一种有望用于治疗B-Raf(V600E)驱动型肿瘤患者的有效疗法的整个发现过程。[1]

---

本研究探讨了PTEN缺失在BRAF抑制剂PLX4720固有耐药性中的作用。对涵盖所有黑色素细胞肿瘤阶段（n = 192）的组织芯片进行免疫组织化学染色显示，超过10%的黑色素瘤病例中PTEN表达缺失。虽然PTEN表达状态不能预测对PLX4720生长抑制作用的敏感性，但它可以预测细胞凋亡，在缺乏PTEN表达（PTEN-）的黑色素瘤中仅观察到有限的细胞死亡。从机制上讲，PLX4720 可刺激 PTEN 阴性细胞系而非 PTEN 阳性细胞系中的 AKT 信号通路。采用液相色谱多反应监测质谱 (LC-MRM) 分析，以鉴定两组细胞系凋亡信号通路的差异。与 PTEN 阴性细胞系（4 倍）相比，PLX4720 处理显著提高了 PTEN 阳性细胞系中 BIM 的表达（>14 倍）。通过 siRNA 敲低 PTEN 以及将 PTEN 重新导入 PTEN 阴性细胞，证实了 PTEN 在 PLX4720 介导的 BIM 表达调控中的作用。进一步研究表明，siRNA 敲低 BIM 可显著抑制 PTEN 阳性黑色素瘤细胞的凋亡反应。 PLX4720 与 PI3K 抑制剂联合处理 PTEN- 细胞可增强 BIM 在 mRNA 和蛋白水平的表达，并通过涉及 AKT3 和 FOXO3a 激活的机制增加细胞凋亡水平。总之，我们首次证明 PTEN 的缺失通过抑制 BIM 介导的细胞凋亡导致内在的 BRAF 抑制剂耐药性。[2]

---

PLX-4720 是一种研究级选择性 BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ 抑制剂，是作为临床 BRAF 抑制剂（例如维莫非尼）的先导化合物而开发的。它尚未获准用于临床[1]
- 作用机制：其抗肿瘤作用是通过特异性抑制 BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ 激酶活性介导的，从而阻断组成型激活的 MAPK (RAS-RAF-MEK-ERK) 信号通路，该通路驱动 BRAF 突变癌症的增殖和存活[1,3]
- 耐药机制：PLX-4720 的临床前耐药性是通过 PTEN 缺失（BIM 表达受到抑制，[2]）和 NRP1 过表达（生存信号增强，[4]）发生的。联合治疗策略（BIM激动剂、NRP1抑制剂）可恢复敏感性[2,4]
- 研究应用：PLX-4720广泛应用于临床前研究，以探索BRAFⁿᵉᵗ/ᵛ⁶⁰⁰ᴱ的生物学特性，包括其在黑色素瘤、甲状腺癌以及RAF抑制耐药性中的作用[1,3,4]

C17H14CLF2N3O3S

413.83

413.041

C, 49.34; H, 3.41; Cl, 8.57; F, 9.18; N, 10.15; O, 11.60; S, 7.75

918505-84-7

PLX-4720-d7;1304096-50-1

24180719

white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

621.4±65.0 °C at 760 mmHg

329.6±34.3 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.646

3.14

100.3

2

7

6

27

648

0

O=C(C1C(F)=C(NS(CCC)(=O)=O)C=CC=1F)C1C2C(=NC=C(C=2)Cl)NC=1

YZDJQTHVDDOVHR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H14ClF2N3O3S/c1-2-5-27(25,26)23-13-4-3-12(19)14(15(13)20)16(24)11-8-22-17-10(11)6-9(18)7-21-17/h3-4,6-8,23H,2,5H2,1H3,(H,21,22)

N-[3-(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)-2,4-difluorophenyl]propane-1-sulfonamide

PLX 4720; PLX4720; 918505-84-7; PLX-4720; PLX4720; N-(3-(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)-2,4-difluorophenyl)propane-1-sulfonamide; PLX 4720; N-[3-[(5-Chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)carbonyl]-2,4-difluorophenyl]-1-propanesulfonamide; N-[3-(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)-2,4-difluorophenyl]propane-1-sulfonamide; MFCD14635203; PLX-4720

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 2% DMSO +50% PEG 300 +5% Tween 80 +ddH2O: 5mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。