PLX7904

BRaf(V600E) (IC50 = 5 nM)
BRAF V600E (IC50 = 14 nM), CRAF (IC50 = 4 nM), BRAF WT (IC50 = 31 nM), ARAF (IC50 = 10 nM) [1]
- BRAF V600E (IC50 = 12 nM), CRAF (IC50 = 5 nM), BRAF WT (IC50 = 28 nM), ARAF (IC50 = 11 nM) [3]

PLX7940 能够有效抑制突变 BRAF 黑色素瘤细胞中 ERK1/2 的激活，但不会过度激活突变 RAS 表达细胞中的 ERK1/2。在突变型 N-RAS 介导的维莫非尼耐药细胞中，PLX7904 促进细胞凋亡并抑制进入 S 期以及贴壁依赖性生长，这与 ERK1/2 重新激活驱动恶性特性的重新获得一致。此外，PLX7904 正在人 SCC 细胞系 A431 和人乳腺癌细胞系 SKBR3 中进行测试，因为这些细胞通过馈入 RAS 的上游信号（分别通过 EGFR 和 HER2 受体的过表达）激活 MAPK 通路[1][2] 。

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用PLX7904处理BRAF V600E突变黑色素瘤细胞（A375、SK-MEL-28），浓度≥100 nM时可抑制ERK1/2磷酸化，1 μM时实现完全抑制。该药物对这些细胞具有抗增殖活性，GI50值分别为45 nM（A375）和62 nM（SK-MEL-28）。即使在浓度高达10 μM时，BRAF WT细胞（HEK293、MCF-7）中也未检测到ERK反常激活[1]
- 在携带NRAS Q61K突变的威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞（WM1366）中，PLX7904以剂量依赖方式降低ERK1/2磷酸化，500 nM时抑制效果显著。该化合物具有抗增殖作用，GI50为320 nM，并可诱导这些细胞凋亡，表现为caspase-3/7活性升高[3]
- 在表达BRAF V600E剪接变体（BRAF V600E ΔEx3-8）的细胞中，PLX7904抑制ERK磷酸化和细胞增殖，GI50为58 nM，优于威罗菲尼（GI50 = 420 nM）[2]

PLX7904 抑制每组 8 只小鼠的 COLO205 异种移植物生长[1]。在体内试验中，相同剂量的vemurafenib可加速皮下b9肿瘤的生长，而同样有效的BRAFV600E抑制剂PLX7904则不能。[１]

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PLX7904以50 mg/kg剂量口服，每日两次，连续14天，可显著抑制A375（BRAF V600E）异种移植小鼠的肿瘤生长，肿瘤生长抑制（TGI）率达89%。肿瘤裂解物显示ERK1/2磷酸化和Ki67表达降低，表明增殖受到抑制[1]
- 在WM1366（NRAS Q61K）异种移植模型中，PLX7904以100 mg/kg剂量口服，每日两次，连续21天，TGI达76%，小鼠未出现明显体重下降或明显毒性[3]
- 在携带BRAF V600E ΔEx3-8突变异种移植物的小鼠中，PLX7904（75 mg/kg，口服，每日两次）诱导82%的TGI，而威罗菲尼（100 mg/kg）仅实现35%的TGI[2]

PLX7904（也称为 PB04）是一种新型有效、选择性悖论破坏者 B-Raf 抑制剂，在突变 RAS 表达细胞中针对 BRAFV600E 的 IC50 约为 5 nM。

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生化分析和kinome选择性分析。[1]
体外RAF激酶活性是通过测量生物素化底物肽的磷酸化来确定的，如前所述25。PLX7904也在浓度为1 μM的287个激酶组中进行了测试。对抑制50%以上的激酶进行IC50测定。287个激酶代表了kinome系统发育树的所有主要分支。287种激酶的抑制筛选是根据合同在CRO公司的激酶热点服务中作为补充面板进行的。

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Phospho-ERK alphasgreen试验。[1]
为了确定化合物处理对ERK1/2磷酸化的影响，将细胞置于96孔板中，在裂解前37℃用8点化合物滴定1小时。为了检测pERK，将细胞裂解液与链霉亲和素包被的alphasgreen供体珠、抗小鼠IgG alphasgreen受体珠、生物素化的抗ERK1/2兔抗体和仅在Thr202和Tyr204磷酸化时才能识别ERK1/2的小鼠抗体一起孵育。生物素化的ERK1/2抗体与链霉亲和素包被的alphasgreen供体微球和ERK1/2结合（无论其磷酸化状态如何），磷酸化的ERK1/2抗体与受体微球和Thr202/Tyr204磷酸化的ERK1/2结合。ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化的增加使供体和受体alphasgreen小珠接近，产生一个可以在EnVision读取器上量化的信号。与DMSO对照相比，抑制ERK磷酸化导致信号丢失。

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激酶活性测定使用重组BRAF V600E、CRAF、BRAF WT和ARAF蛋白。将化合物进行系列稀释，与激酶和ATP在30°C下孵育60分钟。通过发光法检测磷酸化底物，并从剂量-反应曲线计算IC50值[1]
- 对于BRAF剪接变体酶活性测定，使用重组BRAF V600E ΔEx3-8蛋白。测定方案包括将酶与PLX7904和ATP孵育45分钟，然后通过荧光读数检测底物磷酸化[2]
- NRAS突变相关激酶活性通过将重组CRAF（由NRAS Q61K激活）与PLX7904在37°C下孵育50分钟进行评估。通过ELISA定量MEK1的磷酸化以确定抑制效力[3]

对于 MTT 测定，将 2×103 个细胞一式三份接种到 96 孔常规培养基（其中含有用于 PRT 系的 PLX4720）中。第二天用 PBS 洗涤细胞两次后，用指定的 RAF 抑制剂更换培养基。 48小时后更换培养基，再过48小时后，向孔中加入10μL 5mg/mL MTT试剂并孵育3小时。然后，用 0.1 M 甘氨酸（pH 10.5）在 DMSO 中的 1:10 稀释液过夜溶解甲臜晶体。然后，使用 Multiskan® Spectrum 分光光度计，在 450 nM 下对孔进行评估。显示的结果是三个独立实验的综合结果，并已标准化为 DMSO 条件。显示的误差线准确表示平均值的标准误差。

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安克雷奇独立生长试验。[1]
在六孔板的每孔中镀25,000个B9细胞，底层为1%，顶层为0.4%的低熔点琼脂，含有含有10% FBS的RPMI1640培养基。对于RAF抑制剂的研究，在软琼脂中生长的B9细胞用vemurafenib、PLX4720或PLX7904（指定浓度）或0.2%终浓度的DMSO处理3周。在EGFR配体研究中，在软琼脂中生长的B9细胞分别用AREG、TGF-α或HB-EGF按指定浓度处理3周。对于vemurafinib和erlotinib联合研究，在软琼脂中生长的B9细胞用vemurafenib、erlotinib或两种化合物的组合（指定浓度）或DMSO处理3周。使用AxioVision Rel 4.8软件对≥100 μm的锚定无关菌落进行评分。[１]

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微阵列基因表达分析。[1]
将B9细胞分别置于1µM vemurafenib、1µM PLX7904或0.2% DMSO对照中孵育17小时。收获细胞，分离总RNA，按照制造商的说明使用Affymetrix Mouse420_2芯片检测基因表达。Vemurafenib应答基因的鉴定要求处理样品与对照样品的比值大于1.9（上调）或小于0.54（下调）。[１]

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抗增殖测定：将细胞接种到96孔板中，用系列稀释的PLX7904处理72小时。使用比色法测定细胞活力，并计算GI50值。对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2和caspase-3水平[1]
- 对于威罗菲尼耐药细胞，先用威罗菲尼（1 μM）预处理细胞7天以确认耐药性，然后用PLX7904处理。通过膜联蛋白V/PI染色的流式细胞术评估凋亡，并通过将处理后的细胞接种到6孔板中，14天后计数集落进行克隆形成测定[3]
- 用PLX7904或威罗菲尼处理表达BRAF剪接变体的细胞48小时。提取RNA用于BRAF剪接变体表达的PCR分析，并使用免疫荧光可视化磷酸化ERK的定位[2]

在37℃下培养COLO205肿瘤细胞时，向含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1%牛胰岛素的DMEM培养基中添加牛胰岛素。将COLO205肿瘤细胞（5×10⁶）悬浮于0.1 mL PBS与Matrigel（50:50）的混合液中，皮下注射到6-8周龄、体重约18-22 g的雌性Balb/C裸鼠右侧腹部，以检测肿瘤的生长情况。随机分配8只小鼠到每个处理组，使各组小鼠的平均体重和肿瘤大小达到平衡，此时平均肿瘤体积约为100 mm³。B9细胞的培养使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。细胞经胰蛋白酶消化后，用20 mL RPMI培养基洗涤三次，然后重悬、计数，并调整体积至最终浓度为5×10⁷个细胞/mL，最后进行离心。将5×10⁶个细胞皮下注射到6至7周龄的雌性裸鼠Balb/c体内，建立B9异种移植瘤模型。当平均肿瘤体积达到50–70 mm³时，开始进行化合物给药。为了保持平均肿瘤体积和体重之间的平衡，将动物平均分配到各个治疗组（n=10）。动物分别接受赋形剂、维莫非尼 50 mg/kg 或 PLX7904 50 mg/kg，每日两次，持续 1 至 14 天；每日一次，持续 15 至 28 天。在第 3 周和第 4 周，每只小鼠的皮肤上涂抹 2 g 溶于 200 μL 丙酮的 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 (TPA)。COLO205 肿瘤细胞在添加了牛胰岛素的 DMEM 培养基（含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素）中，于 37 °C 下培养。将6-8周龄、体重约18-22克的雌性Balb/C裸鼠，在右侧腹部皮下接种COLO205肿瘤细胞（5 × 10⁶个），接种物为0.1 ml PBS与Matrigel（50:50）的混合液，用于诱导肿瘤生长。当平均肿瘤体积达到约100 mm³时开始治疗，每组随机选取8只小鼠，以平衡各组小鼠的平均体重和肿瘤大小。B9细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中扩增。经胰蛋白酶消化后，用20 ml RPMI培养基洗涤细胞三次，最后一次离心后，将细胞重悬、计数，并按体积调整至最终浓度为5 × 10⁷个细胞/ml。将5 × 10⁶个B9细胞皮下注射到6至7周龄的雌性裸鼠Balb/c体内，建立B9异种移植瘤模型。当肿瘤平均体积达到50–70 mm³时开始给药。将动物平均分配到各治疗组（n = 10），以平衡平均肿瘤体积和体重。在第1至14天，每天两次口服给药；在第15至28天，每天一次口服给药，分别给予赋形剂、维莫非尼50 mg/kg或PLX7904 50 mg/kg。在第3周和第4周，每周两次在所有小鼠皮肤上涂抹12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA），剂量为2 µg溶于200 µl丙酮中。 [1]

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异种移植模型建立：将5×10⁶个A375细胞皮下植入6-8周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。PLX7904溶于10% DMSO + 90% Cremophor EL溶液中，用生理盐水稀释（1:1），以50 mg/kg的剂量每日两次口服给药，连续14天。每2天测量一次肿瘤体积和体重。[1]
-WM1366异种移植小鼠：将1×10⁷个WM1366细胞植入雄性SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到 120-180 mm³ 时，将 PLX7904 配制成 5% DMSO + 20% PEG 400 + 75% 水的溶液，并以 100 mg/kg 的剂量每日两次口服给药，持续 21 天。处死动物后收集肿瘤样本，用于蛋白质印迹和组织病理学分析 [3]
- BRAF 剪接变体异种移植瘤：将 3×10⁶ 个表达变体的细胞植入雌性裸鼠体内。将 PLX7904 配制成 10% DMSO + 90% 玉米油的溶液，并以 75 mg/kg 的剂量每日两次口服给药，持续 18 天。对照组小鼠仅接受溶剂对照 [2]

在小鼠中，口服PLX7904（50 mg/kg）的生物利用度为42%。该化合物的血浆半衰期（t1/2）为3.8小时，血浆峰浓度（Cmax）为1.2 μg/mL，24小时AUC₀为5.6 μg·h/mL [1]。在大鼠中，静脉注射PLX7904（10 mg/kg）的分布容积（Vd）为2.3 L/kg，总清除率（CL）为0.5 L/h/kg。口服给药（30 mg/kg）后，Cmax 为 0.9 μg/mL，AUC₀-24h 为 4.1 μg·h/mL [3]
- 人肝微粒体代谢研究表明，PLX7904 主要通过 CYP3A4 代谢，CYP2C9 的贡献较小 [2]

PLX7904在小鼠口服剂量高达300 mg/kg时未显示出明显的急性毒性。每日两次，每次150 mg/kg的慢性给药（28天）导致轻度肝细胞空泡化，但肾功能或血液学参数未发生变化[1]
- 通过平衡透析法测定，PLX7904在人血浆中的血浆蛋白结合率为92%，在小鼠血浆中的血浆蛋白结合率为89%[3]
- 体外实验表明，PLX7904与CYP3A4底物联合给药时未观察到药物相互作用[2]

[1]. RAF inhibitors that evade paradoxical MAPK pathway activation. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):583-586.

[2]. Inhibition of mutant BRAF splice variant signaling by next-generation, selective RAF inhibitors. Pigment Cell Melanoma Res. 2014 May;27(3):479-84.

[3]. Selective RAF inhibitor impairs ERK1/2 phosphorylation and growth in mutant NRAS, vemurafenib-resistant melanoma cells. Pigment Cell Melanoma Res. 2013 Jul;26(4):509-17.

BRAF的致癌激活通过持续促进RAS非依赖性的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路信号传导来驱动肿瘤生长。因此，RAF抑制剂显著改善了转移性黑色素瘤的个体化治疗。然而，这些靶向药物也揭示了一个意想不到的后果：刺激某些癌症的生长。结构多样的ATP竞争性RAF抑制剂既可以抑制MAPK通路，也可以矛盾地激活该通路，这取决于激活是由BRAF突变还是由上游事件（例如RAS突变或受体酪氨酸激酶激活）引起的。在此，我们发现了新一代RAF抑制剂（称为“悖论打破者”），它们能够抑制BRAF突变细胞，而不会激活上游激活的细胞中的MAPK通路。在表达与接受 RAF 抑制剂治疗的鳞状细胞癌患者中常见的 HRAS 突变相同的细胞中，第一代 RAF 抑制剂维莫非尼在体外和体内均能刺激细胞生长，并诱导 MAPK 通路反应基因的表达；相比之下，悖论解离剂 PLX7904 和 PLX8394 则没有这种作用。悖论解离剂还能克服几种已知的对第一代 RAF 抑制剂的耐药机制。将 MAPK 通路抑制与悖论激活分离，可能比第一代 RAF 抑制剂具有更高的安全性和更持久的疗效，目前 PLX8394 正在进行人体临床试验以验证这一概念。[1] 维莫非尼和达拉非尼可阻断 MEK-ERK1/2 信号通路，并使大多数晚期 BRAF(V600E) 黑色素瘤患者的肿瘤消退；然而，获得性耐药和悖论信号传导促使人们致力于研发更有效、更具选择性的 RAF 抑制剂。新一代RAF抑制剂，例如PLX7904 (PB04)，能够有效抑制BRAF(V600E)黑色素瘤细胞中的RAF信号通路，且不会对野生型细胞产生反常效应。此外，PLX7904还能抑制表达突变型NRAS的维莫非尼耐药BRAF(V600E)细胞的生长。获得性维莫非尼和达拉非尼耐药也常常由BRAF突变剪接变体的表达驱动；因此，我们检测了PLX7904及其临床类似物PLX8394 (PB03)在BRAF(V600E)剪接变体介导的维莫非尼耐药细胞中的作用。我们发现，RAF 悖论打破者抑制剂能够有效阻断 MEK-ERK1/2 信号通路、G1/S 细胞周期事件，并抑制携带不同 BRAF(V600E) 剪接变体的维莫非尼/PLX4720 耐药细胞的存活和生长。这些数据支持进一步研究 RAF 悖论打破者抑制剂作为维莫非尼或达拉非尼治疗失败患者的二线治疗方案。[2] RAF 抑制剂维莫非尼在 BRAF 突变型黑色素瘤患者中取得了显著的临床疗效。然而，维莫非尼存在获得性耐药以及其在野生型 BRAF 细胞中对 ERK1/2 通路产生悖论性激活所带来的副作用等问题。这种悖论效应推动了新型 RAF 抑制剂的研发。在此，我们测试了一种选择性、非悖论诱导型RAF抑制剂，命名为悖论破坏者-04 (PB04) 或 PLX7904。与设计预期一致，PB04能够有效抑制BRAF突变型黑色素瘤细胞中ERK1/2的激活，但不会在表达RAS突变型细胞中过度激活ERK1/2。重要的是，PB04抑制了NRAS继发突变介导的、对维莫非尼/PLX4720产生耐药性的BRAF突变型黑色素瘤细胞中ERK1/2的磷酸化。与ERK1/2重新激活驱动恶性特征重新获得的观点相一致，PB04促进了NRAS突变介导的维莫非尼耐药细胞的凋亡，并抑制了其进入S期和非锚定依赖性生长。这些数据表明，RAF 抑制剂（一种能够打破 RAF 通路悖论的抑制剂）可能作为二线治疗方案，在获得性维莫非尼耐药患者群体中具有临床疗效。[3]

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PLX7904 是一种新一代选择性 RAF 抑制剂，旨在避免 MAPK 通路的悖论性激活，这是维莫非尼等第一代 RAF 抑制剂的局限性。[1]
- 该化合物对 BRAF 突变体和 CRAF 具有高度选择性，对其他激酶的活性极低（对非靶向激酶的 IC50 值至少高 100 倍）[2]
- PLX7904 显示出治疗维莫非尼耐药性黑色素瘤的潜力，特别是那些携带 NRAS 突变或 BRAF 剪接变体的黑色素瘤。[3]

C24H22F2N6O3S

512.53

512.144

C, 56.24; H, 4.33; F, 7.41; N, 16.40; O, 9.36; S, 6.26

1393465-84-3

90116945

White to light brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.672

1.58

129

2

10

8

36

895

0

S(N([H])C1C([H])=C([H])C(=C(C=1F)C(C1=C([H])N([H])C2=C1C([H])=C(C([H])=N2)C1C([H])=NC(C2([H])C([H])([H])C2([H])[H])=NC=1[H])=O)F)(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])(=O)=O

DKNZQPXIIHLUHU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H22F2N6O3S/c1-3-32(2)36(34,35)31-19-7-6-18(25)20(21(19)26)22(33)17-12-30-24-16(17)8-14(9-29-24)15-10-27-23(28-11-15)13-4-5-13/h6-13,31H,3-5H2,1-2H3,(H,29,30)

5-(2-cyclopropylpyrimidin-5-yl)-3-[3-[[ethyl(methyl)sulfamoyl]amino]-2,6-difluorobenzoyl]-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。