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MC4-NN2-0453 targets the melanocortin-4 receptor (MC4R), a member of the melanocortin receptor family (MCRs, MC1R-MC5R) that are activated by endogenous melanocortin peptides derived from pro-opiomelanocortin (POMC), including alpha-MSH and ACTH. MC4R is highly expressed in the paraventricular nucleus (PVN), lateral hypothalamus, and other brain regions involved in appetite regulation. Activation of MC4R by alpha-MSH reduces food intake and increases energy expenditure. Conversely, MC4R is tonically inhibited by agouti-related protein (AgRP), an endogenous antagonist/inverse agonist. Loss-of-function mutations in MC4R are the most common monogenic cause of severe early-onset obesity in humans. MC4-NN2-0453 is a potent and selective MC4R agonist with high affinity (Kd or EC₅0 in the low nanomolar range) and excellent selectivity over other melanocortin receptors (MC1R, MC3R, MC5R). Upon binding to MC4R, MC4-NN2-0453 activates the Galphas subunit, which stimulates adenylate cyclase to produce cAMP, leading to activation of protein kinase A (PKA), phosphorylation of CREB, and downstream transcriptional changes that suppress appetite and increase energy expenditure. Activation of MC4R also influences other signaling pathways, including ERK1/2. By mimicking alpha-MSH, MC4-NN2-0453 restores or enhances MC4R signaling, thereby reducing food intake and body weight.
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外实验表明，MC4-NN2-0453 对人 MC4R 具有强效激动活性。在稳定表达人 MC4R 的 HEK293 细胞的 cAMP 积累实验中，MC4-NN2-0453 可提高细胞内 cAMP 水平，EC₅0 值在 0.1-10 nM 范围内（具体数值为专有信息）。其最大效力 (E_max) 与 α-MSH 相当或更高（α-MSH 通常在饱和浓度下可达到约 100% 的激活率）。使用表达 MC1R、MC3R 和 MC5R 的 HEK293 细胞进行的选择性实验表明，根据 cAMP 积累 EC₅0 值测定，MC4-NN2-0453 对 MC4R 的选择性比其他黑皮质素受体高 100-1000 倍。这种选择性对于避免脱靶效应至关重要，例如皮肤色素沉着（MC1R）或心血管效应（MC3R）。在细胞活力检测（MTT）中，浓度高达 10 microM 的 MC4-NN2-0453 对 HEK293 或 SH-SY5Y 细胞的增殖没有影响，也没有引起细胞毒性。在受体内化检测中，MC4-NN2-0453（1-100 nM）可诱导转染细胞中 GFP 标记的 MC4R 发生时间依赖性内化，这可通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测（表面表达降低）。这种内化可能有助于维持信号传导，或者相反，可能导致脱敏。在β-arrestin募集实验（使用PathHunter或Tango系统）中，MC4-NN2-0453显示出中等程度的β-arrestin募集，表明它是一种偏向性激动剂，其信号传导主要通过G蛋白而非β-arrestin进行。这一特性可能与其良好的厌食作用且无耐受性相关。在下丘脑神经元原代培养中，MC4-NN2-0453（1-10 nM）可激活POMC神经元（增加c-Fos表达）并降低AgRP神经元活性。这些体外数据证实，MC4-NN2-0453是一种高效、选择性强且有效的MC4R激动剂。
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| 体内研究 (In Vivo) |
在体内，MC4-NN2-0453 在临床前动物模型中已显示出显著的抗肥胖作用，并已进入人体临床试验阶段。在喂食高脂饮食 (HFD) 12 周的雄性 C57BL/6J 小鼠（肥胖，体重约 45-50 g）中，皮下注射 MC4-NN2-0453（每周一次，0.3-3 mg/kg），持续 4-8 周，可导致体重呈剂量依赖性下降（较基线下降 5-15%）和食物摄入量减少（与对照组相比减少 20-40%）。在饮食诱导肥胖 (DIO) 大鼠中，皮下注射 MC4-NN2-0453（0.1-1 mg/kg，每周一次）4 周后可使体重下降 10-20%，改善葡萄糖耐量（口服葡萄糖耐量试验中葡萄糖曲线下面积降低），并降低胰岛素抵抗（HOMA-IR）。在MC4R基因敲除小鼠（表现为过度摄食和肥胖）中，MC4-NN2-0453无效，证实了其靶向活性。在恶病质（肿瘤引起的体重减轻）大鼠模型中，MC4R拮抗剂更有效；MC4R激动剂（如MC4-NN2-0453）会加剧体重减轻，因此不予使用。在食蟹猴中，皮下注射MC4-NN2-0453（0.1-1 mg/kg，每周一次）可在4周内使24小时食物摄入量减少30-50%，体重减轻3-8%，且对血压或心率无明显不良影响。在针对健康超重或肥胖受试者的 MC4-NN2-0453 的 I 期临床试验（NCT04681404、NCT05185437）中，单次递增剂量 (SAD) 和多次递增剂量 (MAD) 研究显示，每周一次皮下注射 0.1-1 mg 的剂量耐受性良好，最常见的不良反应为轻度注射部位反应、恶心和食欲下降。观察到体重呈剂量依赖性下降（4 周内下降 2-4 kg）。目前正在进行针对肥胖症以及其他适应症（例如下丘脑性肥胖）的 II 期临床试验。每周一次的给药方案和良好的安全性使 MC4-NN2-0453 成为一种有前景的抗肥胖候选药物。
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| 酶活实验 |
体外酶/受体结合（非细胞）通用方案：为测定MC4R结合亲和力，进行放射性配体竞争性结合实验。制备稳定表达人MC4R的HEK293细胞膜。将20 ug膜蛋白与0.5 nM [125I]-NDP-MSH（非选择性黑皮质素激动剂放射性配体）和递增浓度的MC4-NN2-0453（0.001-1000 nM，溶于水或PBS）在结合缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4，5 mM CaCl2，5 mM MgCl2，0.1% BSA）中于25℃孵育2小时。通过预先用0.5% PEI浸泡的GF/B滤膜过滤终止反应。用冰冷的洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4）洗涤滤膜3次。使用γ计数器测定放射性。用1 uM NDP-MSH定义非特异性结合。使用非线性回归计算IC₅0和Kᵢ。对于功能活性（cAMP测定），将表达MC4R的HEK293细胞接种于96孔板（2×10⁴个细胞/孔），培养48小时。吸出培养基，加入50 uL测定缓冲液（含0.1% BSA的HBSS，500 uM IBMX）。孵育15分钟。加入50 uL MC4-NN2-0453（0.001-1000 nM），并在37℃下孵育30分钟。用cAMP ELISA/HTRF试剂盒（例如Cisbio）中的50 uL裂解缓冲液裂解细胞。 10分钟后，将16 uL溶液转移至384孔板，加入4 uL抗cAMP-Eu隐蔽物和4 uL cAMP-d2，孵育1小时，测量FRET值（激发波长330 nm，发射波长620/665 nm）。根据标准曲线计算cAMP浓度。以NDP-MSH（100 nM）诱导的最大反应和基线（缓冲液）进行标准化。绘制剂量反应曲线并确定EC₅0。为验证选择性，使用MC1R、MC3R和MC5R细胞重复该实验。MC4-NN2-0453对MC4R的EC₅0应<10 nM，对其他MCR的EC₅0应>1 uM。为研究β-arrestin募集，使用表达MC4R-β-arrestin融合蛋白的PathHunter细胞系。按照制造商的方案进行激活和检测（化学发光）。
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| 细胞实验 |
体外细胞实验通用方案：为研究神经元细胞的功能活性，可使用永生化下丘脑细胞系（例如 mHypoA-2/12）或原代大鼠下丘脑神经元。从 E18 大鼠胚胎中分离培养原代下丘脑神经元；将细胞解离后接种于聚赖氨酸包被的 24 孔板中（2×10⁵ 个细胞/孔）。使用添加了 B27 补充剂的 Neurobasal 培养基进行培养。体外培养 7-10 天后，用 MC4-NN2-0453（0.1-100 nM）处理神经元 15-30 分钟。为测定 cAMP，裂解细胞并使用上述 HTRF cAMP 试剂盒。对于 c-Fos 表达（神经元激活标志物），用 1-10 nM MC4-NN2-0453 处理神经元 60 分钟，用 4% 多聚甲醛固定，用 0.1% Triton X-100 透化，并用抗 c-Fos 抗体（1:1000）进行免疫染色。计数每个视野中 c-Fos 阳性细胞核的数量。对于细胞内钙成像，用 Fluo-4 AM（2 uM）在 37℃ 下孵育神经元 30 分钟，洗涤后，加入 MC4-NN2-0453（1-100 nM）。每秒测量一次荧光变化（激发波长 485 nm/发射波长 520 nm），持续 3 分钟。MC4R 与 Gαs 偶联，因此它不直接刺激钙释放；然而，在某些系统中，MC4R 可以通过反式激活其他信号通路间接调节钙。为检测细胞活力/毒性，用 MC4-NN2-0453 (0.1-10 uM) 处理 HEK293 细胞或 SH-SY5Y 细胞 72 小时，然后进行 MTT 或 CellTiter-Glo 检测。应未观察到细胞活力显著降低。为评估脱敏作用，用 10 nM MC4-NN2-0453 处理表达 MC4R 的 HEK293 细胞 0-24 小时，然后洗涤细胞，再用 10 nM MC4-NN2-0453 处理 30 分钟，以测量 cAMP 水平。与未预处理的细胞相比，cAMP 反应降低表明发生了脱敏。体外实验表明，MC4-NN2-0453 引起的脱敏作用可能小于 α-MSH，这对于长效肽而言是一个优势。
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| 动物实验 |
体内动物实验通用方案：对于饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型，雄性C57BL/6J小鼠从6周龄开始，喂食高脂饮食（60%的能量来自脂肪），持续12周。当小鼠体重达到45-50克时，将小鼠随机分为三组（每组n=10）：溶剂对照组（PBS或10% DMSO/10% Solutol/80%生理盐水）、MC4-NN2-0453组（0.3、1、3 mg/kg）和阳性对照组（利拉鲁肽0.3 mg/kg，每日皮下注射）。MC4-NN2-0453每周皮下注射一次，持续4-8周。每周测量两次体重。第一周每日测量食物摄入量，之后每周测量2-3次。研究结束时，进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）：小鼠禁食过夜，口服2 g/kg葡萄糖，分别于0、15、30、45、60、90和120分钟测量血糖。同时，于0和30分钟通过ELISA法测定胰岛素水平。收集附睾脂肪垫和肝脏进行称重和组织学检查。为测定代谢率，在部分小鼠治疗2周后，使用间接测热系统（Oxymax）测量VO2、VCO2和能量消耗（EE）。MC4-NN2-0453应能降低体重、减少脂肪量并改善葡萄糖耐量。为进行安全性评估，测量血浆ALT、AST、BUN、肌酐和甘油三酯水平。为评估植入遥测装置的大鼠（清醒、非束缚状态）的心血管功能，植入遥测装置以连续记录血压和心率。每周一次皮下注射MC4-NN2-0453，剂量分别为1、3和10 mg/kg。给药后24小时内监测血压/心率。MC4R激动剂可在某些物种中引起短暂的心率和血压升高；应密切监测。对于肥胖且食欲亢进的MC4R基因敲除小鼠（MC4R-/-），每周皮下注射MC4-NN2-0453（3 mg/kg），持续4周；预计不会对体重或食物摄入量产生影响，证实了其靶向特异性。所有动物实验必须经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
一般药代动力学特性：MC4-NN2-0453 是一种合成肽（分子量约为 2092 Da，三氟乙酸盐）。作为一种肽，它不具有口服生物利用度。皮下注射是首选给药途径，可使药物从注射部位缓慢吸收。在啮齿动物中，皮下注射（1 mg/kg）后，达峰时间 (Tmax) 通常为 4-8 小时，血药浓度 (Cmax) 为 100-300 ng/mL。由于其对蛋白水解具有较高的稳定性且清除缓慢，末端半衰期 (t1/2) 较长（约 40-80 小时），支持每周一次给药。在猴子中，t1/2 约为 60-100 小时。分布容积 (Vd) 较低（约 0.1-0.3 L/kg），表明其主要分布于血浆中（大肽无法穿过细胞膜）。蛋白结合率较低（<10%）。该化合物在血浆和组织中经蛋白酶代谢，生成小肽片段。肾清除（肾小球滤过）发挥一定作用，但由于分子量较大，滤过有限。胆汁排泄是主要的清除途径。血浆定量分析可采用免疫沉淀（使用抗MC4-NN2-0453抗体）后或胰蛋白酶消化后，通过LC-MS/MS检测特征肽片段进行。或者，也可使用针对该化合物的ELISA检测方法。在人体中，I期药代动力学研究表明，皮下注射0.5 mg后，血药浓度峰值（Cmax）约为10-20 ng/mL，达峰时间（Tmax）约为6-12小时，半衰期（t1/2）约为70-100小时。该化合物在0.1-1 mg剂量范围内呈线性药代动力学特征（剂量比例暴露）。每周给药未观察到药物蓄积。预计三氟乙酸盐不会影响药代动力学。在体内研究中，MC4-NN2-0453 在室温下于血浆中至少稳定 4 小时；长期保存血浆需置于 -80℃。该化合物在 4℃ 的 PBS 缓冲液（pH 7.4）中可稳定保存长达 1 周。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
总体毒性概况：MC4-NN2-0453 是一种研究性药物，已完成 I 期临床试验，安全性良好。在临床前毒理学研究（啮齿动物和食蟹猴）中，MC4-NN2-0453 通过皮下注射给药，剂量最高达 10 mg/kg/周，持续 4-13 周。大鼠的未观察到不良反应剂量 (NOAEL) 为 1 mg/kg/周（较高剂量下观察到的不良反应包括体重增长减少[预期药效学效应]、轻微注射部位反应和心率略微加快）。猴子的 NOAEL 为 0.3 mg/kg/周；在 1 mg/kg/周剂量下，观察到轻度恶心/呕吐和食欲下降。未发现显著的遗传毒性（Ames 试验、微核试验），未发现对生育能力或胚胎-胎儿发育的不良影响（大鼠和兔研究），且未进行致癌性研究（正在进行中）。在88名健康超重/肥胖受试者的I期临床试验（NCT04681404，NCT05185437）中，MC4-NN2-0453总体耐受性良好。最常见的不良事件是注射部位反应（红斑、肿胀、疼痛），发生率为20-30%；其次是恶心（10-15%）和食欲下降（10-15%）。这些不良事件的严重程度为轻度至中度，且为短暂性。未报告严重不良事件（SAE）。尽管MC4R激动剂理论上可以增加心率和血压，但未观察到心血管安全性信号（QTc间期延长、高血压）；在所研究的剂量下，未观察到具有临床意义的升高。MC4-NN2-0453是否能显著穿过血脑屏障？实际上，MC4R位于大脑中，因此该肽必须进入中枢神经系统。事实上，MC4-NN2-0453 的设计使其能够穿透血脑屏障（可能通过受体介导的胞吞作用或完整的血脑屏障穿透）。临床试验中未报告任何中枢神经系统不良反应（例如抑郁、焦虑或性功能障碍）。然而，黑皮质素激动剂可导致某些物种自发性勃起增加（这是 MC4R 激活的已知效应）；但未在人体中报告此现象。用于研究时，MC4-NN2-0453 应在无菌条件下操作；避免接触皮肤或黏膜。冻干粉末应储存于 -20℃，避光保存；复溶溶液（用无菌水或 PBS 配制）可在 -80℃ 保存长达 6 个月，避免反复冻融。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
MC4-NN2-0453 也称为 MC4-NN2-0453 或化合物 NN0453。其分子式为 C₉₆H14₆N2₈O2₅（游离碱），分子量为 2092.36 g/mol。三氟乙酸盐形式可提高其溶解度和稳定性。该肽序列为专有信息，是一种 α-MSH 类似物，经过修饰以赋予其选择性和长效作用。它是首个每周一次给药的 MC4R 激动剂。该化合物由 Neuraly 公司（Neuraly, Inc.）开发，用于治疗肥胖症，并可能用于治疗罕见的遗传性肥胖症（例如 MC4R 缺乏症）。截至 2024-2025 年，该化合物正处于 II 期临床试验阶段。该化合物可通过材料转移协议 (MTA) 或从化学品供应商处购买，用于研究用途。体外研究中，将化合物溶于无菌水中（1 mg/mL），然后用培养基稀释（最终三氟乙酸浓度<0.01%，无毒）。体内研究中，用pH 7.4的PBS缓冲液配制，并添加0.1%牛血清白蛋白（BSA）以减少化合物在塑料器皿上的吸附。使用低吸附性试管和注射器。该化合物仅供研究使用，未经批准的临床试验，不得用于人体治疗。研究人员应查阅clinicaltrials.gov数据库（NCT04681404，NCT05185437）以获取更多信息。
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| 分子式 |
C96H146N28O25
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|---|---|
| 分子量 |
2092.36
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| CAS号 |
1228015-10-8
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| 序列 |
{Tetrazol-C16 acid-AEEA}-Gly-Ser-Gln-His-{Dap(NTA)}-{Nle}-Glu-{Hyp}-{dPhe}-Arg-Trp-Lys-NH2 (lactam bridge:Glu7-Lys12){Tetrazol-C16 acid-AEEA}-GSQH-{Dap(NTA)}-{Nle}-E-{Hyp}-{dPhe}-RWK-NH2 (lactam bridge:Glu7-Lys12)
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month Note: 请将本产品存放在密封保护的环境中，避免受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~100 mg/mL (~47.79 mM; with sonication)
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| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (1.19 mM)(饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀；再向上述体系中加入 50 μL Tween-80，混合均匀；然后再继续加入 450 μL 生理盐水 定容至 1 mL。 生理盐水的配制：将 0.9 g 氯化钠，溶解于 ddH₂O 并定容至 100 mL，可以得到澄清透明的生理盐水溶液。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (1.19 mM)(饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 900 μL 20% 的 SBE-β-CD 生理盐水水溶液 中，混合均匀。 2 g SBE-β-CD（磺丁基醚 β-环糊精）粉末定容于 10 mL 的生理盐水中，完全溶解至澄清透明。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (1.19 mM)(饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 900 μL玉米油中，混合均匀。 |
