MR-L2

PDE4; Long-form isoforms of cyclic AMP-specific phosphodiesterase 4 (PDE4), including PDE4A4, PDE4B1, PDE4C3, and PDE4D5 [1]
MR-L2 targets long-isoform phosphodiesterase-4 (PDE4), a family of enzymes that hydrolyze cyclic AMP (cAMP). Unlike PDE4 inhibitors, MR-L2 is a reversible and noncompetitive allosteric activator of PDE4 long isoforms. It activates PDE4A4, PDE4B1, PDE4C3, and PDE4D5. By activating PDE4, MR-L2 enhances cAMP hydrolysis, thereby reducing intracellular cAMP levels. This mechanism is opposite to that of PDE4 inhibitors, which increase cAMP levels. MR-L2 serves as a valuable tool for studying PDE4 regulation and cAMP signaling in various biological contexts.

MR-L2 以浓度依赖的方式激活所有四个 PDE4 亚家族（PDE4A4、PDE4B1、PDE4C3 和 PDE4D5）的代表性长型 PDE4 同工酶。对于 PDE4D5，在最大有效浓度下，其活性较基础水平提高了约 60%。[1] MR-L2 不能激活短型 PDE4 同工酶（PDE4A1、PDE4B2 和 PDE4D1/2），也不能激活仅包含 PDE4D 核心催化结构域（不含 UCR1、UCR2 和 C 端尾部）的工程化构建体。[1] MR-L2 不能增强 PDE 超家族中其他 10 个家族的代表性同工酶的活性，表明其对 PDE4 家族具有选择性。 [1]
对MR-L2作用于PDE4D5的动力学分析表明，MR-L2是一种可逆的非竞争性激活剂，它能提高cAMP水解的表观Vmax，而不影响cAMP的表观Km。[1]
PDE4D5的S126D磷酸模拟突变体（组成型激活以模拟PKA磷酸化）对MR-L2的激活敏感性几乎完全丧失。[1]
PDE4D5的S133D磷酸模拟突变体（模拟MK2磷酸化）被MR-L2激活的程度与野生型PDE4D5相似。与 S126D 单突变体相比，双突变体 S126D:S133D-PDE4D5 对 MR-L2 激活的敏感性部分恢复。[1] PDE4D5 的 S651D 磷酸模拟突变体（模拟 Erk 磷酸化）被 MR-L2 激活的水平与野生型 PDE4D5 相当。[1] 单体突变体 DD1-R499D-PDE4D5（二聚化缺陷）对 MR-L2 激活的敏感性完全丧失。在MDCK细胞中，MR-L2（3 μM，预处理1小时）显著抑制了福斯克林（3 μM，15分钟）刺激的cAMP积累（n=7个独立实验的平均值）。在MDCK细胞中，MR-L2（3 μM）对福斯克林刺激的cAMP积累的抑制作用可被PDE4抑制剂罗氟司特（100 nM）联合处理所消除。在MDCK细胞中，MR-L2（3 μM，预处理1小时）显著降低了福斯克林（3 μM，15分钟）刺激后的细胞外cAMP水平，表明细胞内cAMP的减少并非由于其排泄增加所致。 [1]
在二维培养中，通过基于xCELLigence阻抗的检测方法评估，MR-L2对MDCK细胞增殖无细胞毒性作用。[1]
在MDCK囊肿形成实验中，PDE4抑制剂罗利普兰以浓度依赖的方式加剧了激动剂驱动的囊肿形成。[1]
在MDCK囊肿形成实验中，MR-L2以浓度依赖的方式抑制了PGE2（300 nM）刺激的囊肿形成，EC50为1 μM。[1]
在MDCK囊肿形成实验中，与罗氟司特（100 nM）联合处理消除了MR-L2（3 μM）对PGE2刺激的囊肿生长的抑制作用。 [1]
在MDCK囊肿检测中，MR-L2 (3 μM) 使囊肿培养物中DNA标准化的ATP水平降低了15.6% (±30% SD)。[1]
在MDCK细胞中，MR-L2 (3 μM) 抑制了福斯克林诱导的囊肿形成，且抑制作用遍及不同浓度的福斯克林。[1]
在MDCK细胞中，MR-L2以浓度依赖的方式抑制了PGE2刺激的CFTR介导的膜去极化，其剂量依赖性与囊肿抑制的剂量依赖性高度一致。[1]
在OX161细胞（永生化ADPKD患者来源细胞系）中，PDE4抑制剂罗利普兰加剧了囊肿的扩张。 [1]
在OX161细胞中，MR-L2以浓度依赖的方式抑制PGE2刺激的囊肿形成。[1]
在原代人ADPKD患者来源的肾脏上皮细胞中，MR-L2抑制自发性囊肿形成和加压素（10 nM）加剧的囊肿形成，且不影响细胞活力（通过基于ATP的发光测定法评估）。[1]

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在MDCK细胞中，MR-L2（0.3-10 μM；1 h）有效减少囊肿的形成和cAMP的升高[1]。

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MR-L2在体外表现出PDE4激活剂的活性。它激活包括PDE4A4、PDE4B1、PDE4C3和PDE4D5在内的代表性PDE4长亚型。该化合物能抑制 PGE2 诱导的 MDCK 细胞囊肿形成，EC50 值为 1.2 µM。该细胞实验证实了该化合物在上皮细胞中的功能活性。MR-L2 是一种可逆的非竞争性变构激活剂，这意味着它结合于一个不同于催化位点的位点，并且不与底物竞争。这些体外实验结果证实了该化合物作为 PDE4 激活剂的独特作用机制。

现有文献中关于MR-L2体内活性的数据并不丰富。该化合物主要用作体外生化和药理学研究的工具。其抑制PGE2诱导的MDCK细胞囊肿形成的能力提示其可能对上皮细胞生理产生影响。需要开展进一步的体内研究，包括在涉及PDE4和cAMP信号通路疾病的动物模型中进行评估，才能全面了解该化合物的治疗潜力。MR-L2是研究疾病背景下PDE4调控的宝贵工具。

使用细胞裂解液进行 cAMP 磷酸二酯酶活性测定。将细胞收集于 KHEM 缓冲液（50 mM KCl、10 mM EGTA、50 mM Hepes pH 7.2、1.92 mM MgCl2）中，并通过机械破碎进行裂解。裂解液先以 2,000 × g 离心 10 分钟进行预清除，再以 100,000 × g 离心 30 分钟。采用 BCA 法测定上清液的蛋白浓度。测定中使用的蛋白浓度（通常为每次反应 200 ng 至 1 μg）和孵育时间（10 分钟）均以达到线性反应速率为准。在不同浓度的 MR-L2 存在下评估 PDE4 同工酶的活性。 [1]
采用Eadie-Hofstee作图法进行动力学分析，测定在不同浓度MR-L2（3、10、30和100 μM）存在下，PDE4D5对cAMP水解的Vmax和Km值。[1]

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MR-L2的体外酶活性测定包括测量其对PDE4酶活性的激活作用。表达并纯化重组人PDE4长亚型（PDE4A4、PDE4B1、PDE4C3、PDE4D5）。通过闪烁邻近法或荧光偏振法测定cAMP水解为AMP来评估酶活性。将MR-L2与酶和底物在不同浓度下孵育。化合物的激活作用以EC50或活性倍数增加来量化。测定缓冲液通常含有 Tris-HCl、MgCl2 和适当的酶活性成分。

cAMP ELISA：使用商业化的 cAMP ELISA 试剂盒，按照制造商的说明进行检测。MDCK 细胞用 MR-L2 预处理 1 小时，然后用福斯克林 (3 μM) 处理 15 分钟。[1] MDCK 囊肿测定：使用大鼠尾胶原蛋白 I 型构建三维基质（终浓度 1 mg/mL）。MDCK 细胞在 24 孔或 96 孔板中培养。以 4 倍放大倍率采集图像，并记录囊肿直径。囊肿体积 (V) 使用公式 V = 4/3πr³ 计算，其中 r 为半径。通常，每个处理条件下测量 100-300 个囊肿。对于 ATP 测定，首先用 20 μM Hoechst 在 37°C 下标记 DNA 1 小时，然后通过 361-486 nm 的荧光测量进行定量。随后使用 CellTiter-Glo 3D 试剂评估 ATP 水平。[1]
OX161 囊肿检测：培养 OX161 细胞，并按照先前描述的方法进行检测 (42, 61)。[1]
原代人肾细胞囊肿检测：将来自 ADPKD 患者的单囊肿或组织来源的原代培养物培养于含有专有培养基的生物凝胶中。在 96 孔板中进行手动成像和囊肿计数，并对 384 孔板进行全孔自动成像。[1]
CFTR 检测：在检测前 4 天，将 MDCK 细胞接种于 96 孔透明底检测板中。实验在低氯缓冲液（140 mM 葡萄糖酸钠、5 mM 葡萄糖酸钾、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES 游离酸、1 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂，用 NaOH 调节 pH 至 7.4）中进行，并添加 FLIPR 膜电位检测试剂盒 Blue 和阿米洛利 (10 μM)。使用 Flex Station 3 实时荧光分析仪，在激发波长 530 nm 和发射波长 565 nm 下记录荧光测量值。[1]
xCELLigence 检测：将 MDCK 细胞以每孔 5,000 个细胞的密度接种，并在用 MR-L2 处理前使其贴壁 24 小时。使用基于阻抗的测量方法监测细胞增殖。 [1]
蛋白质印迹：将细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物的全细胞裂解缓冲液[1% Triton X-100、25 mM Hepes、2.5 mM EDTA、150 mM NaCl、50 mM NaF、30 mM NaPPi]中裂解20分钟。通过14,000 × g离心去除不溶性物质。在进行SDS-PAGE和免疫印迹分析之前，使用针对PDE4亚型和β-肌动蛋白的抗血清，通过BCA法测定蛋白质浓度。 [1]

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细胞活力检测[1]
细胞类型： Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞系
测试浓度： 0.3、1、3 和 10 μM
孵育时间： 1 小时
实验结果： 抑制 MDCK 细胞中 cAMP 水平升高，但不增强 cAMP 分泌。抑制 MDCK 细胞中囊肿形成，EC50 值为 1.2 µM。在未刺激和加压素处理的培养条件下，均抑制 3D 培养中囊肿的形成，但对细胞活力无影响。

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MR-L2 的体外细胞检测通常使用 MDCK 细胞来评估其对囊肿形成的影响。将MDCK细胞培养于三维基质中，并用PGE2刺激诱导囊肿形成。加入不同浓度的MR-L2。使用显微镜对囊肿的数量和大小进行定量分析。化合物抑制囊肿形成的能力以EC50值表示。此外，可使用ELISA检测细胞内cAMP水平以确认PDE4的激活。这些检测证实了该化合物的细胞活性，并支持其在表皮细胞生理学研究中的应用。

MR-L2 的体内动物实验数据尚不充分。作为一种主要用于体外研究的实验化合物，MR-L2 尚未在动物模型中进行广泛测试。标准的体内研究将采用涉及 PDE4 和 cAMP 信号通路疾病的动物模型，例如炎症或纤维化疾病。MR-L2 将通过口服或肠外途径给药。研究将评估其对 cAMP 水平和疾病表型的药效学影响。需要开展进一步的研究来阐明其体内活性。

MR-L2的药代动力学特性尚未得到充分研究。作为一种分子量为441.71的小分子PDE4激活剂，该化合物预计具有良好的生物利用度。其化学结构中包含卤素取代基，这可能会影响其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性。该化合物具有细胞渗透性，提示其具有良好的膜穿透性。需要进一步的药代动力学研究来全面表征其药代动力学特征。

在二维培养中，通过基于xCELLigence阻抗的检测方法评估，MR-L2对MDCK细胞增殖没有细胞毒性作用。[1] 在原代人ADPKD患者来源的肾脏上皮细胞中，通过基于ATP的发光检测方法评估，MR-L2处理未对细胞活力产生不利影响。[1] 目前，MR-L2的毒理学数据在公开领域并不广泛。作为一种用于生化和药理学研究的实验化合物，MR-L2尚未经过全面的毒理学评估。可能已在细胞系中进行过标准细胞毒性试验，以评估细胞实验的安全范围。在动物研究中，将监测耐受性和潜在的不良反应。在临床开发之前，需要进行进一步的临床前毒理学研究以评估其安全性。

[1]. Small-molecule allosteric activators of PDE4 long form cyclic AMP phosphodiesterases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jul 2;116(27):13320-13329.

MR-L2是一种N取代的2-(3-芳基-1H-1,2,4-三唑-1-基)乙酰胺衍生物，作为长型PDE4亚型的选择性别构激活剂，模拟PKA磷酸化对二聚体PDE4长型亚型的刺激作用。[1]
MR-L2的作用机制需要长型（而非短型）PDE4亚型所采用的二聚体状态，并涉及对PDE4长型二聚体组装中自抑制因子UCR2交叉封闭的调节。[1]
MR-L2显示出降低细胞内cAMP水平和抑制多种体外自体显性多囊肾病（ADPKD）模型中囊肿形成的能力，包括MDCK细胞、永生化ADPKD患者衍生的OX161细胞和原代人类ADPKD患者衍生的肾上皮细胞。[1]
该化合物抑制PGE2刺激的MDCK细胞CFTR介导的膜去极化，与由于局部cAMP水平降低而导致的PKA活性降低一致。[1]
MR-L2在细胞测定（cAMP抑制和囊肿形成）中的效力高于生化酶活化测定，表明由于细胞环境依赖的构象和/或翻译后修饰状态，目标PDE4长型亚型的敏感性增强。[1]

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MR-L2是一种可逆的非竞争性长型PDE4别构激活剂，激活PDE4A4、PDE4B1、PDE4C3和PDE4D5。它以1.2 µM的EC50抑制PGE2诱导的MDCK细胞囊肿形成。该化合物用于研究cAMP信号传导、PDE4调节和上皮细胞生理。其分子量为441.71，化学式为C19H16Cl3FN4O。尚未报告临床试验或监管批准。

C19H16CL3FN4O

441.71394443512

440.037

2374703-19-0

138911347

White to light yellow solid powder

5.4

59.8

1

4

6

28

521

0

ClC1C=C(C=C(C=1)CNC(CN1C(CC)=NC(C2C=CC(=C(C=2)F)Cl)=N1)=O)Cl

JXACCOKEEPXHCF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16Cl3FN4O/c1-2-17-25-19(12-3-4-15(22)16(23)7-12)26-27(17)10-18(28)24-9-11-5-13(20)8-14(21)6-11/h3-8H,2,9-10H2,1H3,(H,24,28)

2-[3-(4-chloro-3-fluorophenyl)-5-ethyl-1,2,4-triazol-1-yl]-N-[(3,5-dichlorophenyl)methyl]acetamide

MR-L2; MR-L-2; 2374703-19-0; MR L2; CHEMBL5407478; C19H16Cl3FN4O;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 83.33 mg/mL (188.65 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。