BMS-986224

Kd: 0.3 nM (APJ receptor)[1]

BMS-986224 对人 APJ 的 EC50 为 0.02 nM，并完全阻断毛喉素介导的 cAMP 合成。中国仓鼠卵巢-K1 或 HEK293 ZF 细胞在 β-arrestin 募集、ERK 磷酸化和 APJ 内化方面对 BMS-986224 (0-100 nM) 完全响应[1]。强效选择性 APJ 受体激动剂 BMS-986224 显示出类似于 (Pyr1) apelin-13[1] 的信号传导谱。

在 RHR 模型中，BMS-986224（0.192 mg/kg 或 3 mg/kg；SC 输注；每日）通过将每搏输出量和心输出量增加至健康动物中观察到的水平，产生与依那普利不同的效果，但无法预防心脏肥大和纤维化[1]。

GPCR选择性分析[1]
进行GPCR选择性测定以评估BBMS-986224与其他GPCR（腺苷A2A；肾上腺素能α1B、1D、2A和2C，肾上腺素能β1和β2；大麻素CB1；多巴胺D1和D2；组胺H1和H2；毒蕈碱M2；阿片样物质μ和κ；血清素5HT1B、5HT2B和5HT4）相互作用的可能性。如Alt等人所述，进行了这些测定。12使用膜过滤法进行的竞争性放射性配体结合测定用于评估BBMS-986224在来源于细胞过表达单个人类GPCR的膜中竞争放射性配体结合的能力。

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放射性配体结合分析[1]
将一系列浓度的BBMS-986224添加到含有[3H]apelin-13的细胞膜提取物中（约2倍的平衡解离常数[Kd]）。使用过量未标记的（Pyr1）apelin-13（80 nM）来确定0至120分钟的特异性结合。使用竞争性结合动力学的非线性回归对值进行全局拟合，该回归应用了结合实验中确定的[3H]apelin-13的Kon和Koff约束。使用竞争性放射性配体结合分析来评估BBMS-986224与过表达单个人GPCR的细胞膜中相应放射性配体的结合。

ERK磷酸化[1]
表达人APJ的HEK293 ZF细胞在50μL完全生长培养基中以30000个细胞/孔的速度在384孔聚-D-赖氨酸涂层板上生长和铺板3天。将完整的生长培养基替换为80μL/孔的无血清培养基，以进一步培养过夜。试验化合物[BBMS-986224]在DMSO中连续稀释，并以10-50nL/孔的浓度分配到384孔REMP板中。对于该测定，化合物用50μL HBSS/HEPES/0.1%BSA测定缓冲液进一步稀释。从细胞板中取出培养基，直接向细胞中加入25μL稀释的化合物。在37°C下孵育7分钟后，立即用检测试剂盒中提供的裂解缓冲液裂解细胞并搅拌15分钟。然后将细胞裂解液（4μL/孔）转移到384孔ProxiPlates中，并加入7μL/孔免疫球蛋白G（IgG）检测试剂。在黑暗中孵育2小时后，在EnVision平板阅读器上测量信号。按照cAMP测定所述测定化合物效力。

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基于BRET的生物传感器检测1]
用Tyrode缓冲液（137 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.9 mM KCl、1 mM MgCl2、3.6 mM NaH2PO4、5.5 mM葡萄糖、12 mM NaHCO3和25 mM HEPES，pH 7.4）洗涤细胞，并向每个孔中加入90μL Tyrode的缓冲液。细胞在室温下在新缓冲液中平衡≥30分钟；然后将10×腔肠素底物（10μL）添加到每个孔中（最终浓度为2μM的紫色腔肠素）。然后将不同浓度的测试化合物（BBMS-986224和（Pyr1）apelin-13）添加到每个孔（HP D300数字分配器；Tecan）中，并在室温下孵育细胞5-15分钟。然后使用BioTek的Synergy Neo多模式阅读器和BRET2BBMS-986224过滤器410/80和515/30收集BRET读数。通过计算GFP（515/30nm）发出的光与Rluc（410/80nm）发射的光的比率来确定BRET信号。使用非刺激对照将BRET信号值转换为激活百分比为0%，（Pyr1）apelin-13最大反应为100%。使用4参数逻辑斯谛方程，利用这些归一化值生成了Sigmoid浓度-响应曲线，以确定不同化合物的EC50。

Animal/Disease Models: Male SD (Sprague-Dawley) rats (renal hypertensive rat model)[1]
Doses: 0.192 mg/kg or 3 mg/kg
Route of Administration: SC infusion; daily; Initiated 3 days before surgery and continued for 7 days after surgery
Experimental Results: The achieved steady-state plasma concentrations during 10-day infusion were 102 and 2686 nmol/L at low dose and HD, respectively. At the low dose, BMS-986224 increased SV and CO without affecting other measured parameters, including the measured diastolic parameters, cardiac fibrosis, and heart weight in RHR.

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\n\n\n(Pyr1) Apelin-13, BBMS-986224, and Dobutamine: Acute Hemodynamic Analyses in Normal Rats[1]
\nFollowing a 10-min equilibration period, vehicle (n=14) or BBMS-986224 (1, 10, or 100 μg/kg/min; n=8, 6, and 7, respectively) was infused intravenously over 15 min (Supplemental Figure I B(i)). We also included dobutamine, a positive inotropic agent, as a comparator. A dose‑escalation and a 15-min IV infusion of 1 μg/kg/min dose of dobutamine was conducted (see Methods and Supplemental Figure IC).\nPlasma exposures were measured in separate groups of anesthetized and cannulated animals (Supplemental Figure I A(ii) and I B(ii)). Following equilibration (Pyr1) apelin-13 (6 μg/kg/min), BBMS-986224 (1, 10, and 100 μg/kg/min), or vehicle were infused over 15 min (BMS-986224 and vehicle) or 20 min ((Pyr1) apelin-13). Blood samples were collected 5, 10, 20, 22, and 30 min after infusion start for (Pyr1) apelin-13 and 5, 15, 20, and 30 min after infusion start for BMS‑986224 and vehicle. In the (Pyr1) apelin-13 experiments, blood was collected using an optimized blood collection protocol and concentrations subsequently determined using liquid chromatography-tandem mass spectrometry as described previously.[1]\n

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\n\nBBMS-986224: Cardiovascular Effects in the Chronic Renal Hypertensive Rat Model[1]
\nSubcutaneous Drug Administration[1]
\nFor the infusion study, animals were implanted subcutaneously with an osmotic minipump (ALZET® Osmotic Pump Model 2ML2; DURECT Corporation). For the SC infusion, the study arms were BMS-986224 (0.192 mg/kg/day or 3 mg/kg/day, n=15 per dose), vehicle (n=15), enalapril (40 mg/kg/day, n=15), and sham-operated controls (n=10). BBMS-986224, enalapril, or vehicle infusion was initiated 3 days before surgery and continued for 7 days after surgery (Supplemental Figure I D). Key measurements were systolic blood pressure (SBP) in conscious animals on Day 6 via tail cuff (CODA; Kent Scientific Products), and echocardiography (ECHO) of cardiac structure and function (stroke volume [SV], CO, heart rate [HR], LV mass, LV end-diastolic volume [LVEDV] and ejection fraction [EF], and isovolumic relaxation time [IVRT]) on Day 7. Plasma samples were collected at Day 7 for measuring BBMS-986224 and heart failure biomarkers. The experiment was repeated in a larger cohort (n=20 per group).\n

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\n\nOral Drug Administration[1]
\nBBMS-986224 doses in the twice-daily (BID) study were selected to target a plasma concentration of 200 nM at peak (0.1 mg/kg/day BID) or at trough (1 mg/kg/day BID). In the low-dose once-daily (QD) study, 0.06 mg/kg QD dose was targeted to achieve a peak concentration of 100 nM and 0.2 mg/kg dose to cover an area under the plasma drug concentration–time curve (AUC) 0–24 of 3.4 μM*h. Vehicle was given PO and SC in separate animal groups, and enalapril maleate (40 mg/kg/day) was administered SC. Test compound preparation is described in full in Supplemental Table II. Sham-operated controls were also included. Treatment was initiated 3 days before surgery and continued for 8 days after surgery (Supplemental Figures I E, I F). ECHO was performed at BMS-986224 trough on Day 7 and peak on Day 8. Plasma samples were collected at trough and peak on Day 6 and repeated at peak on Day 8.\n\n

[1]. In Vitro and In Vivo Evaluation of a Small-Molecule APJ (Apelin Receptor) Agonist, BMS-986224, as a Potential Treatment for Heart Failure. Circ Heart Fail. 2021;14(3):e007351.

背景：目前亟需能够安全增强心肌收缩力和输出量的新型心力衰竭疗法。既往的apelin肽研究表明，APJ（apelin受体）激动剂具有增强心力衰竭患者心脏功能的潜力。然而，apelin的半衰期较短，限制了其治疗应用。本文描述了一种新型口服生物利用度高的APJ激动剂BMS-986224的临床前特性。
方法：采用放射性配体结合实验和APJ下游信号通路检测（cAMP、磷酸化ERK[细胞外信号调节激酶]、基于生物发光共振能量转移的G蛋白检测、β-arrestin募集和受体内化）比较了BMS-986224与(Pyr1)apelin-13的药理学特性。在麻醉植入导管的大鼠中研究了其对心脏功能的急性影响。本研究采用肾性高血压大鼠（RHR）模型，通过超声心动图评估了BMS-986224的慢性作用，该模型可导致心脏肥大和心输出量下降。
结果：BMS-986224是一种强效（Kd=0.3 nmol/L）且选择性的APJ激动剂，其受体结合和信号传导特性与(Pyr1) apelin-13相似。在人胚肾293细胞和人心肌细胞中进行的G蛋白信号传导分析证实了这一点，并表明其信号传导与(Pyr1) apelin-13无明显差异。在麻醉的植入式大鼠中，短期输注BMS-986224可使心输出量增加（10%-15%），而不影响心率，其作用与(Pyr1) apelin-13相似，但与多巴酚丁胺不同。在 RHR 模型中，皮下和口服 BMS-986224 均可使每搏输出量和心输出量增加至健康动物的水平，但并未阻止心脏肥大和纤维化，其作用与依那普利不同。
结论：我们发现了一种新型、高效且口服生物利用度高的非肽类 APJ 激动剂，其信号传导特性与 (Pyr1) apelin-13 非常相似。我们发现，口服 APJ 激动剂可在心脏疾病模型中持续增加心输出量，并且其作用机制与肾素-血管紧张素系统抑制剂依那普利不同，这支持对 BMS-986224 在心力衰竭中的应用进行进一步的临床评估。[1]

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我们的研究存在一些局限性。尽管BMS-986224的设计旨在使其信号传导特性和受体相互作用特征与(Pyr1) apelin-13高度相似，但这些化合物之间可能存在未知的差异，从而限制了BMS-986224的临床前研究结果向人类apelin肽类药物研究结果的外推。此外，值得注意的是，我们的研究仅使用了雄性大鼠。虽然在RHR模型中观察到的CO持续改善效果令人鼓舞，但导致这些变化的机制尚不明确，需要开展更多研究来评估其与人类疾病的相关性。
总之，我们发现了一种新型、高效、选择性强且口服生物利用度高的小分子APJ受体激动剂，它重现了内源性(Pyr1) apelin-13的APJ受体信号传导特性和体内心血管效应。我们证明，在疾病模型中，长期口服给药可以维持心脏功能的增强，这支持在临床环境中对BMS-986224进行进一步评估。在临床前模型中观察到的 BMS-986224 的有利作用能否转化为人类心力衰竭，还有待确定。[1]

C24H23CLN4O6

498.915624856949

498.13

2055200-88-7

137106310

Off-white to yellow solid powder

1.8

129

2

9

9

35

812

0

C1(=O)NC(COCC)=C(C2=C(OC)C=CC=C2OC)C(O)=C1C1=NN=C(CC2=NC=C(Cl)C=C2)O1

AGZKELPIAJYRDT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H23ClN4O6/c1-4-34-12-15-19(20-16(32-2)6-5-7-17(20)33-3)22(30)21(23(31)27-15)24-29-28-18(35-24)10-14-9-8-13(25)11-26-14/h5-9,11H,4,10,12H2,1-3H3,(H2,27,30,31)

3-[5-[(5-chloropyridin-2-yl)methyl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6-(ethoxymethyl)-4-hydroxy-1H-pyridin-2-one

BMS-986224; 2055200-88-7; N5O33BF03F; UNII-N5O33BF03F; CHEMBL4873876; BMS986224; 2(1H)-Pyridinone,3-(5-((5-chloro-2-pyridinyl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)- 5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6-(ethoxymethyl)-4-hydroxy-; 3-(5-((5-Chloropyridin-2-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6- (ethoxymethyl)pyridine-2,4-diol;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 20.83 mg/mL (41.75 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。