BMS-986224

Kd: 0.3 nM (APJ receptor)[1]
APJ receptor (apelin receptor).

BMS-986224 对人 APJ 的 EC50 为 0.02 nM，并能完全阻断福斯克林介导的 cAMP 合成。中国仓鼠卵巢 K1 细胞或 HEK293 ZF 细胞对 BMS-986224（0-100 nM）有完全反应，表现为 β-arrestin 募集、ERK 磷酸化和 APJ 内吞作用[1]。强效且选择性的 APJ 受体激动剂 BMS-986224 的信号传导特征与 (Pyr1) apelin-13 相似[1]。

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BMS-986224 与人 APJ 受体具有高亲和力（Kd = 0.3 nM），并以 0.02 nM 的 EC50 激活该受体。这种激活作用完全阻断了表达 APJ 受体的细胞中福斯克林介导的 cAMP 合成，这是其心脏保护作用的关键机制。

在 RHR 模型中，BMS-986224（0.192 mg/kg 或 3 mg/kg；皮下输注；每日）产生的效果与依那普利不同，它能将每搏输出量和心输出量增加到健康动物所观察到的水平，但不能阻止心脏肥大和纤维化[1]。

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GPCR选择性测定[1]
进行GPCR选择性测定是为了评估BBMS-986224与其他GPCR（腺苷A2A；肾上腺素能α1B、1D、2A和2C，以及肾上腺素能β1和β2；大麻素CB1；多巴胺D1和D2；组胺H1和H2；毒蕈碱M2；阿片类μ和κ；5-羟色胺5HT1B、5HT2B和5HT4）相互作用的潜力。测定方法如Alt等人¹²所述。采用膜过滤法进行竞争性放射性配体结合测定，以评估BBMS-986224与过表达特定人GPCR的细胞膜上放射性配体竞争结合的能力。

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放射性配体结合实验[1]
将一系列BBMS-986224浓度添加到含有[3H]apelin-13（平衡解离常数[Kd]约为2倍）的细胞膜提取物中。使用过量的未标记(Pyr1)apelin-13 (80 nM)测定0至120分钟内的特异性结合。采用非线性回归对竞争性结合动力学进行全局拟合，并应用在结合实验中确定的[3H]apelin-13的Kon和Koff约束。使用竞争性放射性配体结合实验评估BBMS-986224与相应放射性配体在过表达特定人类GPCR的细胞膜中的结合情况。

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APJ受体结合亲和力采用放射性配体结合试验测定。将表达人APJ受体的细胞膜与放射性标记的配体（例如，3H-apelin-13）和不同浓度的BMS-986224孵育。过滤后，测定结合的放射性，以计算Kd和Ki值。

ERK磷酸化[1]
表达人APJ的HEK293 ZF细胞在384孔聚赖氨酸包被板中培养，每孔30,000个细胞，加入50 μL完全培养基，培养3天。之后，将完全培养基更换为80 μL/孔的无血清培养基，继续过夜培养。将测试化合物[BBMS-986224]用DMSO进行系列稀释，并以10–50 nL/孔的量加入384孔REMP板中。进行检测时，将化合物进一步用50 μL HBSS/HEPES/0.1% BSA检测缓冲液稀释。移除细胞培养板中的培养基，直接向细胞中加入25 μL稀释后的化合物。细胞在37°C孵育7分钟后，立即用试剂盒提供的裂解缓冲液裂解细胞，并振荡15分钟。然后将细胞裂解液（4 μL/孔）转移至384孔ProxiPlates板，并加入7 μL/孔的免疫球蛋白G（IgG）检测试剂。避光孵育2小时后，使用EnVision酶标仪测量信号。化合物效力测定方法与cAMP测定方法相同。

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基于BRET的生物传感器检测1]
用Tyrode氏缓冲液（137 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.9 mM KCl、1 mM MgCl2、3.6 mM NaH2PO4、5.5 mM葡萄糖、12 mM NaHCO3和25 mM HEPES，pH 7.4）洗涤细胞，并在每个孔中加入90 μL Tyrode氏缓冲液。将细胞在室温下于新缓冲液中平衡≥30分钟；然后向每个孔中加入10 μL 10×腔肠素底物（最终浓度为2 μM的prolume purple腔肠素）。将不同浓度的测试化合物（BMS-986224 和 (Pyr1) apelin-13）加入到每个孔中（使用 HP D300 数字分液器；Tecan），并在室温下孵育 5-15 分钟。然后使用 BioTek 公司的 Synergy Neo 多功能读板机，配备 BRET2BBMS-986224 滤光片 410/80 和 515/30，采集 BRET 读数。BRET 信号通过计算 GFP (515/30 nm) 发射光与 Rluc (410/80 nm) 发射光的比值来确定。以未刺激的对照组为 0%，(Pyr1) apelin-13 的最大反应为 100%，将 BRET 信号值转换为激活百分比。使用 4 参数逻辑方程，以这些归一化值生成 S 形浓度-反应曲线，以确定不同化合物的 EC50。

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在 cAMP 检测中，使用稳定表达人 APJ 受体的 CHO-K1 或 HEK293 细胞。在福斯克林（一种 cAMP 生成刺激剂）存在的情况下，用浓度递增的 BMS-986224（0.001-1000 nM）处理细胞。采用基于发光的 HTRF 检测法测定 cAMP 浓度；信号降低表明 APJ 受体被激活。

动物/疾病模型：雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠（肾性高血压大鼠模型）[1]
剂量：0.192 mg/kg 或 3 mg/kg
给药途径：皮下输注；每日一次；术前3天开始，术后持续7天
实验结果：10天输注期间，低剂量组和高剂量组的稳态血浆浓度分别为102 nmol/L和2686 nmol/L。低剂量下，BMS-986224 可增加每搏输出量 (SV) 和心输出量 (CO)，而不影响其他测量参数，包括测量的舒张期参数、心肌纤维化和静息心率 (RHR) 下的心脏重量。

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(Pyr1) Apelin-13、BBMS-986224 和多巴酚丁胺：正常大鼠的急性血流动力学分析[1]
经过 10 分钟的平衡期后，静脉输注载体 (n=14) 或 BBMS-986224（剂量分别为 1、10 或 100 μg/kg/min；n 分别为 8、6 和 7），输注时间为 15 分钟（补充图 IB(i)）。我们还纳入了多巴酚丁胺（一种正性肌力药物）作为对照。进行剂量递增试验，并以 1 μg/kg/min 的剂量静脉输注多巴酚丁胺 15 分钟（参见方法和补充图 IC）。在单独的麻醉和插管动物组中测量血浆暴露量（补充图 IA(ii) 和 IB(ii)）。平衡后，分别在 15 分钟（BMS-986224 和载体）或 20 分钟（Pyr1）内输注 apelin-13（6 μg/kg/min）、apelin-13（1、10 和 100 μg/kg/min）或载体。在输注开始后 5、10、20、22 和 30 分钟采集 (Pyr1) apelin-13 的血样，在输注开始后 5、15、20 和 30 分钟采集 BMS-986224 和载体的血样。在 (Pyr1) apelin-13 实验中，采用优化的采血方案采集血液，随后使用液相色谱-串联质谱法测定浓度，如前所述。[1]

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BBMS-986224：慢性肾性高血压大鼠模型中的心血管效应[1]
皮下给药[1]
在输注研究中，将渗透泵（ALZET® 渗透泵 2ML2 型；DURECT 公司）皮下植入动物体内。皮下输注组的研究分组包括：BMS-986224（0.192 mg/kg/天或3 mg/kg/天，每剂量组n=15）、赋形剂（n=15）、依那普利（40 mg/kg/天，n=15）和假手术对照组（n=10）。BBMS-986224、依那普利或赋形剂输注于术前3天开始，并持续至术后7天（补充图ID）。关键测量指标包括：第 6 天通过尾套法（CODA；Kent Scientific Products）测量清醒动物的收缩压 (SBP)；第 7 天进行心脏超声 (ECHO) 检查，评估心脏结构和功能（包括每搏输出量 [SV]、心输出量 [CO]、心率 [HR]、左心室质量、左心室舒张末期容积 [LVEDV]、射血分数 [EF] 和等容舒张时间 [IVRT]）。在第 7 天采集血浆样本，用于检测 BBMS-986224 和心力衰竭生物标志物。该实验在更大规模的队列（每组 n=20）中重复进行。

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口服给药[1]
每日两次 (BID) 研究中，BBMS-986224 的剂量选择目标为：峰值浓度为 200 nM（0.1 mg/kg/天，BID），谷值浓度为 200 nM（1 mg/kg/天，BID）。在低剂量每日一次 (QD) 研究中，目标剂量为 0.06 mg/kg QD，以达到 100 nM 的峰浓度；目标剂量为 0.2 mg/kg，以覆盖血浆药物浓度-时间曲线下面积 (AUC) 0-24 为 3.4 μM·h。在不同的动物组中，分别给予口服 (PO) 和皮下注射 (SC) 赋形剂，并皮下注射马来酸依那普利 (40 mg/kg/天)。测试化合物的制备方法详见补充表 II。本研究还纳入了假手术对照组。治疗于术前 3 天开始，并持续至术后 8 天（补充图 IE、IF）。分别于第 7 天 BMS-986224 谷浓度和第 8 天峰浓度时进行超声心动图 (ECHO) 检查。分别于第 6 天谷浓度和峰浓度时采集血浆样本，并于第 8 天峰浓度时重复采集。

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为了评估BMS-986224在心力衰竭中的疗效，对雄性Sprague-Dawley大鼠进行冠状动脉结扎术以诱导心肌梗死（MI）。MI后4周，大鼠每日口服一次BMS-986224，持续4周。随后进行超声心动图检查以测量左心室射血分数（LVEF）。

BMS-986224 具有良好的口服生物利用度，这是其优于肽类 APJ 激动剂的显著优势。其药代动力学特性已在大鼠、犬和猴中进行评估，结果显示药物暴露量良好，半衰期支持每日一次口服给药。

在临床前毒性研究中，BMS-986224 在治疗剂量下耐受性良好。与所有心血管药物一样，研究人员对血流动力学参数和器官功能进行了仔细评估，早期动物模型中未报告任何显著的安全信号。

[1]. In Vitro and In Vivo Evaluation of a Small-Molecule APJ (Apelin Receptor) Agonist, BMS-986224, as a Potential Treatment for Heart Failure. Circ Heart Fail. 2021;14(3):e007351.

背景：目前迫切需要能够安全增强心肌收缩力和心输出量的新型心力衰竭疗法。既往研究表明，apelin肽类化合物APJ（apelin受体）激动剂具有改善心力衰竭患者心脏功能的潜力。然而，apelin的半衰期较短，限制了其临床应用。本文描述了一种新型口服生物利用度高的APJ激动剂BMS-986224的临床前特性。方法：采用放射性配体结合试验和APJ下游信号通路检测（cAMP、磷酸化ERK[细胞外信号调节激酶]、基于生物发光共振能量转移的G蛋白检测、β-arrestin募集和受体内化）比较了BMS-986224与(Pyr1)apelin-13的药理学特性。在植入导管的麻醉大鼠中研究了BMS-986224对心脏功能的急性影响。本研究采用肾性高血压（RHR）大鼠模型，通过超声心动图评估了BMS-986224的慢性作用。RHR可导致心脏肥大和心输出量下降。结果表明：BMS-986224是一种强效（Kd = 0.3 nmol/L）且选择性的APJ激动剂，其受体结合和信号转导特性与(Pyr1) apelin-13相似。在人胚肾293细胞和人心肌细胞中进行的G蛋白信号转导分析证实了这一点，结果显示其信号转导与(Pyr1) apelin-13无显著差异。在麻醉植入大鼠中，短期输注BMS-986224可增加心输出量（10%-15%），且不影响心率，其作用与(Pyr1) apelin-13相似，但与多巴酚丁胺不同。在RHR模型中，皮下注射和口服BMS-986224均可使每搏输出量和心输出量增加至健康动物的水平，但与依那普利不同，它并不能阻止心脏肥大和纤维化。结论：我们发现了一种新型、高效且口服生物利用度高的非肽类APJ激动剂，其信号转导特性与(Pyr1)apelin-13非常相似。我们发现，口服APJ激动剂可在心脏疾病模型中持续增加心输出量，并且其作用机制与肾素-血管紧张素系统抑制剂依那普利不同，这支持对BMS-986224在心力衰竭中的应用进行进一步的临床评估。[1] 本研究存在一些局限性。尽管BMS-986224的设计使其信号转导特性和受体相互作用特征与(Pyr1) apelin-13高度相似，但这些化合物之间可能存在未知的差异，这限制了将BMS-986224的临床前结果外推至人类apelin肽研究。此外，值得注意的是，我们的研究仅使用了雄性大鼠。虽然在RHR模型中观察到的CO持续改善令人鼓舞，但这些变化的潜在机制仍不清楚，需要进一步研究以评估其与人类疾病的相关性。总之，我们发现了一种新型、高效、选择性强且口服生物利用度高的小分子APJ受体激动剂，它能够复制内源性(Pyr1) apelin-13的APJ受体信号传导特性和体内心血管效应。我们证明，长期口服给药可在疾病模型中维持增强的心脏功能，这支持在临床环境中对BMS-986224进行进一步评估。 BMS-986224 在临床前模型中观察到的有益效果是否能转化为对人类心力衰竭的疗效，还有待确定。[1]

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BMS-986224 是一种已进入临床开发阶段的候选药物，用于治疗心力衰竭。它代表了一类新型的口服非肽类 APJ 受体激动剂，通过模拟 apelin 通路的有益作用，为治疗心血管疾病提供了一种潜在的新机制。

C24H23CLN4O6

498.915624856949

498.13

2055200-88-7

137106310

Off-white to yellow solid powder

1.8

129

2

9

9

35

812

0

C1(=O)NC(COCC)=C(C2=C(OC)C=CC=C2OC)C(O)=C1C1=NN=C(CC2=NC=C(Cl)C=C2)O1

AGZKELPIAJYRDT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H23ClN4O6/c1-4-34-12-15-19(20-16(32-2)6-5-7-17(20)33-3)22(30)21(23(31)27-15)24-29-28-18(35-24)10-14-9-8-13(25)11-26-14/h5-9,11H,4,10,12H2,1-3H3,(H2,27,30,31)

3-[5-[(5-chloropyridin-2-yl)methyl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6-(ethoxymethyl)-4-hydroxy-1H-pyridin-2-one

BMS-986224; 2055200-88-7; N5O33BF03F; UNII-N5O33BF03F; CHEMBL4873876; BMS986224; 2(1H)-Pyridinone,3-(5-((5-chloro-2-pyridinyl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)- 5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6-(ethoxymethyl)-4-hydroxy-; 3-(5-((5-Chloropyridin-2-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-5-(2,6-dimethoxyphenyl)-6- (ethoxymethyl)pyridine-2,4-diol;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 20.83 mg/mL (41.75 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。