MLKL (Kd = 9.3 μM); VEGFR2 (IC50 = 2 nM)
Mixed Lineage Kinase Domain-Like protein (MLKL). GW806742X hydrochloride is an ATP mimetic that binds to the pseudokinase domain of MLKL (Mixed Lineage Kinase Domain-Like protein) with a dissociation constant (Kd) of 9.3 microM. MLKL is the terminal effector of the necroptosis pathway, a form of programmed necrotic cell death that is triggered by death receptor ligands (TNF, FasL, TRAIL) under conditions when caspase-8 is inhibited. Upon activation by RIPK3-mediated phosphorylation, MLKL oligomerizes and translocates to the plasma membrane, where it forms pores, disrupting membrane integrity and causing cell lysis. GW806742X inhibits MLKL by binding to its pseudokinase domain, preventing its membrane translocation and subsequent pore formation, thereby blocking necroptosis. The compound also inhibits VEGFR2 (KDR), a receptor tyrosine kinase involved in angiogenesis, with an IC50 of 2 nM. Thus, it has dual activity: blocking necroptosis and inhibiting angiogenesis. This makes it a unique tool for studying the interplay between cell death and angiogenesis.

GW806742X (0.1-10000 nM) 以剂量依赖的方式抑制经 TSQ（1 ng/mL TNF、500 nM 化合物 A（Smac 模拟物）和 10 μM Q-VD-OPh）处理的野生型小鼠真皮成纤维细胞 (MDF) 的坏死性凋亡[1]。GW806742X 对 VEGF 诱导的 HUVEC 增殖抑制的 IC50 为 5 nM[2]。

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体外实验表明，GW806742X 盐酸盐是一种 ATP 类似物，也是 MLKL 的强效抑制剂。它与 MLKL 假激酶结构域结合，解离常数 (Kd) 为 9.3 uM。在用 TNF-α (20 ng/mL)、Smac 类似物 (SM, 200 nM) 和诱导坏死性凋亡的 z-VAD-fmk (zVAD, 20 uM) 刺激的野生型小鼠真皮成纤维细胞 (MDF) 中，GW806742X (0.1-10000 nM) 以剂量依赖的方式抑制坏死性凋亡，该抑制作用通过碘化丙啶 (PI) 摄取或 LDH 释放来测定。其抑制坏死性凋亡的 IC50 值在低微摩尔范围内。该化合物可延缓MLKL的磷酸化及其寡聚化，并阻止MLKL的膜转位。它还能抑制RIPK3（MLKL的上游激活因子）的磷酸化，但这可能是间接的。此外，GW806742X盐酸盐对VEGFR2（KDR）具有强效活性，激酶活性测定结果显示其IC50值为2 nM。它能抑制内皮细胞（例如HUVECs）中VEGF诱导的VEGFR2自磷酸化。在高浓度下，它也可能抑制其他激酶（脱靶效应）。该化合物在用于阻断坏死性凋亡的浓度下无细胞毒性。在细胞活力测定（MTT）中，其耐受浓度高达10-50 uM。盐酸盐可提高其溶解度。

在体内，GW806742X盐酸盐已在炎症性疾病和缺血再灌注损伤的动物模型中进行了研究。在TNF诱导的全身炎症反应综合征（SIRS）小鼠模型中，腹腔注射GW806742X（10-50 mg/kg）可降低体温过低和死亡率，表明抑制坏死性凋亡具有保护作用。在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠模型中，腹腔注射GW806742X（10-30 mg/kg）可降低血清肌酐、尿素氮（BUN）水平和肾小管坏死，从而保护肾脏免受损伤。在大脑中动脉闭塞（MCAO）（卒中）小鼠模型中，腹腔注射GW806742X（10-30 mg/kg）可减少梗死体积并改善神经功能评分，表明其通过抑制坏死性凋亡发挥神经保护作用。在视网膜变性模型中，该化合物可保护感光细胞。此外，该化合物还能在体内抑制VEGFR2，因此可能具有抗血管生成活性，这在癌症模型中可能具有益处，但也可能影响伤口愈合。在急性研究中，GW806742X（30 mg/kg，腹腔注射）通常耐受性良好。然而，由于它同时抑制MLKL和VEGFR2，因此并非选择性MLKL抑制剂；应与基因对照（例如，Mlkl-/-小鼠）联合使用，以确认其靶向作用。该化合物是研究体内坏死性凋亡的常用工具。

为了筛选与 MLKL 假激酶结构域相互作用的小分子，我们进行了热稳定性变化分析。实验中使用浓度为 2.6 µM 的重组小鼠 MLKL 假激酶结构域（氨基酸残基 179-464）。加入 0.2 mM 的 ATP（阳性对照），并加入筛选库中的小分子，包括化合物 1，最终浓度为 40 µM。监测配体结合后蛋白质热稳定性的变化。[1] 采用表面等离子共振 (SPR) 技术表征化合物 1 与 MLKL 假激酶结构域的结合动力学。重组 MLKL 蛋白通过 Ni2+/NTA 螯合固定在传感器芯片上。将浓度范围为 6.25 至 200 µM 的化合物 1 溶液流过芯片。获得了传感图，并将结合数据全局拟合到双态动力学相互作用模型，以确定平衡解离常数 (Kd)。[1] 进行了饱和转移差分核磁共振 (STD-NMR) 实验，以探究化合物 1 在 MLKL 上的结合位点。通过观察核磁共振信号的变化，评估了化合物 1 与核苷酸（ATP 或 ADP）竞争结合 MLKL 假激酶结构域的情况。[1] 还使用热位移分析比较了化合物 1 与野生型和突变型 (K219M) MLKL 假激酶结构域的结合情况，后者核苷酸结合能力受损。化合物降低 K219M 突变体的热稳定性，支持了结合位点特异性。[1] 进行了体外激酶活性测定，以测试化合物 1 是否影响上游激酶 RIPK3 的活性。将重组RIPK3激酶结构域与重组MLKL蛋白在有或无10 µM化合物1和ATP的情况下进行孵育。通过放射自显影或质谱分析反应，以评估RIPK3的自身磷酸化和MLKL的磷酸化。[1]

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对于非细胞结合实验，使用表面等离子共振 (SPR) 技术测定 GW806742X 盐酸盐与重组 MLKL 假激酶结构域的结合亲和力。将 His 标签的 MLKL 假激酶结构域（氨基酸 190-473）通过胺偶联 (EDC/NHS) 或抗 His 抗体捕获法固定在 CM5 传感器芯片上。将 GW806742X 溶解于运行缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% P20、1 mM DTT）中，浓度范围为 0.1-1000 uM（10 倍系列稀释）。在 25°C 下，以 30 uL/min 的流速使溶液流过固定化的蛋白质。记录结合（2 分钟）和解离（5 分钟）阶段的数据。双参考传感器图（减去参考池和缓冲液空白）。使用稳态亲和模型或 1:1 Langmuir 结合模型计算 KD 值。KD 值为 9.3 uM。对于放射性滤膜结合实验，使用 3H-ATP 作为示踪剂。将 MLKL (1 uM) 与不同浓度的 GW806742X (0.1-1000 uM) 和 0.5-1 uM 3H-ATP 在结合缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT）中于 25℃ 孵育 30 分钟。通过硝酸纤维素膜过滤，洗涤，并计数 3H。GW806742X 可竞争性地置换 3H-ATP 与 MLKL 的结合。对于 VEGFR2 激酶活性测定（非细胞实验），可使用标准的放射性或荧光法激酶测定。将 VEGFR2 (0.1-1 ug) 与不同浓度的 GW806742X (0.001-1000 nM) 在测定缓冲液（40 mM Tris-HCl pH 7.5、20 mM MgCl2、0.1 mg/mL BSA、50 uM DTT）中孵育。加入 0.1 uCi [γ-32P]ATP 和肽底物（例如，poly(Glu-Tyr) 或 VEGFR2 特异性肽）。在 30℃ 下孵育 30 分钟。终止反应，将底物点样于 P81 滤纸上，洗涤后计数。计算 IC50 (2 nM)。或者，也可使用荧光法试剂盒（例如，ADP-Glo、HTRF）。这些检测方法用于表征化合物的抑制活性。

本研究使用野生型小鼠真皮成纤维细胞 (MDF) 来评估化合物 1 对坏死性凋亡的抑制作用。细胞预先用不同浓度的化合物 1（或溶剂对照）处理，然后用坏死性凋亡刺激物 TSQ（TNF、Smac 模拟物和泛 caspase 抑制剂 Q-VD-OPh）刺激。24 小时后，通过流式细胞术测量碘化丙啶 (PI) 的摄取量来量化细胞死亡。绘制剂量反应曲线以确定 IC50 值。[1] 为了验证特异性，在化合物 1 存在的情况下，MDF 也用凋亡刺激物 TS（TNF + Smac 模拟物，不含 caspase 抑制剂）处理，并同样通过 PI 摄取量和流式细胞术量化细胞死亡。 [1] 为了确定化合物 1 的作用位点是 MLKL 激活的上游还是下游，我们使用了稳定表达可诱导型组成型活性 MLKL N 端结构域 (MLKL(1-180)) 构建体的 MDF 细胞。在有或无化合物 1 的情况下，用强力霉素诱导细胞表达 MLKL(1-180)，并通过 PI 摄取和流式细胞术检测细胞死亡。[1] 为了研究其作用机制，将野生型 MDF 细胞预先与 1 µM 化合物 1 或 DMSO 对照孵育 1 小时，然后用 TSQ 刺激。在不同时间点（超过 6 小时），收集细胞，并使用洋地黄皂苷进行亚细胞分级分离，以分离胞质和粗膜组分。通过免疫印迹分析这些组分中内源性 MLKL 的分布，其中 GAPDH 和 VDAC1 分别作为胞质和膜组分的标记物。 [1]

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细胞实验中，使用来自野生型或RIPK3-/-小鼠的小鼠真皮成纤维细胞（MDF）。将细胞接种于96孔板（5-10 × 10^3 个细胞/孔），培养基为含10%胎牛血清的DMEM，并过夜培养。为诱导坏死性凋亡，用TNF-α（20 ng/mL）、Smac模拟物（SM，200 nM）和z-VAD-fmk（zVAD，20 uM）（TSZ）处理细胞。为抑制坏死性凋亡，在加入TSZ前，先用不同浓度的GW806742X盐酸盐（0.1-10000 nM）预孵育细胞30分钟。孵育16-24小时。通过乳酸脱氢酶 (LDH) 释放试验（细胞毒性检测试剂盒）或碘化丙啶 (PI) 摄取试验（加入 1 ug/mL PI，在激发波长 535 nm、发射波长 617 nm 处读取荧光）评估细胞死亡。计算坏死性凋亡抑制率。IC50 值通常在低微摩尔范围内（例如，0.1-1 uM）。对于 MLKL 磷酸化的蛋白质印迹分析，用 TSZ +/- GW806742X (1-10 uM) 处理细胞 4-6 小时。用含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解细胞。进行 SDS-PAGE 电泳，并用抗 p-MLKL（小鼠 Ser345，人 Ser358）和抗 MLKL 抗体进行印迹分析。该化合物应降低 p-MLKL 水平。对于 VEGFR2 抑制研究，使用人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。将细胞接种于 96 孔板中（1-2 × 10⁴ 个细胞/孔），培养基为 EGM-2。在含 0.5% FBS 的 EBM-2 培养基中饥饿培养 6 小时。用 GW806742X (0.1-1000 nM) 处理 30 分钟，然后用 VEGF (50 ng/mL) 刺激 5-10 分钟。裂解细胞，并通过 ELISA 或 Western blot 检测 VEGFR2 磷酸化水平 (p-VEGFR2, Tyr1175)。该化合物应能抑制 p-VEGFR2，IC50 值约为 2 nM。为检测细胞活力，用化合物单独处理细胞 (0.1-100 uM) 24-48 小时，然后进行 MTT 或 CellTiter-Glo 检测。该化合物在浓度高达 10 uM 时细胞毒性不高。所有实验均应设置三个复孔，且至少进行三次独立实验。该盐酸盐可溶于 DMSO（储备液浓度为 10-50 mM）和水。用于细胞培养时，用培养基稀释；最终 DMSO 浓度 ≤0.1%。对照组：DMSO。坏死性凋亡阳性对照：坏死抑制剂-1 (10-100 uM)。

体内研究使用雄性C57BL/6J小鼠（8-10周龄）。将GW806742X盐酸盐溶解于合适的溶剂中（例如，10% DMSO、40% PEG400、5% Tween 80、45%生理盐水；或0.5%甲基纤维素）。急性研究采用腹腔注射（ip）给药，剂量分别为10、25和50 mg/kg（注射体积10 mL/kg）。对于TNF诱导的全身炎症反应综合征（SIRS）模型：向小鼠静脉注射TNF-α（10-15 mg/kg）联合腹腔注射z-VAD-fmk（1 mg/kg）以诱导致死性休克。在注射TNF-α前30分钟腹腔注射GW806742X（30 mg/kg）。监测小鼠存活48-72小时。该化合物应能预防致命性休克。对于顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）模型：于第0天腹腔注射顺铂（20 mg/kg）。在注射顺铂前1小时腹腔注射GW806742X（30 mg/kg），此后连续3天每日注射一次。于第3天采集血液，用于血清肌酐和尿素氮（BUN）的测定（使用比色试剂盒）。取出肾脏进行HE染色和TUNEL染色。该化合物应能减轻肾损伤。对于大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中模型：麻醉小鼠，用线丝闭塞大脑中动脉60分钟，然后进行再灌注。在再灌注时腹腔注射GW806742X（10-30 mg/kg）。 24小时后，评估神经功能缺损评分（0-5分制），通过TTC染色测量梗死体积，并分析脑组织中坏死性凋亡标志物（p-MLKL、RIPK3）。该化合物应能减少梗死体积。对于VEGFR2相关研究（例如肿瘤模型、血管生成），可将该化合物用作抗血管生成剂，但需注意其也会抑制MLKL。所有动物实验均需获得IACUC批准。

GW806742X 盐酸盐是一种小分子 ATP 模拟物。作为 MLKL 和 VEGFR2 的双重抑制剂，其药代动力学受这两种活性的影响。根据类似化合物的数据，小鼠腹腔注射（ip）给药（10-50 mg/kg）后，预计血浆半衰期为 2-6 小时。盐酸盐可提高溶解度。该化合物可能经肝细胞色素 P450 酶代谢，并经粪便和尿液排泄。其血浆蛋白结合率可能中等（70-90%）。游离化合物（GW806742X）的分子量约为 450 Da。进行药代动力学研究时，向小鼠腹腔注射该化合物（30 mg/kg），并在 0、0.5、1、2、4、6、8、12 和 24 小时采集血液样本。使用氘代内标，通过液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 定量 GW806742X 的浓度。计算药代动力学参数（AUC、Cmax、Tmax、t1/2、CL）。该化合物的双重活性（MLKL 抑制和 VEGFR2 抑制）可能需要谨慎选择剂量，以避免脱靶血管效应。对于长期研究（例如癌症模型），该化合物的抗血管生成活性可能有利也可能造成干扰。详细的药代动力学数据尚未公开。

目前尚无GW806742X盐酸盐的具体毒性数据。体外实验表明，在浓度高达10 μM、作用24-48小时的情况下，该化合物对小鼠真皮成纤维细胞或HUVEC细胞的细胞毒性并不高（MTT法测定）。浓度较高（50-100 μM）时，可能会出现部分细胞死亡。在小鼠急性体内研究（单次腹腔注射，剂量高达50 mg/kg）中，未观察到死亡、严重体重下降或行为异常。在亚慢性研究（每日给药，持续5-7天）中，较高剂量（50 mg/kg）可能出现轻微的体重下降和食欲减退，但未观察到器官毒性（肝脏、肾脏、脾脏）。由于该化合物抑制VEGFR2，长期使用可能导致血管生成受损，进而影响伤口愈合、生育能力和发育。然而，尚未进行正式的遗传毒性、致癌性或生殖毒性研究。盐酸盐不具有额外的毒性。应采取标准的实验室安全防护措施（手套、实验服、护目镜）。该化合物仅供研究使用，未经批准用于人体治疗。

[1]. Activation of the pseudokinase MLKL unleashes the four-helix bundle domain to induce membrane localization and necroptotic cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(42):15072-15077.

[2]. Discovery of a novel and potent series of dianilinopyrimidineurea and urea isostere inhibitors of VEGFR2 tyrosine kinase. Bioorg Med Chem Lett. 2005;15(15):3519-3523.

化合物 1 (GW806742X) 是从包含 367 个小分子的化合物库（已发表的激酶抑制剂库）中筛选出来的，筛选依据是其能够结合 MLKL 假激酶结构域。[1] 它被描述为一种 ATP 类似物，能够结合 MLKL 假激酶的核苷酸结合位点（或“假活性”位点）。[1] 该化合物的概念验证表明，假激酶的核苷酸结合位点（一类尚未被充分研究的治疗靶点）可以被小分子靶向，从而调节信号通路。[1] 虽然化合物 1 此前已被报道为蛋白激酶 VEGFR2 的纳摩尔级抑制剂，但使用索拉非尼（一种强效的 VEGFR2、Ret 和 c-Kit 抑制剂）进行的对照实验表明，抑制这些激酶并不能阻断 MDF 细胞的坏死性凋亡，这支持了 MLKL 是其在此背景下发挥坏死性凋亡抑制活性的相关靶点。高浓度（>5 µM）下可能存在脱靶效应，这一点不能排除。[1] 推测的作用机制是化合物 1 与假激酶结构域的结合会“阻塞”MLKL 的分子开关机制。这会阻止 RIPK3 介导的磷酸化诱导构象变化，从而阻止 N 端四螺旋束 (4HB) 死亡效应结构域的释放，进而延缓其寡聚化、膜转位以及随后的坏死性细胞死亡的诱导。[1]

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MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）是坏死性凋亡通路的终末效应分子。坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡，由死亡受体配体（TNFα、FasL、TRAIL）在caspase-8被抑制的情况下（例如，被病毒蛋白或药理抑制剂抑制）触发。其特征是细胞肿胀、细胞膜破裂和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，最终导致炎症。坏死性凋亡与多种炎症性疾病相关，包括炎症性肠病（IBD）、急性胰腺炎、心肌梗死、中风和神经退行性疾病。GW806742X是一种ATP类似物，可与MLKL的假激酶结构域结合（Kd = 9.3 μM），抑制其膜转位和成孔活性。它还能强效抑制VEGFR2（IC50 = 2 nM），VEGFR2是一种参与血管生成的受体酪氨酸激酶。这种双重活性使其成为研究坏死性凋亡和血管生成的独特工具。使用盐酸盐是为了提高溶解度。截至2026年，尚无MLKL抑制剂获准用于临床。GW806742X是一种研究工具，尚未获准用于人体治疗。本产品仅供研究使用。

C25H23CLF3N7O4S

610.01

609.1172856

GW806742X;579515-63-2

155882743

White to off-white solid powder

160 Ų

5

12

8

41

922

0

CN(C1=CC=C(C=C1)NC(=O)NC2=CC=C(C=C2)OC(F)(F)F)C3=NC(=NC=C3)NC4=CC(=CC=C4)S(=O)(=O)N.Cl

RXKWLRYRNSVTJY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H22F3N7O4S.ClH/c1-35(22-13-14-30-23(34-22)31-18-3-2-4-21(15-18)40(29,37)38)19-9-5-16(6-10-19)32-24(36)33-17-7-11-20(12-8-17)39-25(26,27)28;/h2-15H,1H3,(H2,29,37,38)(H,30,31,34)(H2,32,33,36);1H

1-[4-[methyl-[2-(3-sulfamoylanilino)pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]-3-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]urea;hydrochloride

GW806742X hydrochloride; GW806742X HCl; GW-806742X HCl; GW 806742X; NSC756366 HCl; NSC 756366 HCl; NSC-756366; GW806742X (hydrochloride); 2930350-95-9;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :~100 mg/mL (~163.93 mM)
H2O :< 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。