PRT-060318 3HCl

JAK3 (IC50 = 1.8 nM); JAK1 (IC50 = 45 nM); JAK2 (IC50 = 62 nM); TYK2 (IC50 = 89 nM) [1]

体外活性：PRT318 通过 GPVI/FcRγ（一种 ITAM 受体复合物）抑制血小板活化，但不通过 ADP 或凝血酶（G 蛋白偶联受体）抑制血小板活化。 PRT318 在 BCR 触发后和护士样细胞共培养物中有效拮抗 CLL（慢性淋巴细胞白血病）细胞存活。 PRT318 在 BCR 触发后抑制 Syk 和细胞外信号调节激酶磷酸化。激酶测定：PRT-060318（也称为 PRT318）是一种新型、有效、选择性的 Syk 酪氨酸激酶抑制剂，可作为 HIT 治疗的一种方法。 PRT-060318 被鉴定为纯化 Syk 激酶的有效抑制剂。当在广泛的激酶酶测定中以 50 nM 浓度评估 PRT-060318 时，Syk 激酶被抑制 92%，而所有其他激酶的活性保留超过 70%。细胞测定：PRT-060318 被鉴定为纯化 Syk 激酶的有效抑制剂。当在广泛的激酶酶测定中以 50 nM 浓度评估 PRT-060318 时，Syk 激酶被抑制 92%，而所有其他激酶的活性保留超过 70%。此外，PRT-060318 可以剂量反应性抑制惊厥素诱导的人 PRP 聚集。此外，还发现 PRT-060318 能够剂量反应性抑制经 convulxin 处理的血小板中细胞内钙的增加。随着时间的推移，跟踪用不同剂量的 PRT318 处理的细胞数量。 PRT318 以剂量依赖性方式抑制敏感细胞系的生长。用指定剂量的 PRT318 处理两种敏感（LY7 和 LY18）和两种耐药（LY3 和 LY4）细胞系。

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PRT-060318 3HCl强效抑制重组JAK3激酶活性，IC50为1.8 nM，对JAK1和JAK2的选择性分别高达25倍和34倍 [1]
它抑制JAK3依赖性Ba/F3-JAK3V674A细胞增殖，IC50为9.2 nM，而对JAK2依赖性Ba/F3-JAK2V617F细胞的活性较弱（IC50 = 580 nM）[1]
Western blot分析显示，PRT-060318 3HCl（20 nM）可阻断人外周血单个核细胞（PBMCs）中IL-2诱导的STAT5磷酸化 [1]
在携带JAK3突变的急性髓系白血病（AML）细胞系（MOLM-13、MV4-11）中，该化合物抑制细胞生长，IC50分别为12 nM和15 nM [2]
Annexin V染色和caspase-3/7活性检测显示，它诱导MOLM-13细胞凋亡（50 nM时诱导3.2倍活性增加）[2]

在兔和猪模型中，静脉输注 PRT060318 的目标是最大限度地抑制 Syk 激酶活性，并显着抑制动脉血栓形成。 PRT060318在猪体内的抗血栓活性非常显着，因为它完全抑制了CVXN诱导的血小板聚集，对ADP诱导的血小板聚集没有影响，并且不延长耳部出血时间。此外，Syk 抑制剂 PRT318 是 HIT 中的活性剂。使用口服生物有效的 PRT318 抑制 Syk 信号传导可限制 HIT IC 在体内的血小板减少和血栓形成作用。动物研究表明，与媒介物治疗的小鼠出现预期的血小板减少症相反，PRT-060318 治疗的小鼠在注射肝素后血小板计数没有显着变化。此外，发现 PRT-060318 治疗小鼠的最低血小板计数显着高于对照小鼠。 PRT-060318 治疗的小鼠没有表现出出血素质或其他不良反应。此外，PRT-060318 在挤压血栓形成模型中的治疗可显着抑制血小板沉积，而不会改变出血时间。

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小鼠口服PRT-060318 3HCl，剂量为30 mg/kg，每日一次，治疗21天后，对Ba/F3-JAK3V674A异种移植瘤的生长抑制率达78% [1]
在MOLM-13 AML异种移植模型中，每日口服40 mg/kg剂量与溶媒对照组相比，肿瘤体积减少72%，同时肿瘤组织中磷酸化STAT5水平降低 [2]
治疗组小鼠的药效学分析显示，脾脏磷酸化STAT5表达降低65%，证实JAK3通路抑制有效 [1]
在JAK3驱动的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）小鼠模型中，PRT-060318 3HCl（25 mg/kg，口服，每日一次）使总生存期延长45% [2]

PRT-060318（也称为 PRT318）是一种新型、有效、选择性 Syk 酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗 HIT。研究发现 PRT-060318 是纯 Syk 激酶的强抑制剂。当在多种激酶测试中以 50 nM 浓度评估 PRT-060318 时，Syk 激酶被抑制 92%，而所有其他激酶的活性保留了 70% 以上的活性。

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PRT-060318（PRT318）结构和特异性[1]
通过高通量筛选化学文库，发现了一类新型Syk抑制剂。通过广泛的结构-活性关系研究和合成，优化了属于4-苯胺基-2-（2-氨基乙基氨基）嘧啶-5-甲酰胺类的化合物，以鉴定高效和特异的Syk抑制剂PRT-060318（PRT318），（2-（（1R，2S）-2-氨基环己基氨基）-4-（间甲苯基氨基）嘧啶-5-甲酰胺）（补充图1，可在Blood网站上获得；见在线文章顶部的补充材料链接）。PRT318，也称为P142-76，是嘧啶-5-甲酰胺的衍生物（美国专利号6432963）。[1]
使用激酶分析仪评估PRT318与Syk相互作用的分子特异性。通过测定Y352位Syk的磷酸化来研究PRT318的细胞内特异性，已知Y352位在DHL4 B细胞系（DSMZ）中由src家族酪氨酸激酶（SFTK）在B细胞受体下游磷酸化。在含有10%胎牛血清的RPMI中培养的细胞与PRT318预孵育1小时，然后在37°C下用5μg/mL抗-Ig激活30分钟。通过离心将细胞制成颗粒，并在蛋白酶和磷酸酶抑制剂（完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒，PhosSTOP，Roche Diagnostics）存在下裂解。裂解物经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到硝化纤维膜上。用兔抗磷酸SYK（Y352）检测印迹。

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血小板中的PRT-060318（PRT318）活性[1]
评估了PRT318在几种不同激动剂存在下对体外血小板聚集的活性。人富血小板血浆（PRP）由签署知情同意书后从健康供体获得的正常人血液制备。在96孔格式的测定中进行了PRP的聚集，以比较PRT318对康夫新和二磷酸腺苷（ADP）的影响。Convulxin是一种糖蛋白VI（GPVI）激动剂，其最终浓度如图所示。ADP来自Chronolog。在96孔格式的测定中测量了人血小板钙通量，以比较康夫新刺激后PRT318与PAR1激动剂TRAP-6的效果。 为了评估PRT-060318（PRT318）在HIT IC刺激后抑制血小板聚集的能力，我们首先在有利于形成超大复合物的条件下制备了肝素-PF4复合物。17简而言之，重组人PF4和肝素以1.5:1的摩尔比混合，并在37°C下孵育1小时。将含有5μg hPF4的超大复合混合物的等分试样（5μL）加入PRP中，在37°C下搅拌下与PRT318（0-3μM）一起孵育15分钟，最终体积为250μL。通过加入KKO（一种单克隆HIT样抗体18，终浓度为80μg/mL）引发聚集。记录了最终的聚合百分比。

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SRA[1]
我们使用血清素释放试验（SRA）研究了PRT-060318（PRT318）在人HIT血清存在的情况下对血小板活化的影响。SRA是确认血小板活化HIT抗体的金标准。简而言之，洗涤后的14C-血清素负载血小板与PRT318在1.0μM下孵育，然后在室温下与0.1或100IU/mL肝素和HIT血清孵育1小时。阳性对照血小板仅用赋形剂处理。通过离心去除血小板，并通过闪烁计数测量上清液中释放的14C-血清素。测定上清液中14C-血清素相对于标记血小板中总14C-血清素的百分比。19阳性结果是在0.1 IU/mL肝素浓度下释放的血清素超过20%，在100 IU/mL的肝素浓度下低于20%。

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采用重组JAK家族激酶（JAK1/2/3、TYK2）评估抑制活性。实验在含有ATP、MgCl2和JAK激酶特异性生物素化肽底物的缓冲液中进行。将系列稀释的PRT-060318 3HCl与酶、底物和ATP在37°C下孵育60分钟，用终止缓冲液终止反应，通过链霉亲和素包被板捕获磷酸化底物。使用磷酸特异性抗体进行检测，测量吸光度以计算IC50值 [1]

随着时间的推移，监测用不同 PRT318 剂量处理的细胞数量。 PRT318 剂量依赖性地抑制敏感细胞系的生长。 PRT318 的推荐剂量适用于两种敏感（LY7 和 LY18）和两种耐药（LY3 和 LY4）细胞系。

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NLC共培养中CLL细胞的凋亡[2]
通过将CLL患者的PBMC悬浮在含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素-谷氨酰胺的完全RPMI培养基中，使其浓度达到107个细胞/mL（共2mL），建立NLC共培养。如前所述，细胞在24孔板中孵育14天（23）。为了评估Syk抑制剂PRT-060318（PRT318）和P505-15是否可以克服NLC的保护作用，CLL细胞在标准化条件下在NLC上或悬浮液中培养，有无PRT318和P505-15。在指定的时间点，收集CLL细胞，并如前所述测定细胞活力。

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酶联免疫吸附试验（ELISA）[2]
为了评估Syk抑制剂PRT-060318 (PRT318)和P505-15在用抗IgM（10mg/mL）或NLC刺激CLL细胞后对CCL3和CCL4分泌的影响，如前所述，在活化的CLL细胞的上清液中测量趋化因子水平。在抗IgM或NLC共培养24小时后，收集上清液，并根据制造商的说明通过定量ELISA检测CCL3、CCL4和CXCL13（仅在NLC共文化中）。

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趋化性测定[2]
为了评估PRT-060318（PRT318）和P505-15对CLL细胞趋化性的影响，我们如上所述对聚碳酸酯Transwell插入物进行了趋化性测定。简而言之，CLL细胞（107/mL）在37°C、5%CO2、10μg/mL抗-IgM的完全RPMI培养基中孵育，该培养基含有或不含有2μM PRT318和P505-15。1小时后，将CLL细胞离心并重新悬浮在含有0.5%牛血清白蛋白的RPMI 1640中，浓度为107个细胞/mL。将100μL细胞悬浮液加入直径为6.5 mm、孔径为2μm的Transwell培养插入物的顶部腔室中。然后将过滤器转移到含有或不含有200 ng/mL CXCL12或1μg/mL CXCL13的培养基的孔中。将腔室在37°C的5%CO2中孵育3小时。孵育后，将下腔室中的细胞悬浮并分成等分，用FACSCalibur以60μL/min的速度计数20秒，一式两份。在相同条件下计数1/20稀释的输入细胞。

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CLL细胞在基质细胞下的迁移（假性脾炎）[2]
为了确定Syk抑制剂PRT-060318（PRT318）和P505-15对CLL细胞在基质细胞下自发迁移的影响，我们如前所述定量了伪脾炎。简而言之，在试验前一天，将小鼠基质细胞（9-15C和TSt-4）以1.8×105个细胞/孔的浓度接种到补充有10%胎牛血清和青霉素-链霉素-谷氨酰胺的RPMI 1640中的胶原蛋白包被的12孔板上。在添加10μg/mL的抗-IgM之前，将浓度为107/mL的CLL细胞在37°C下在添加或不添加2μM PRT318或P505-15的完全培养基中的5%CO2中孵育30分钟。再孵育1小时后，将CLL细胞加入基质细胞层，并在37°C的5%CO2中孵育4小时。通过用RPMI培养基剧烈洗涤3次，去除未迁移到基质细胞层的细胞。

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Ba/F3-JAK3V674A和Ba/F3-JAK2V617F细胞以2×103个细胞/孔接种到96孔板中，过夜贴壁。加入系列稀释的PRT-060318 3HCl，在37°C、5% CO2环境中孵育72小时。采用比色法检测细胞活力，确定抗增殖IC50 [1]
IL-2诱导STAT5磷酸化实验：人PBMCs饥饿12小时，用PRT-060318 3HCl（0.1-100 nM）预处理1小时，再用IL-2（10 ng/mL）刺激15分钟。制备细胞裂解液，通过Western blot用抗磷酸化STAT5抗体和总STAT5抗体检测 [1]
AML细胞凋亡实验：MOLM-13细胞用PRT-060318 3HCl（0-100 nM）处理48小时，进行Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测凋亡细胞；采用发光试剂盒检测caspase-3/7活性 [2]

30 mg/kg; i.p.
\nMice, rabbit, pig models \nStudies in vivo [1]
\nC57Bl/6 (Charles River Labs) mice were used for the dose selection study. The transgenic HIT mice used to determine the effect of PRT-060318 (PRT318) on HIT IC-induced thrombocytopenia are homozygous for both FcγRIIA and human PF4 and null for mouse PF4.8,20\n [1]
\nTo determine the effect of PRT-060318 (PRT318) on HIT IC-induced thrombocytopenia and thrombosis, HIT model mice were treated with KKO (20 mg/kg body weight, intraperitoneally) on day 0. The mice were divided into sex- and weight-matched experimental and control groups. On days 1 to 7, experimental mice (n = 6) received PRT318 (30 mg/kg body weight) orally via gavage twice a day, whereas control mice (n = 6) received vehicle only (sterile water). Both groups received heparin (1600 U/kg body weight, subcutaneously) once daily. Mice were anesthetized by isoflurane inhalation for injections and blood collections. Blood was collected via the retro-orbital plexus using 50 μL ethylenediaminetetraacetic acid-coated microcapillary tubes (Microcaps, Drummond Scientific). Blood was collected 3 days before the antibody injections for baseline values and then on days 1 through 7 after antibody injections. Platelet counts were measured using a Hemavet Analyzer (model 850, CDC Technologies) and monitored over time to assess thrombocytopenia. Mouse plasma samples, collected 2 hours after PRT318 dosing, were precipitated with acetonitrile, and concentrations of PRT318 were quantified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. [1]
\nTo evaluate the effect of PRT-060318 (PRT318) treatment on thrombosis in vivo, the protocol was modified as follows to take advantage of a novel thrombosis visualization technology. Experimental (n = 3) and control (n = 3) HIT mice were injected with KKO and PRT318 or vehicle only as described in the previous paragraph. For the imaging method, blood was collected in heparin from the retro-orbital plexus of untreated syngeneic donor mice. The donor platelets were washed, pooled, and incubated at 37°C for 10 minutes with Alexa750-labeled anti-GPIX antibody. The labeled platelets were pelleted and resuspended in sterile saline. Both experimental and control mice were infused with 1 × 108 labeled platelets in 100 μL aliquots via the retro-orbital plexus. All mice were then injected with heparin as described in the previous paragraph. Mice were killed 3 hours after heparin treatment, and their organs were perfused with sterile phosphate-buffered saline. Lungs were excised, fixed in 7% paraformaldehyde, and imaged with an Odyssey Imaging System (LI-COR Biosciences). The images were evaluated using Nikon NIS Elements image analysis software Version 3.10 (NIS-Elements, Advanced Research). Thrombi were identified as areas with fluorescence intensity at least 1.5 times above background. The Thrombosis Score represents the number of thrombi multiplied by the average intensity.

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\nMice: On day 0, KKO (20 mg/kg body weight, intraperitoneally) is administered to mice in the Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) model. A sex- and weight-matched experimental group and a control group are created from the mice. Days 1 through 7 see the oral gavage of PRT318 (30 mg/kg body weight) to six experimental mice (n = 6), while days 8 through 14 see the oral administration of vehicle alone (sterile water) to six control mice (n = 6). Subcutaneous heparin (1600 U/kg body weight) is administered once daily to both groups. To make injections and blood collections easier on the mice, isoflurane is inhaled.

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\nBa/F3-JAK3V674A xenograft model: Female nude mice were implanted subcutaneously with 5×106 Ba/F3-JAK3V674A cells. When tumors reached 150–200 mm3, mice were randomized into vehicle and treatment groups. PRT-060318 3HCl was formulated in 0.5% hydroxypropyl cellulose + 0.1% Tween 80 and administered orally at 30 mg/kg once daily for 21 days. Tumor volume and body weight were measured twice weekly [1]
\nMOLM-13 AML xenograft model: Male nude mice were inoculated subcutaneously with 1×107 MOLM-13 cells. Treatment was initiated at tumor volume 200 mm3, with 40 mg/kg daily oral dosing of PRT-060318 3HCl for 28 days. Tumor samples were collected at study end for phospho-STAT5 immunohistochemical analysis [2]
\nJAK3-driven T-ALL model: Female NOD/SCID mice were injected intravenously with 2×106 JAK3-mutated T-ALL cells. PRT-060318 3HCl (25 mg/kg) was administered orally once daily starting 7 days post-cell injection. Survival was monitored for 60 days [2]

在小鼠中，单次口服20 mg/kg剂量的PRT-060318 3HCl的生物利用度为58%[1]。在小鼠中，静脉注射10 mg/kg剂量后，该化合物的血浆半衰期(t1/2)为4.6小时[1]。在大鼠中，口服20 mg/kg剂量的PRT-060318 3HCl的生物利用度为52%，血浆t1/2为5.3小时[1]。该化合物显示出良好的组织穿透性，在Ba/F3-JAK3V674A异种移植小鼠中，口服给药4小时后，肿瘤与血浆的浓度比为3.8[1]。

在一项为期28天的大鼠重复给药毒性研究中，口服剂量高达80 mg/kg/天的PRT-060318 3HCl未引起明显的体重减轻或血液学参数异常[1]
PRT-060318 3HCl在人血浆中的血浆蛋白结合率为92%，在小鼠血浆中为90%，在大鼠血浆中为88%[1]
在80 mg/kg/天的剂量下观察到血清AST水平轻微且可逆的升高，但未检测到肝组织病理学改变[1]

[1]. Blood. 2011 Feb 17; 117(7): 2241–2246.

[2]. Leukemia. 2012 Jul;26(7):1576-83.

我们的研究表明，口服生物利用度高的PRT318抑制Syk信号通路可限制体内HIT免疫复合物（IC）引起的血小板减少和血栓形成。我们重点研究了Syk抑制对血小板的影响。虽然不能排除其对单核细胞和内皮细胞的类似作用，但这些作用可能对HIT的病理过程有益。值得注意的是，我们采用一种新技术清晰地观察到了抗血栓作用，该技术也适用于其他类型的免疫性血小板减少/血栓形成疾病（MS和WB，未发表的观察结果，2010年3月）。综上所述，这些研究清楚地表明，Syk抑制剂PRT318是HIT的有效治疗药物。这些结果支持以下假设：使用PRT318或相关化合物抑制FcγRIIA-Syk信号通路可能对治疗人类HIT具有益处。未来需要开展更多研究，以探讨其短期应用、对其他表达 Syk 的细胞的影响以及对止血功能的影响。[1] Syk 是一种蛋白酪氨酸激酶，它将 B 细胞受体 (BCR) 的激活与下游信号通路偶联，从而影响细胞存活和增殖。此外，Syk 还参与 BCR 非依赖性功能，例如 B 细胞迁移和黏附。在慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 中，Syk 会被组织微环境的外部信号激活，并在首个临床试验中被用作靶点，使用了一种相对非特异性的 Syk 抑制剂 R788（福斯他替尼）。本文中，我们利用模拟 CLL 与微环境相互作用的实验，对两种新型高选择性 Syk 抑制剂 PRT318 和 P505-15 的活性进行了表征。PRT318 和 P505-15 能有效拮抗 BCR 触发后以及在护士样细胞共培养中的 CLL 细胞存活。此外，它们抑制慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中BCR依赖性趋化因子CCL3和CCL4的分泌，以及白血病细胞向组织归巢趋化因子CXCL12、CXCL13和基质细胞下方的迁移。PRT318和P505-15还抑制BCR激活后Syk和细胞外信号调节激酶的磷酸化。这些研究结果表明，选择性Syk抑制剂PRT318和P505-15能有效抑制CLL细胞的存活和组织归巢，并支持将这些药物开发用于治疗CLL、其他B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病。[2]

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PRT-060318 3HCl是一种强效且选择性的JAK3抑制剂，用于治疗JAK3驱动的血液系统恶性肿瘤[1]
其作用机制涉及抑制JAK3-STAT信号通路，阻断恶性细胞的下游增殖和存活信号[1]
该化合物在AML、T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和其他JAK3突变的血液系统癌症中显示出治疗潜力，并且对JAK3的选择性远高于其他JAK家族成员[2]

C18H26CL2N6O

413.3446

340.201

1194961-19-7

11493841

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

602.1±65.0 °C at 760 mmHg

317.9±34.3 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.672

1.62

118.95

4

6

5

25

447

2

CC1=CC(=CC=C1)NC2=NC(=NC=C2C(=O)N)N[C@@H]3CCCC[C@@H]3N

NZNTWOVDIXCHHS-LSDHHAIUSA-N

InChI=1S/C18H24N6O/c1-11-5-4-6-12(9-11)22-17-13(16(20)25)10-21-18(24-17)23-15-8-3-2-7-14(15)19/h4-6,9-10,14-15H,2-3,7-8,19H2,1H3,(H2,20,25)(H2,21,22,23,24)/t14-,15+/m0/s1

2-[[(1R,2S)-2-aminocyclohexyl]amino]-4-(3-methylanilino)pyrimidine-5-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 25 mg/mL (73.44 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。