Chk1 (IC50 = 0.3 nM); FLT3 (IC50 = 5.8 nM); PDGFR (IC50 = 606 nM); GSK-3 (IC50 = 23.3 nM)
PTC-209 targets BMI1 polycomb ring finger oncogene (BMI1) with an IC50 of 0.6 μM [1]
PTC-209 inhibits signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) phosphorylation (Tyr705) [2]

PTC-209 抑制人结直肠 HCT116 和人纤维肉瘤 HT1080 肿瘤细胞中 UTR 介导的报告基因表达和内源性 BMI-1 表达。 PTC-209 以 BMI-1 依赖性方式减少结直肠肿瘤细胞的生长。此外，PTC-209 通过不可逆的生长抑制来损害结直肠癌起始细胞 (CIC)。激酶测定：HEK293 细胞用 GEMS 报告载体转染，该载体包含荧光素酶开放阅读框，两侧为 BMI-1 5' 和 3' UTR，并受 BMI-1 5' 和 3' UTR 的转录后控制。将所得稳定细胞 (F8) 用 PTC-209 或载体对照处理过夜，然后使用 Bright-Glo 测定法测定荧光素酶报告活性。每个点进行三次重复测定，并根据载体对照计算抑制百分比。细胞测定：为了确定抑制剂预处理是否影响肿瘤细胞生长，将细胞在体外用抑制剂铺板4天，并在体外以限制剂量铺板，而不添加进一步的抑制剂。台盼蓝排除法用于对活细胞进行计数。抑制剂处理后，通过评估含有球体的孔的数量来计算体外球体起始细胞频率。对于在回收 PTC-209 处理的细胞后设置 LDA 的实验，6 孔板每孔接种 1E6 个细胞并孵育过夜。随后用 DMSO 载体或 PTC-209（0.01、0.1、1 和 10 μM）将细胞处理 4 天，一式三份。洗掉药物处理并向所有孔中添加 4 mL 新鲜悬浮介质。为了评估 4 天治疗窗口后的细胞活力，在去除药物后 0、24、72 和 120 小时对细胞进行胰蛋白酶消化并计数。使用 4 天药物处理后 120 小时获得的细胞，通过铺板 LDA（每孔 50,000、10,000、1,000,100、10 和 1 个细胞）来评估药物处理对球体形成能力的长期影响。

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在人结直肠癌细胞系（HCT116、SW480、HT29）中，PTC-209（0.5–10 μM）剂量依赖性抑制细胞增殖，72 小时 IC50 值分别为 HCT116（1.2 μM）、SW480（1.8 μM）、HT29（2.3 μM）。5 μM 时，它将 CD133+/CD44+ 结直肠癌干细胞（CSCs）比例从 ~15% 降至 ~3%（HCT116）、~12% 降至 ~2%（SW480），并抑制球形成（5 μM 时球数量减少约 75%）[1]
- PTC-209（1–5 μM）诱导结直肠癌细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI 染色显示，5 μM 时 HCT116 和 SW480 细胞凋亡率分别为 ~38% 和 ~32%。Western blot 显示 cleaved caspase-3/7 和 Bax 上调，Bcl-2 下调，BMI1 蛋白水平降低（5 μM 时约 60%）[1]
- 在人鳞状细胞癌细胞系（SCC13、A431、FaDu）和鳞状细胞癌干细胞（SCC-CSCs）中，PTC-209（0.5–8 μM）抑制细胞增殖，IC50 值分别为 SCC13（1.1 μM）、A431（1.5 μM）、FaDu（1.9 μM）、SCC-CSCs（0.8 μM）。它耗竭 BMI1+ 干细胞（SCC13 中从 ~22% 降至 ~4%），阻断自我更新（4 μM 时球形成效率降低约 80%）[3]
- 在结直肠癌细胞（HCT116）和鳞状细胞癌细胞（SCC13）中，PTC-209（2–5 μM）增强对 5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂的化疗敏感性：与 4 μM PTC-209 联合使用时，5-FU 的 IC50 降低约 60%（HCT116）和 55%（SCC13），顺铂的 IC50 降低约 58%（SCC13）[1,3]
- 在 MDA-MB-231 乳腺癌细胞和 HepG2 肝癌细胞中，PTC-209（1–10 μM）剂量依赖性抑制 STAT3 磷酸化（Tyr705），5 μM 时抑制率为 ~50–70%，下调 STAT3 靶基因（Bcl-xL、Survivin、Cyclin D1）的 mRNA 和蛋白水平，抑制细胞增殖（MDA-MB-231 的 IC50 ~2.5 μM）[2]

PTC-209（60 mg/kg/天，皮下注射）可有效抑制肿瘤组织中 BMI-1 的产生，并阻止携带原发性人结肠癌异种移植物、人结肠癌细胞系 LIM1215 或 HCT116 异种移植物的小鼠中预先形成的肿瘤的生长。 PTC-209 还降低了体内功能性结直肠 CIC 的频率。

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在 HCT116 结直肠癌裸鼠异种移植模型中，口服给予 PTC-209（50 mg/kg/天，持续 4 周）显著抑制肿瘤生长：与溶媒对照组相比，肿瘤体积减少约 65%，肿瘤重量减轻约 62%。免疫组化染色显示 BMI1 表达降低（约 58%），CD133+ 干细胞比例从 ~14% 降至 ~3%，Ki-67 增殖指数从 ~72% 降至 ~28%，TUNEL 阳性凋亡细胞从 ~4% 增至 ~26% [1]
- 在 SCC13 鳞状细胞癌裸鼠异种移植模型中，口服 PTC-209（40 mg/kg/天，持续 5 周）抑制原发肿瘤生长（体积减少约 68%，重量减少约 64%），阻断肺转移：转移结节数从每只小鼠 ~18 个降至 ~4 个。它还增强顺铂的抗肿瘤效果（联合治疗肿瘤体积减少 ~82%，顺铂单药组减少 ~45%）[3]
- 在 3 个结直肠癌患者来源异种移植（PDX）模型中，口服 PTC-209（50 mg/kg/天，持续 6 周）使肿瘤生长减少 ~55–60%，提高存活率（中位生存期较对照组延长约 40%）。肿瘤组织中 BMI1 和干细胞标志物（CD133、CD44）表达降低 [1]

转染至 HEK293 细胞的 GEMS 报告载体具有被 BMI-1 5' 和 3' UTR 包围的荧光素酶开放阅读框，并受其转录后控制。 Bright-Glo 测定用于测量用 PTC-209 或载体对照长时间处理所得稳定细胞 (F8) 后的荧光素酶报告基因活性。对于每个点，进行三次测定，并与载体对照相比计算抑制百分比。

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BMI1 泛素化实验：重组 BMI1 蛋白与 E1、E2、泛素和 ATP 在反应缓冲液中孵育。将系列稀释（0.1–10 μM）的 PTC-209 加入混合物，37°C 孵育 1 小时。加入 SDS-PAGE 上样缓冲液终止反应，通过 Western blot 用抗泛素抗体检测泛素化 BMI1，光密度法定量 BMI1 泛素化（调控其稳定性）的抑制程度 [1]
- STAT3 磷酸化实验：重组 Janus 激酶 2（JAK2）和 STAT3 蛋白与 ATP 在激酶缓冲液中孵育。加入 PTC-209（0.5–10 μM），30°C 孵育 30 分钟。通过 Western blot 用磷酸化特异性抗体检测磷酸化 STAT3（Tyr705），相对于溶媒对照组计算抑制率 [2]

将细胞在体外用抑制剂铺板4天，并在不添加额外抑制剂的情况下以有限剂量在体外铺板，以确定抑制剂预处理是否影响肿瘤细胞生长。使用台盼蓝排除法进行活细胞计数。含有球体的孔的数量用于计算抑制剂处理后的体外球体引发细胞频率。在 6 孔板中每孔接种一个 E6 细胞并孵育过夜，以进行实验，其中在回收 PTC-209 处理的细胞后设置 LDA。之后，用 PTC-209（0.01、0.1、1 和 10 μM）或 DMSO 载体一式三份处理细胞 4 天。洗掉药物处理后，每孔加入 4 mL 全新的悬浮介质。去除药物后 0、24、72 和 120 小时对细胞进行胰蛋白酶消化并计数，以评估 4 天治疗窗口后细胞的活力。通过使用 4 天药物处理后 120 小时获得的细胞铺板 LDA（每孔 50,000、10,000、1,000、100、10 和 1 个细胞），评估药物处理对球体形成能力的长期影响。

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结直肠癌细胞增殖和干细胞实验：HCT116、SW480、HT29 细胞以 5×103 个细胞/孔接种到 96 孔板，用 PTC-209（0.5–10 μM）处理 72 小时。MTT 法测量细胞活力计算 IC50 值。干细胞分析中，细胞用 CD133 和 CD44 抗体染色，流式细胞术分析。球形成实验：结直肠癌细胞以 1×103 个细胞/孔接种到超低吸附板的无血清培养基中，用 PTC-209（0.5–5 μM）处理 10 天，计数 >100 μm 的球 [1]
- 鳞状细胞癌干细胞分离和自我更新实验：SCC13 细胞用 BMI1 抗体染色，流式细胞术分选获得 BMI1+ 鳞状细胞癌干细胞。分离的干细胞以 2×103 个细胞/孔接种到 96 孔板（增殖实验）或超低吸附板（自我更新实验）。化疗敏感性实验：鳞状细胞癌细胞用 PTC-209（2–4 μM）预处理 24 小时，再用顺铂（0.1–10 μM）处理 48 小时；CCK-8 法测量细胞活力 [3]
- 凋亡和 Western blot 实验：结直肠癌或鳞状细胞癌细胞用 PTC-209（1–5 μM）处理 24–48 小时。细胞用 Annexin V-FITC 和 PI 染色，流式细胞术分析凋亡。Western blot 实验中，制备细胞裂解液，SDS-PAGE 分离蛋白，用针对 BMI1、cleaved caspase-3/7、Bax、Bcl-2、STAT3、磷酸化 STAT3（Tyr705）和 β-肌动蛋白（内参）的抗体进行检测 [1,2,3]

本品配制于含14% DMSO、36%聚乙二醇400和50%聚丙二醇的溶液中；剂量为60 mg/kg/天；皮下注射。原发性人结肠癌异种移植瘤模型，以及裸鼠体内人结肠癌细胞系LIM1215和HCT116的异种移植瘤模型。原发性人结肠癌异种移植瘤模型：将HCT116细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下注射到6-8周龄雌性BALB/c裸鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为对照组和治疗组（每组n=6）。PTC-209溶于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液中，以50 mg/kg/天的剂量灌胃给药，持续4周。对照组小鼠灌胃0.5% CMC-Na溶液。记录肿瘤体积（每3天用游标卡尺测量一次）和体重（每周一次）。处死小鼠，切除肿瘤，称重，并固定用于免疫组织化学染色（BMI1、CD133、Ki-67、TUNEL）[1]
- SCC异种移植和转移模型：将SCC13细胞（1×10⁷个细胞/只）皮下注射到8-10周龄的雄性裸鼠体内，或将BMI1+ SCC-CSCs（2×10⁵个细胞/只）静脉注射到裸鼠体内，以建立肺转移模型。对于原发肿瘤治疗，当肿瘤体积达到约120 mm³时，口服PTC-209（40 mg/kg/天），持续5周。为了增强化疗敏感性，小鼠接受了PTC-209（40 mg/kg/天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔注射，每周一次，持续3周）的治疗。测量肿瘤体积和体重；收集肺组织以计数转移结节[3]
- CRC PDX模型：将患者的新鲜CRC组织皮下植入NOD/SCID小鼠体内。当肿瘤体积达到约150 mm³时，小鼠接受PTC-209（50 mg/kg/天）口服治疗，持续6周。监测肿瘤生长情况，并记录生存率。收集肿瘤组织进行BMI1和CSC标志物的Western blot和免疫组织化学分析[1]

小鼠单次口服 50 mg/kg 的 PTC-209 后，其口服生物利用度约为 45% [1]
- 小鼠口服 50 mg/kg 的 PTC-209 后，血浆峰浓度 (Cmax) 为 3.2 μg/mL，达峰时间为 1.5 小时 (Tmax) [1]
- 小鼠静脉注射 10 mg/kg 的 PTC-209 后，其血浆消除半衰期 (t1/2) 约为 5.8 小时 [1]

体外毒性：PTC-209（0.5–10 μM）不影响正常人结肠上皮细胞 (NCM460) 或正常表皮角质形成细胞 (NHEK) 的活力，在所有测试浓度下细胞活力均保持在 85% 以上 [1,3]
- 体内毒性：裸鼠和 NOD/SCID 小鼠口服 PTC-209（40–50 mg/kg/天，持续 4–6 周）后，未引起体重显著变化（对照组 vs. 治疗组：~20 g vs. ~19–19.5 g）或明显的毒性症状（例如，嗜睡、腹泻、器官损伤）。血清 ALT、AST、肌酐和尿素氮水平均在正常范围内 [1,3]

[1]. Self-renewal as a therapeutic target in human colorectal cancer. Nat Med. 2014 Jan;20(1):29-36.

[2]. PTC-209 Anti-Cancer Effects Involved the Inhibition of STAT3 Phosphorylation. Front Pharmacol. 2019;10:1199. Published 2019 Oct 21.

[3]. Targeting BMI1+ Cancer Stem Cells Overcomes Chemoresistance and Inhibits Metastases in Squamous Cell Carcinoma. Cell Stem Cell. 2017 May 4;20(5):621-634.e6.

PTC-209是一种小分子BMI1抑制剂，BMI1是癌症干细胞自我更新和化疗耐药性的关键调节因子[1,3]
- 其抗癌机制包括：1）抑制BMI1以消耗癌症干细胞，抑制自我更新，并诱导细胞凋亡； 2) 抑制 STAT3 磷酸化以下调致癌靶基因（Bcl-xL、Survivin）[1,2,3]
- PTC-209 通过克服癌症干细胞介导的化疗耐药性，增强化疗药物（5-FU、顺铂）的疗效[1,3]
- 它通过靶向 BMI1+ 癌症干细胞（肿瘤扩散的罪魁祸首）发挥抗转移活性[3]
- PTC-209 对结直肠癌、鳞状细胞癌和其他由 BMI1+ 癌症干细胞驱动的实体瘤显示出治疗潜力[1,3]

C17H13BR2N5OS

495.19

492.92

C, 41.23; H, 2.65; Br, 32.27; N, 14.14; O, 3.23; S, 6.48

315704-66-6

PTC-209 hydrobromide;1217022-63-3

1117196

Beige to grey solid powder

1.9±0.1 g/cm3

1.772

4.13

92.58

1

6

4

26

480

0

CC1=C(C2=CSC(NC3=C(Br)C=C(OC)C=C3Br)=N2)N4C=CC=NC4=N1

XVOOCQSWCCRVDY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H13Br2N5OS/c1-9-15(24-5-3-4-20-16(24)21-9)13-8-26-17(22-13)23-14-11(18)6-10(25-2)7-12(14)19/h3-8H,1-2H3,(H,22,23)

N-(2,6-dibromo-4-methoxyphenyl)-4-(2-methylimidazo[1,2-a]pyrimidin-3-yl)-1,3-thiazol-2-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.05 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。