| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
The target of RBC8 is the GTPase Ral, including RalA and RalB (both are Ras-like GTPases). [1]
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外活性：在活细胞中，RBC8 还通过诱导 RalB-GDP 的化学位移变化来降低 RalA 的激活。在 Ral 依赖性细胞系 H2122 和 H358 中，RBC8 引起锚定非依赖性生长抑制，IC50 分别为 3.5 µM 和 3.4 µM 激酶测定：His-RalA (100 ng) 与 γ 标记的 32P-GTP（8 nM 测定浓度）一起孵育）和 DMSO 或单个化合物（50 μM 测定浓度）在 EDTA (20 mM) 存在下溶解在 DMSO 中，30°C 15 分钟。通过稀释到过量的 MgCl2 中来终止反应，并通过过滤器结合来测量放射性标记的核苷酸的掺入。 32P-GTP（α-标记）通过核苷酸二磷酸激酶转化为 32P-GDP，并用于与 GDP 的结合测定。细胞测定：在不依赖贴壁的条件下在软琼脂中测量化合物对人肺癌细胞的生长抑制。将细胞以每孔 15,000 个细胞接种到 6 孔板（涂有由 2.0 ml 1% 低熔点琼脂糖制成的基底层）中，并置于含有不同浓度药物的 3.0 mL 0.4% 低熔点琼脂糖中。孵育2至4周（取决于细胞系）后，用1.0 mg ml−1硝基蓝四唑对细胞进行染色，并在显微镜下对菌落进行计数。 IC50 值定义为与 DMSO 处理的对照相比，导致菌落数量减少 50% 的药物浓度。
1. 抑制Ral-效应因子结合：RBC8可抑制Ral（包括RalA和RalB）与其效应因子RALBP1的结合，该抑制作用通过相关结合实验验证，对阻断Ral介导的下游信号通路至关重要[1] 2. 抑制Ral介导的细胞铺展：将小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）用0-15μM浓度范围的RBC8处理1小时后，该化合物可有效抑制RalA依赖的细胞铺展。剂量效应实验表明，其抑制作用具有浓度相关性，浓度越高，抑制效果越强[1] 3. 抑制癌细胞锚定非依赖性生长：RBC8对Ral siRNA敲低敏感的人肺癌细胞系（如H2122、H358）的锚定非依赖性生长具有抑制活性。将这些细胞接种于含不同浓度RBC8的软琼脂中，2-4周后形成的集落数较对照组显著减少；而对Ral siRNA敲低不敏感的细胞系（如H460、Calu6）则几乎无作用[1] 4. 对Ral的选择性：RBC8相对于其他GTP酶（包括Ras和RhoA）对Ral（RalA和RalB）具有选择性。在体外活性实验中，它不会显著抑制Ras或RhoA的活性，表明其抑制作用对Ral具有特异性[1] 5. 细胞内Ral活性检测：将H2122和H358细胞在锚定非依赖性培养条件下用10μMRBC8处理3小时后，细胞裂解液经RALBP1琼脂糖珠下拉实验，结合蛋白质印迹分析（使用RalA和RalB特异性抗体）显示，RBC8可显著降低细胞内活性态Ral（RalA和RalB均包括）的量，证实其在体外抑制Ral活性的能力[1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
在携带 H358 异种移植物的小鼠中，RBC8（50 mg/kg ip）通过特异性抑制 RalA 和 RalB 抑制肿瘤生长
1. 抑制肿瘤异种移植生长：对接种人肺癌细胞系（H2122、H358）的裸鼠，于接种后24小时开始，通过腹腔注射给予50mg/kg/天剂量的RBC8。治疗21天后，RBC8处理组的肿瘤体积显著小于对照组，且其对肿瘤生长的抑制效果与通过RNA干扰耗竭Ral的效果相当[1] 2. 抑制肿瘤组织中Ral活性：对携带H2122异种移植瘤的裸鼠，单次腹腔注射50mg/kgRBC8。3小时后收集肿瘤组织，采用RALBP1下拉实验检测肿瘤裂解液中RalA和RalB的活性。蛋白质印迹分析及定量结果显示，RBC8可显著抑制肿瘤组织中RalA和RalB的活性（p<0.001，n=24），处理组活性态Ral的量较对照组显著降低；而对照化合物RBC5无此抑制作用[1] |
| 酶活实验 |
将 His-RalA (100 ng) 在 30 摄氏度下与 γ 标记的 32P-GTP（8 nM 测定浓度）、DMSO 或溶解在 DMSO 和 EDTA（20 mM 测定浓度）中的单个化合物（50 μM 测定浓度）一起孵育 15 分钟。 ）。通过稀释到过量 MgCl2 中止反应后，使用过滤器结合来测量掺入的放射性标记核苷酸的量。核苷酸二磷酸激酶将 32P-GTP（α 标记）转变为 32P-GDP，然后将其用于与 GDP 的结合实验。
1. Ral-RALBP1结合抑制实验：以纯化的Ral蛋白（GDP结合形式）及其效应因子RALBP1构建实验体系，向含Ral和RALBP1的反应体系中加入不同浓度的RBC8。在适宜温度下孵育特定时间后，采用合适的方法（如免疫沉淀结合蛋白质印迹法或荧光共振能量转移法）检测形成的Ral-RALBP1复合物量。结果显示，RBC8可剂量依赖性地抑制Ral-RALBP1复合物的形成，从而验证其阻断Ral与效应因子相互作用的能力[1] 2. 基于NMR的Ral结合实验：制备100μM RalB-GDP溶液，向其中加入RBC8使其终浓度为100μM，分别记录RalB-GDP单独存在及与RBC8共孵育后的¹⁵N-HSQC NMR谱图。对比两张谱图发现，RalB-GDP的部分特定残基出现显著的化学位移变化，表明RBC8与RalB-GDP发生结合，且这些化学位移变化主要集中在RalB上与RBC8结合位点相关的区域，进一步证实化合物与Ral的特异性结合[1] |
| 细胞实验 |
在软琼脂中，使用不依赖贴壁的条件来测量化合物对人肺癌细胞的生长抑制作用。将含有不同药物浓度的 3.0 mL 0.4% 低熔点琼脂糖每孔 15,000 个细胞接种到 6 孔板（已涂有 2.0 ml 1% 低熔点琼脂糖底层）中。孵育后两到四周（取决于细胞系），用 1.0 mg ml−1 硝基蓝四唑对细胞进行染色，并在显微镜下对菌落进行计数。与 DMSO 处理的对照相比，导致菌落数减少 50% 的药物浓度称为 IC50 值。
1. MEF细胞铺展实验：将野生型或caveolin⁻/⁻ MEF细胞在适宜条件下培养，用0-15μM浓度的RBC8处理细胞1小时。处理后将细胞接种于合适的基质上，孵育一定时间使细胞铺展，在显微镜下计数铺展的细胞数并计算铺展细胞百分比。结果显示，RBC8可浓度依赖性地抑制RalA依赖的MEF细胞铺展[1] 2. 癌细胞软琼脂集落形成实验：将人肺癌细胞系（H2122、H358、H460、Calu6）培养至对数生长期，计数并调整至适宜密度。将不同浓度的RBC8与细胞悬液混合，接种于软琼脂（下层为0.6%琼脂，上层为含细胞和药物的0.3%琼脂）培养皿中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养2-4周。培养结束后，在显微镜下计数直径大于一定尺寸（如50μm）的集落数。结果显示，RBC8可显著减少Ral敏感细胞系（H2122、H358）形成的集落数，对Ral不敏感细胞系（H460、Calu6）则无明显作用[1] 3. 细胞内Ral活性下拉检测实验：将H2122和H358细胞在锚定非依赖性培养条件（如软琼脂或超低吸附培养皿）下培养，用10μMRBC8处理3小时。处理后收集细胞，用适宜的裂解缓冲液裂解，取400μg蛋白量的细胞裂解液与RALBP1琼脂糖珠在4℃下孵育一定时间（如1小时），以下拉活性态Ral。用裂解缓冲液多次洗涤珠子后，加入SDS-PAGE上样缓冲液并加热洗脱结合的蛋白。将洗脱的蛋白及20μg蛋白量的总细胞裂解液（作为上样对照）进行SDS-PAGE电泳，随后用RalA和RalB特异性抗体进行蛋白质印迹分析。采用图像分析软件对条带强度进行定量，计算活性态Ral的相对量，结果显示RBC8可显著降低细胞内活性态Ral的水平[1] 4. siRNA敲低联合药物处理实验：用适宜的转染试剂将10、30或50nM靶向RalA和RalB的siRNA（或对照siRNA）转染至H2122和H358细胞中。转染48小时后收集细胞，接种于含固定浓度RBC8的软琼脂中，按上述软琼脂集落形成实验步骤操作。结果显示，siRNA介导的RalA和RalB敲低可增强RBC8对集落形成的抑制作用，随着siRNA浓度的增加，RBC8存在下形成的集落数进一步减少，表明RBC8的抑制作用依赖于Ral[1] |
| 动物实验 |
DMSO，50 mg/kg，腹腔注射
荷瘤小鼠（H358异种移植瘤） 1. 肿瘤异种移植模型建立及药物治疗（H2122和H358）：收集处于对数生长期的肺癌细胞（H2122或H358），并重悬于合适的培养基（例如，PBS与Matrigel按1:1比例混合）中，细胞浓度为1×10⁷个/mL。每只裸鼠右侧腹部皮下注射0.2 mL细胞悬液。接种24小时后，将小鼠随机分为两组：RBC8治疗组和对照组（每组n=6）。将RBC8溶解于合适的溶剂中（具体溶剂未详细说明，但常用的腹腔注射溶剂包括DMSO与生理盐水的混合液），并以50 mg/kg/天的剂量腹腔注射给治疗组。对照组注射等体积的溶剂。每3-4天使用游标卡尺测量肿瘤体积，并使用公式：体积 = (长 × 宽²)/2计算肿瘤体积。治疗持续21天，实验结束时处死小鼠，收集肿瘤组织进行后续分析[1]。 2. 体内Ral活性检测：使用荷H2122异种移植瘤的裸鼠。当肿瘤体积达到约100-200 mm³时，将小鼠随机分为两组：RBC8治疗组和对照组。治疗组小鼠腹腔注射单次50 mg/kg RBC8，对照组注射等体积溶剂。给药3小时后处死小鼠，迅速取出肿瘤组织并置于冰冷的裂解缓冲液中。使用匀浆器匀浆肿瘤组织，离心后取上清液（肿瘤裂解液）。采用RalBP1 pull-down法结合Western blot分析检测肿瘤裂解液中的Ral活性，具体方法见细胞实验部分。此外，在每个Western blot条带中加入10 ng重组人RalA或RalB作为内参，以校正条带强度并比较不同条带的结果[1]。 3. RBC8在小鼠体内的药代动力学和组织分布研究：裸鼠腹腔注射单次50 mg/kg RBC8。给药后不同时间点（0、0.25、0.5、1、2、3、4 和 5 小时），从小鼠眼眶静脉丛采集血样。将血样离心分离血浆，并采用合适的分析方法（例如液相色谱-串联质谱法）测定血浆中 RBC8 的浓度。基于血浆浓度-时间数据，计算外推初始浓度 (C₀)、半衰期 (T₁/₂) 和 0 至 5 小时浓度-时间曲线下面积 (AUC₀₋₅hr) 等药代动力学参数。单次腹腔注射 50 mg/kg RBC8 3 小时后，处死小鼠，并收集各种组织（包括肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏、肺和心脏）。采用相同的分析方法测定各组织中 RBC8 的浓度，以评估其组织分布[1] |
| 药代性质 (ADME/PK) |
1. 小鼠体内药代动力学参数：裸鼠单次腹腔注射 50 mg/kg RBC8 后，根据血浆浓度测定药代动力学参数。具体参数包括外推初始浓度 (C₀)、半衰期 (T₁/₂) 和 0 至 5 小时浓度-时间曲线下面积 (AUC₀₋₅hr)。然而，文献 [1] 中并未提供这些参数的具体数值。
2. 小鼠体内组织分布：裸鼠单次腹腔注射 50 mg/kg RBC8 三小时后，在多种组织中检测到该化合物。它能够分布到肿瘤组织中，且肿瘤组织中的浓度足以抑制 Ral 的活性。此外，它还分布于肝脏、肾脏、脾脏、肺脏和心脏等其他组织中，但各组织中的具体浓度值未详细说明[1] 3. 体外细胞摄取：用10 μM RBC8处理H2122人肺癌细胞。在处理后的不同时间点（1、5、15、30和60分钟），收集细胞，并使用液相色谱-串联质谱法测定细胞内RBC8的浓度。结果表明，RBC8可被细胞摄取，且在检测时间内细胞内浓度随时间增加[1] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
1. 背景：Ras样GTP酶RalA和RalB是多种癌症（如胰腺癌、结肠癌和肺癌）中肿瘤生长和转移的重要驱动因素。然而，在本研究之前，尚无有效药物能够阻断Ral的活性。RBC8是一种通过蛋白质结构分析和虚拟筛选发现的小分子化合物，它可以靶向Ral的GDP结合形式并抑制其活性。这一发现为研究Ral的功能提供了一种新的研究工具，并为Ral依赖性癌症提供了一种潜在的治疗策略[1]。2. 作用机制：Ral与Ral的GDP结合（非活性）形式结合，阻止Ral被激活（即阻止GDP与GTP交换）。 RBC8通过与Ral结合，阻断Ral与其效应蛋白RALBP1的相互作用，从而抑制Ral介导的下游信号通路（例如参与细胞铺展和非锚定依赖性生长的通路），最终抑制肿瘤生长和转移[1]。
3. 研究意义：RBC8的开发证明了基于结构的药物发现方法在Ral依赖性癌症中的应用价值。它验证了以小分子靶向Ral的可行性，为进一步优化Ral抑制剂和开发新型癌症疗法奠定了基础。此外，RBC8对Ral的选择性降低了潜在的脱靶效应，这有利于其作为治疗药物的后续开发[1]。 |
| 分子式 |
C25H20N4O3
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|---|---|---|
| 分子量 |
424.45
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| 精确质量 |
424.154
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| 元素分析 |
C, 70.74; H, 4.75; N, 13.20; O, 11.31
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| CAS号 |
361185-42-4
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
6626226
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| LogP |
5.165
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| tPSA |
106.18
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| 氢键供体(HBD)数目 |
2
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|
| 氢键受体(HBA)数目 |
6
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|
| 可旋转键数目(RBC) |
4
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| 重原子数目 |
32
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| 分子复杂度/Complexity |
764
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|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O1C(=C(C#N)C([H])(C2C([H])=C(C([H])=C([H])C=2OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H])C2C1=NN([H])C=2C1C([H])=C([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C=1[H])N([H])[H]
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| InChi Key |
CLMQBVUFKIKYLU-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C25H20N4O3/c1-30-17-9-10-20(31-2)18(12-17)21-19(13-26)24(27)32-25-22(21)23(28-29-25)16-8-7-14-5-3-4-6-15(14)11-16/h3-12,21H,27H2,1-2H3,(H,28,29)
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| 化学名 |
6-amino-4-(2,5-dimethoxyphenyl)-3-naphthalen-2-yl-2,4-dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.89 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.3560 mL | 11.7800 mL | 23.5599 mL | |
| 5 mM | 0.4712 mL | 2.3560 mL | 4.7120 mL | |
| 10 mM | 0.2356 mL | 1.1780 mL | 2.3560 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
Cell-based secondary screening identified RBC6, 8 and 10 as lead compounds for Ral inhibition.Nature.2014 Nov 20;515(7527):443-7. |
|---|
Effect of Ral inhibitors on human xenograft models of lung cancer.Nature.2014 Nov 20;515(7527):443-7. |
Inhibition of Ral activity by RBC8 and RBC5in vivo.Nature.2014 Nov 20;515(7527):443-7. |
GGTI-286
SOS1-IN-3
KRAS G12C inhibitor 44
Rac1 Inhibitor W56
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