Histone deacetylase 3 (HDAC3) ( IC50 = 80 nM )

采用基于底物的生化分析实验发现，RGFP966可抑制HDAC3，IC50为80 nM，且在浓度高达15μM时对其他HDACs无明显抑制作用。在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系上进行测试时，RGFP966可通过靶向HDAC3显著抑制细胞生长，其机制与促进细胞凋亡相关 [1]
体外活性：RGFP966 是一种缓慢启动/缓慢关闭、竞争性紧密结合 HDAC 抑制剂，对 HDAC3 的 IC50 为 0.08μM，在浓度高达 15μM 时对任何其他 HDAC 没有有效抑制作用。在进行蛋白质印迹分析之前，RGFP966 对两种 CTCL 细胞系进行 24 小时处理，导致 H3K9/K14、H3K27 和 H4K5 的乙酰化增加，但 H3K56ac 则没有。 RGFP966 由于与 DNA 损伤和 S 期进展受损相关的细胞凋亡增加而降低 CTCL（皮肤 T 细胞淋巴瘤）细胞系的细胞生长。 RGFP966 在药物治疗的第一个小时内导致 DNA 复制叉速度显着降低。激酶测定：脱乙酰化测定基于均相荧光释放测定。将纯化的重组酶与图中所示浓度的系列稀释抑制剂一起在标准 HDAC 缓冲液中孵育，预孵育时间范围为 0 至 3 小时。预孵育期后添加乙酰基-Lys(Ac)-AMC 底物（10 μM，对应于 HDAC1 和 HDAC3 的 Km）。让反应进行1小时。 1小时后添加终浓度为5mg/ml的胰蛋白酶肽酶显色剂，然后使用Tecan M200 96孔板读数器测量荧光发射。细胞测定：对细胞进行计数并以 26105 个细胞/mL 分装到 T25 (Corning) 烧瓶中。然后在第 0 小时用 DMSO 或 HDIs 处理细胞一次。处理后 0 小时、24 小时、48 小时和 72 小时从每个烧瓶中一式三份取出 100 ml 等分试样，分配到平底 96 孔板中，并向每个孔中添加10ml阿尔玛蓝。孵育 4 小时后，使用 Biotek Synergy MX 酶标仪测量荧光。

- 在雄性C57BL/6J小鼠中，给予RGFP966后，对小鼠进行物体识别（ORM）和基于位置的物体识别（OLM）训练。结果表明，RGFP966可显著提高小鼠对新物体的偏好，呈剂量依赖性，并且可增强长期OLM记忆 [1]
- RGFP966可减轻大鼠心脏长时间低温保存引起的心脏功能障碍。它能抑制低温保存诱导的磷酸化（p）-MST1/MST1和p-YAP/YAP比值的升高，阻止总YAP蛋白表达的减少，并增加核YAP蛋白水平。还能增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的表达，抑制促凋亡蛋白Bax和裂解的半胱天冬酶-3的过表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少心肌细胞凋亡。其机制可能涉及YAP通路的失活 [2]
RGFP966 处理（10 毫克/千克）可增强物体记忆的长期记忆。 RGFP966（3 或 10 mg/kg，皮下注射）可促进灭绝并防止可卡因条件性位置偏好的恢复。

采用基于底物的生化分析实验检测RGFP966对HDACs的抑制作用。制备反应体系，将HDAC3酶、底物和不同浓度的RGFP966加入反应孔中，在合适温度下孵育一段时间，然后通过特定的检测方法（文献未描述具体检测方法）检测反应产物，从而得到RGFP966对HDAC3的抑制曲线并计算IC50值 [1]
乙酰化测定源自均相荧光释放方法。经过 0 至 3 小时的预孵育期后，将纯化的重组酶与按图中所示浓度连续稀释的抑制剂一起在标准 HDAC 缓冲液中孵育。预孵育后，添加乙酰基-Lys(Ac)-AMC 底物（10 μM，对应于 HDAC1 和 HDAC3 的 Km）。给予反应一个小时以继续进行。以 5 mg/ml 的终浓度添加胰蛋白酶肽酶显色剂一小时后，使用 Tecan M200 96 孔板读数器测量荧光发射。

对于皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系：将细胞在合适的培养基中培养并接种到培养板中。细胞贴壁后，加入不同浓度的RGFP966。在一段时间内监测细胞生长情况，并使用相关方法评估细胞活力。此外，通过检测凋亡标志物等技术评估其对细胞凋亡的影响 [1]
以 26105 个细胞/mL 对细胞进行计数并分入 T25 (Corning) 烧瓶中。此后，在第 0 小时用 DMSO 或 HDIs 处理细胞一次。处理后 0、24、48 和 72 小时，从每个烧瓶中一式三份取出 100 ml 等分试样，分配到平底 96 孔板中，并向每个孔中添加 10 ml 阿尔玛蓝。使用 Biotek Synergy MX 酶标仪，在 4 小时孵育期后测量荧光。

Mice: The N171-82Q transgenic mice are kept in their housing and given free access to food and water, as well as a typical 12-hour light/dark cycle beginning at 6:00 a.m. Beginning at 8 weeks of age, mice are given 3 injections per week by subcutaneous injection of RGFP966 (10 or 25 mg/kg) for a duration of 10 weeks. A solution of 75% polyethylene glycol 200/25% sodium acetate (6.25 mM) is used to dissolve RGFP966; mice in the control group were given the same volume of drug vehicle. Weights are recorded twice a week for the body. At eighteen weeks of age, mice are killed by overdosing on isofluorane anesthesia, six hours after the last injection. Brains are taken out, and 4% paraformaldehyde is either intracardially infused, or the cortex and striata are separated out for gene expression experiments.
Rats: The experiment uses thirty-three adult male Sprague Dawley rats weighing between 275 and 350 grams. A posttraining systemic injection of either RGPF966 (10 mg/kg, s.c.) or vehicle (at a volume similar to drug treatment) is administered to each subject right after the daily training session.

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- In the memory-related experiment: Male C57BL/6J mice were used, and RGFP966 was administered to the mice. Then, the mice were trained in ORM and OLM tests. The specific training method is: first, let the mice familiarize with the experimental environment, then place a familiar object in the test area, let the mice explore, and then place a new object, and record the time that the mice spent exploring the new object and the familiar object to calculate the novel object preference. In the OLM test, change the position of the object, and record the exploration time of the mice to evaluate the long-term OLM memory. Different doses of RGFP966 were set, and the dose-response relationship was analyzed according to the test results [1]
- In the cardiac dysfunction experiment: Rat hearts were hypothermically preserved in Celsior solution with or without RGFP966 for 12 h, followed by 60 min of reperfusion. The hemodynamic parameters during reperfusion were evaluated. The expression and phosphorylation levels of MST1 and YAP were determined by western blotting, and cell apoptosis was measured by the TUNEL method [2]

[1]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2013 Feb 12;110(7):2647-52.

[2]. PLoS One . 2013 Jul 22;8(7):e68915.

DAC3 is an isoform of the HDACs family, which plays an important role in DNA transcriptional regulation. HDACs are involved in many biological processes, such as DNA repair, replication, transcription and chromatin structure. RGFP966 is a potent and selective HDAC3 inhibitor, which has potential application value in the treatment of related diseases by regulating the function of HDAC3 [1]
N-(2-amino-4-fluorophenyl)-3-[1-(3-phenylprop-2-enyl)-4-pyrazolyl]-2-propenamide is an aromatic amide and an aromatic amine.

C21H19FN4O

362.4

362.154

C, 69.60; H, 5.28; F, 5.24; N, 15.46; O, 4.41

1357389-11-7

56650312

White solid powder

1.2±0.1 g/cm3

630.4±55.0 °C at 760 mmHg

335.0±31.5 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.607

3.95

76.43

2

4

6

27

532

0

O=C(NC1=CC=C(F)C=C1N)/C=C/C2=CN(C/C=C/C3=CC=CC=C3)N=C2.[E]

BLVQHYHDYFTPDV-VCABWLAWSA-N

InChI=1S/C21H19FN4O/c22-18-9-10-20(19(23)13-18)25-21(27)11-8-17-14-24-26(15-17)12-4-7-16-5-2-1-3-6-16/h1-11,13-15H,12,23H2,(H,25,27)/b7-4+,11-8+

(E)-N-(2-amino-4-fluorophenyl)-3-[1-[(E)-3-phenylprop-2-enyl]pyrazol-4-yl]prop-2-enamide

RGFP966; RGFP-966; 1396841-57-8; (E)-N-(2-amino-4-fluorophenyl)-3-(1-cinnamyl-1H-pyrazol-4-yl)acrylamide; RGFP 966; RGFP-966; (E,E)-RGFP966; CHEMBL4078477; RGFP 966

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30mg/mL

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配方 4 中的溶解度: 7.69 mg/mL (21.22 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。