Ro-3306

CDK1 (Ki = 20 nM); CDK1/cyclinB1 (Ki = 35 nM); CDK1/cyclin A (Ki = 110 nM); CDK2/cyclinE (Ki = 340 nM); PKCδ (Ki = 318 nM); SGK (Ki = 497 nM); ERK (Ki = 1980 nM)

体外活性：Ro-3306 还抑制 CDK1/细胞周期蛋白 A 复合物，Ki 为 110 nM。与该模型完全一致，用 RO-3306 处理增殖的人类癌细胞（HCT116、SW480 和 HeLa）20 小时，导致细胞周期完全阻断在 G2/M 期。用 RO-3306 处理生长中的 AML 细胞，以剂量和时间依赖性方式诱导 G2/M 期细胞周期停滞和凋亡。 RO-3306 与 Nutlin-3 协同作用，以不依赖于细胞周期的方式诱导线粒体凋亡。 RO-3306 下调抗凋亡蛋白 Bcl-2 和生存素的表达，并阻断 p53 介导的 p21 和 MDM2 诱导。 RO-3306 的 GV 阻滞效应是可逆的：当 RO-3306 阻滞的 COC 在不存在 RO-3306 的情况下培养 24 小时时，76.19 ± 2.68% 的卵母细胞在体外成熟 44 小时后达到 MII 阶段，与未经处理的对照卵母细胞的比率相似 (79.08 ± 3.23%)。此外，转移到无药物培养基中的 RO-3306 处理的卵母细胞在单性生殖激活后的卵裂和囊胚形成方面与对照没有显着差异 (P>0.05)。激酶测定：通过 96 孔形式的均相时间分辨荧光测定来测量 CDK1/细胞周期蛋白 B1、CDK1/细胞周期蛋白 A、CDK2/细胞周期蛋白 E 和 CDK4/细胞周期蛋白 D 的活性。测定缓冲液含有 25 mM Hepes、6.25 mM MgCl2、0.003% Tween 20、0.3 mg/ml BSA、1.5 mM DTT 和 ATP，如下：162 μM (CDK1)、90 μM (CDK2) 或 135 μM (CDK4) 。 CDK1 和 CDK2 缓冲液含有 10 mM MgCl2。将测试化合物在 20 μl 测定缓冲液中稀释至其最终浓度的 3 倍，并通过添加含有 pRB 底物 (0.185 μM) 的 40 μl 测定缓冲液开始反应。将板在 37°C 下持续搅拌孵育 30 分钟，并通过添加 15 μl 1.6 μM 抗磷酸 pRB 抗体（Ser-780；Cell Signaling Technology, Beverly, MA）的 25 mM 溶液终止反应。 Hepes/24 mM EDTA/0.2 mg/ml BSA。再振荡孵育 30 分钟后，加入 15 μl 3 nM Lance-Eu-W1024 标记的抗兔 IgG 和 60 nM Alophycocyanin 缀合的抗 His-6 抗体（PerkinElmer Life Sciences）于 25 mM Hepes/0.5 mg 中添加/ml BSA并孵育1小时。板在 Victor-V 多标记读数器（PerkinElmer Life Sciences）中在激发波长 340 nm 和发射波长 615 nm 和 665 nm 下读取。 IC50 值根据 665 nm 处的读数计算得出，并针对 615 nm 处的铕读数进行归一化。 Ki 值根据以下公式计算：Ki = IC50/(1 + S/Km)，其中 S 是测定中的 ATP 浓度，Km 是 ATP 的 Michaelis-Menten 常数。细胞测定 [1]：本研究中使用的所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州），并在补充有 10% 热灭活胎牛血清 (Invitrogen) 的推荐培养基中、在 5 ℃ 的潮湿环境中生长。 %二氧化碳。将药物溶解在 DMSO 中并作为 10 mM 储备溶液保存在 20°C。为了进行细胞周期分析，106 个细胞在 75 cm2 组织培养瓶中生长。细胞测定：在活力测定中，RO-3306 引起 AZ12253801 剂量反应曲线向左显着移动，GI50 降低 2.4 倍，与 RAD51 耗尽或抑制相当。 AZ12253801 浓度低于 50nM 时，致敏作用更为显着，GI80 降低了 13 倍。与 RAD51 敲低的平行效应一样，RO-3306 不影响 PC3 或 LNCaP 细胞的 AZ12253801 敏感性，但确实使 22Rv1 细胞敏感。

RO-3306 是一种 ATP 竞争性、选择性 CDK1 抑制剂。

CDK 测定中使用从 Hi5 昆虫细胞表达并分离的重组人 CDK/细胞周期蛋白复合物（CDK1/细胞周期蛋白 B1、CDK1/细胞周期蛋白 A、CDK2/细胞周期蛋白 E 和 CDK4/细胞周期蛋白 D）。该测定利用 GST-细胞周期蛋白 B1、CDK1、GST-细胞周期蛋白-E、CDK2、GST-CDK4 和细胞周期蛋白 D。GST 标记的蛋白与它们的伙伴一起以复合物的形式共表达和纯化。 pRB 的 His-6 标记部分（氨基酸 385-928）用作所有测定中的底物。从构建体中表达蛋白质。该蛋白在 M15 大肠杆菌细胞中表达，与镍螯合的琼脂糖柱结合，用 1 mM 咪唑预处理，然后用 500 mM 咪唑洗脱。经过等分处理并在 pH 7/6.25 mM MgCl₂/1.5 mM DTT 下针对 20 mM Hepes 进行透析后，洗脱的蛋白质保持在 -80°C。

在 96 孔板中，接种对数期细胞 (25,000)，并将 CO2 添加到 37°C 的培养箱中。为了确定达到 50% 生长抑制 (IC50) 所需的药物浓度，24 小时后给予不同剂量的 RO-3306。将 MTT（20 μL，5 mg/mL 生理盐水储备液）添加至每孔后，将细胞孵育 4 小时。除去上清液后，使用 200 μL 无水 DMSO 溶解活细胞中的甲臜晶体。 565 nm 是使用 550 型酶标仪测量吸光度的波长。

Female BALB/c mice
1.5 mg/kg
i.n.

[1]. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jul 11;103(28):10660-5.

[2]. Cyclin-dependent kinase 1 inhibitor RO-3306 enhances p53-mediated Bax activation and mitochondrial apoptosis in AML. Cancer Sci. 2009 Jun;100(6):1128-36.

[3]. A specific inhibitor of CDK1, RO-3306, reversibly arrests meiosis during in vitro maturation of porcine oocytes. Anim Reprod Sci. 2014 Jan 30;144(3-4):102-8.

C18H13N3OS2

351.45

351.049

C, 61.52; H, 3.73; N, 11.96; O, 4.55; S, 18.24

872573-93-8

135400873

Yellow to brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

569.1±60.0 °C at 760 mmHg

298.0±32.9 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.746

3.24

111.38

1

5

3

24

548

0

C(=C1/C(=O)N=C(NCC2SC=CC=2)S/1)\C1C=CC2N=CC=CC=2C=1

XOLMRFUGOINFDQ-YBEGLDIGSA-N

InChI=1S/C18H13N3OS2/c22-17-16(24-18(21-17)20-11-14-4-2-8-23-14)10-12-5-6-15-13(9-12)3-1-7-19-15/h1-10H,11H2,(H,20,21,22)/b16-10-

(5Z)-5-(quinolin-6-ylmethylidene)-2-(thiophen-2-ylmethylimino)-1,3-thiazolidin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (4.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (4.75 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 5 mg/mL (14.23 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。