Ro20-1724

Phosphodiesterase (PDE4/PDE IV) (Ki = 1930 nM)

介绍了camp特异性磷酸二酯酶（PDE IV）抑制剂的合成及生物学评价。以PDE IV抑制剂4-（3-丁氧基-4-甲氧基苄基）咪唑烷酮-2- 1 （Ro 20- 1724,2）为模板，设计了一组模拟Ro 20-1724但羰基取向不同的刚性恶唑烷酮、咪唑烷酮和吡咯烷酮。在酶抑制实验和细胞实验中，这些杂环的内切异构体比外切异构体更有效，细胞实验测量了活化的人外周血单核细胞（HPBM）的TNF α分泌。咪唑烷酮4a抑制人PDE IV的Ki值为27 nM，抑制HPBM分泌TNF α的IC50值为290 nM。相比之下，Ro 20-1724在这些实验中的活性明显较低，分别为1930和1800nM。［1］

在白化 Wistar 阶段和 200-250 g 成人（3-5 个月大）中，Ro 20-1724（125、250 和 500 μg/kg；腹腔注射；首次注射链脲佐菌素后 21 天）可显着降低认知障碍和氧化应激-链脲佐菌素诱导中的电路[2]。

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环核苷酸即cGMP和cAMP在学习和记忆过程中起着重要作用。据报道，通过抑制磷酸二酯酶（PDEs）来增强环核苷酸信号传导对几种与认知能力下降相关的神经退行性疾病有益。本研究旨在探讨RO-20-1724-a PDE4抑制剂对链脲佐菌素（STZ）诱导的实验性散发性阿尔茨海默氏型痴呆的影响。大鼠隔天（第1天和第3天）两次脑内注射STZ （3 mg/kg i.c.v）。STZ注射大鼠第一次灌胃后分别给予RO-20-1724(125、250和500 μg/kgi.p) 21 d。采用被动回避法[PA（第14和15天）]和Morris水迷宫法[MWM（第17、18、19、20和21天）]评估大鼠第一次灌胃STZ后的学习和记忆能力。第22天，用大鼠脑匀浆进行所有生化评价。RO-20-1724对PDE4的药理抑制显著减轻STZ诱导的认知缺陷和氧化应激。发现RO-20-1724不仅能改善MWM和PA模式下的学习和记忆，还能恢复STZ诱导的胆碱酯酶活性升高。此外，RO-20-1724显著降低丙二醛和亚硝酸盐水平，恢复谷胱甘肽水平，表明氧化应激的衰减。目前的数据补充了先前的研究，为PDE4抑制后的认知增强作用提供了证据。所观察到的RO-20-1724对空间记忆的有益作用可能是由于其恢复胆碱能功能的能力，可能是通过其抗氧化机制。［2］

测定乙酰胆碱酯酶活性[2]
脑内乙酰胆碱酯酶活性的定量测定参照Ellman et al.（1961）的方法。实验混合物中含有0.05 ml上清，3 ml 0.01 M磷酸钠缓冲液（pH 8）， 0.10 ml乙酰硫代胆碱碘化和0.10 ml DTNB。在412 nm处立即测定吸光度的变化。上清液中乙酰胆碱酯酶活性以nmol / mg蛋白表示。

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丙二醛（MDA） [2]
的估计 根据Wills（1996）的方法定量测定脑匀浆中脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）的含量。与硫代巴比妥酸反应后，用分光光度计在532 nm处测定MDA的含量。MDA浓度由标准曲线测定，以nmol / mg蛋白表示。

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蛋白羰基测定[2]
蛋白质羰基含量的测定是最常用、最可靠的方法，即羰基与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成2,4-二硝基苯腙（Levine et al., 1990）。在这种方法中，从脑匀浆中取0.1 ml上清与0.5 ml 10 mM DNPH孵育60分钟。随后，用20%三氯乙酸从溶液中沉淀蛋白质。用乙酸乙酯：乙醇（1:1 vv−1）混合物离心（3400 × g）后洗涤三次，以去除过量的DNPH。将最终的蛋白颗粒溶解在2.5 ml的6m盐酸胍中。用分光光度计在360 nm处记录吸光度。蛋白质羰基水平表示为nmol羰基mg−1蛋白，摩尔消光系数为22 × 104 M−1 cm−1。

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估算亚硝酸盐[2]
根据Green等人（1982）的描述，使用Greiss试剂（0.1% N-（1-萘基）二盐酸乙二胺，1%磺胺和2.5%磷酸）进行比色测定，上清中亚硝酸盐的积累是一氧化氮（NO）产生的指标。取等体积的上清液与Greiss试剂混合，室温暗箱孵育10min，分光光度法测定540nm吸光度。上清液中亚硝酸盐浓度由亚硝酸钠标准曲线测定，以μmol / mg蛋白表示。

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估计谷胱甘肽[2]
脑内还原性谷胱甘肽根据Ellman（1959）描述的方法进行估算。用1 ml 4%磺基水杨酸沉淀1 ml上清液，4℃冷消化1 h， 1200 × g离心15 min。在1 ml上清液中加入2.7 ml磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 8）和0.2 ml 5,5′-二硫比斯-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）。用分光光度计在412纳米处立即测量出所形成的黄色。用标准曲线测定上清液中谷胱甘肽的浓度，以μmol / mg蛋白表示。

实验步骤和药物给药[2]
大鼠用氯胺酮（100 mg/kg，腹腔注射）和赛拉嗪（5 mg/kg，腹腔注射）麻醉。将麻醉后的大鼠头部固定于立体定位仪上，并在头皮上做正中矢状切口。在颅骨上钻两个孔，用于将注射套管置入侧脑室，坐标如下：前囟后方0.8 mm；矢状缝外侧1.5 mm；脑表面下方3.6 mm（Paxinos和Watson，1986）。将插管后的大鼠随机分为若干组，每组n = 8。 STZ [3 mg/kg 脑室内注射 (1 μl/min)] 在给药前溶于柠檬酸缓冲液 [3 mg/ml (pH 4.4)] 中，隔天（第 1 天和第 3 天）通过套管使用 Hamilton 微量注射器向大鼠脑室内注射两次，每次 5 μl，分别注入两侧脑室（双侧）（Deshmukh 等，2009；Sharma 等，2010）。从第 1 天开始，STZ 注射大鼠在首次脑室内注射 STZ 后，连续 21 天分别接受赋形剂 [DMSO:生理盐水 10:90/2 ml/kg 腹腔注射，柠檬酸缓冲液用于脑室内注射，每组 n = 8] 或 Ro 20-1724 (125、250 和 500 μg/kg 腹腔注射) 治疗。 STZ 和 Ro 20-1724 的溶剂均给予同一组动物，作为双重溶剂对照。本研究中使用的剂量参考了之前的报道（Halene 和 Siegel，2008）。此外，Ro 20-1724 [500 μg/kg 腹腔注射，单独给药] 也已在未注射 STZ 的情况下，连续 21 天给予正常（已插管）大鼠。

[1]. Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)imidazolidin-2-one (Ro 20-1724) as potent inhibitors of cAMP-specific phosphodiesterase. J Med Chem. 1995;38(24):4848-4854.

[2]. Neuroprotective effect of RO-20-1724-a phosphodiesterase4 inhibitor against intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive deficit and oxidative stress in rats. Pharmacol Biochem Behav. 2012;101(2):239-245.

4-[(3-丁氧基-4-甲氧基苯基)甲基]-2-咪唑烷酮属于甲氧基苯类化合物。
磷酸二酯酶抑制剂。

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与罗利普兰相比，关于RO-20-1724在中枢神经系统疾病方面的研究较少。少数研究表明RO-20-1724具有抗抑郁样作用，但其效力低于罗利普兰（Wachtel，1983）。RO-20-1724对认知功能的潜在影响此前尚未被研究。本研究揭示了RO-20-1724对脑室内注射链脲佐菌素（STZ）诱导的认知功能障碍和氧化应激具有显著的认知增强作用。与我们之前的报道（Deshmukh等，2009；Sharma等，2010）一致，本研究发现，双侧脑室内注射链脲佐菌素（STZ）会导致大鼠空间学习和记忆能力显著下降，表现为莫里斯水迷宫和被动回避任务的习得和保持能力受损。运动活性的变化被认为可以调节被动回避和莫里斯水迷宫范式中的学习和记忆（Sharma和Gupta，2003；Deshmukh等，2009；Sharma等，2010）。然而，本研究中所有实验组的自发运动活性均未观察到显著差异。这排除了运动活性本身可能导致载体处理组和RO-20-1724处理组STZ大鼠被动回避和莫里斯水迷宫任务表现改变的可能性。在习得阶段，STZ大鼠的逃避潜伏期逐渐缩短。然而，与载体对照组相比，STZ注射组大鼠在第25、26和27天到达水下平台所需时间显著延长（图3A）。被动回避学习也观察到类似结果，STZ注射组大鼠在第15天的记忆保持潜伏期缩短（图2）[2]。相反，在STZ大鼠中，使用RO-20-1724进行PDE4的药理学抑制可显著减轻STZ诱导的认知缺陷。在STZ大鼠中长期给予RO-20-1724可显著提高两项任务的认知表现，且呈剂量依赖性。在第28天进行的水迷宫探针测试中（图3B），STZ大鼠在目标象限停留的时间较短；在被动回避记忆保持试验中，STZ注射组大鼠的平均记忆保持潜伏期缩短，表明其记忆巩固能力较差。然而，在链脲佐菌素（STZ）注射的大鼠中，RO-20-1724治疗显著改善了记忆巩固，表现为在目标象限停留时间的增加。据报道，亚慢性给予正常大鼠罗利普兰（rolipram）本身可以改善学习和记忆（Rutten等，2008）。然而，本研究并未观察到RO-20-1724本身具有这种作用。本研究中未观察到RO-20-1724本身的作用可能与剂量相关。本研究采用莫里斯水迷宫（MWM）作为外感受模型来评估空间学习和记忆（Morris，1984）。最重要的是，空间学习（尤其是MWM表现）似乎依赖于构成功能整合神经网络的不同脑区的协调作用（Hooge和Deyn，2001）。而被动回避学习（PAL）是指为了避免惩罚而学习抑制某种行为。海马和杏仁核都被认为参与恐惧条件反射（被动回避）。这些脑区主要参与胆碱能传递，在学习和记忆加工中发挥着至关重要的作用，并且似乎更容易受到氧化损伤（Arendt，2001；Hartman等，2005；Pratico和Delanty，2000）[2]。在本研究中，我们发现大鼠脑内注射链脲佐菌素（STZ）后乙酰胆碱酯酶活性升高，这与之前的报道一致（Deshmukh等，2009）。然而，用RO-20-1724治疗STZ大鼠能够显著恢复乙酰胆碱酯酶活性（图5）。这些结果表明，RO-20-1724对PDE4的药理学抑制可能通过改善胆碱能功能来提高STZ注射大鼠的记忆力。尽管目前尚无关于 RO-20-1724 对胆碱能功能影响的报道，但已有研究报道 PDE4 抑制剂 (PDE4-Is) 可促进胆碱能活性 (Egawa et al., 1997)。RO-20-1724 与研究广泛的 PDE4-I 罗利普兰 (rolipram) 类似，可抑制 PDE4 酶；它能增强 cAMP 介导的信号传导强度和持续时间 (Scuvee-Moreau et al., 1987)。事实上，已有研究报道，给予 cAMP 类似物也能促进胆碱能神经元的活性并增强乙酰胆碱反应 (Fu, 1993; Nakamura et al., 1994)。此外，在多项空间记忆任务（例如，水迷宫和放射臂迷宫）中，PDE4抑制剂不仅能改善正常大鼠和小鼠的空间记忆（Bach等，1999），还能改善因年龄增长或微球栓塞诱导的脑缺血而导致空间记忆受损的大鼠的空间记忆（Nagakura等，2002）。此外，PDE4抑制剂还能改善东莨菪碱处理大鼠的被动回避学习能力（Egawa等，1997）。此外，据报道，PDE抑制剂可通过提高cAMP和/或cGMP水平来调节细胞信号传导过程，最终通过激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号通路促进基因转录（Impey等，1996；Lu等，1999）。此外，cGMP/PKG/CREB 和 cAMP/PKA/CREB 通路均被认为在 PDE 抑制剂的认知增强作用中发挥重要作用（Prickaerts 等，2004；Blokland 等，2006；Rutten 等，2007）。越来越多的证据支持活性氧及其参与记忆障碍氧化途径的观点（Bruce-Keller 等，1998）。与之前的研究一致，链脲佐菌素（STZ）诱导的认知缺陷也被发现与氧化-硝化应激和胆碱能缺陷有关（Sharma 和 Gupta，2001；Deshmukh 等，2009；Sharma 等，2010）。大分子（脂质、蛋白质和核酸等）的氧化损伤被认为是加速衰老和年龄相关神经退行性疾病的重要因素（Wickens，2001）。本研究中，链脲佐菌素（STZ）注射到大鼠体内可导致膜脂质和蛋白质过氧化，表现为丙二醛水平和蛋白质羰基化程度显著升高。此外，STZ还导致亚硝酸盐水平显著升高和谷胱甘肽水平显著降低，表明氧化-硝化应激增强（图6、图7、图8、图9）。本研究中，在STZ大鼠中，使用RO-20-1724进行PDE4药理学抑制，结果显示丙二醛、蛋白质羰基化和亚硝酸盐水平显著降低，且呈剂量依赖性，同时谷胱甘肽水平恢复正常。[2]
总之，本研究数据补充了以往的研究，为PDE4抑制后认知增强作用提供了证据。 RO-20-1724在空间记忆方面观察到的有益作用可能归因于其恢复胆碱能功能的能力，也可能与其抗氧化机制有关。尽管STZ损害记忆的分子机制尚待阐明，但STZ可能干扰参与突触可塑性的关键蛋白激酶细胞内信号通路，包括cAMP/PKA/CREB通路。因此，RO-20-1724对环核苷酸信号的有利调节也可能对其观察到的有益作用有所贡献。

C15H22N2O3

278.35

278.163

C, 64.73; H, 7.97; N, 10.06; O, 17.24

29925-17-5

5087

White to off-white solid powder

1.099 g/cm3

483.8ºC at 760 mmHg

246.4ºC

1.62E-09mmHg at 25°C

1.521

2.755

59.59

2

3

7

20

312

0

PDMUULPVBYQBBK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H22N2O3/c1-3-4-7-20-14-9-11(5-6-13(14)19-2)8-12-10-16-15(18)17-12/h5-6,9,12H,3-4,7-8,10H2,1-2H3,(H2,16,17,18)

4-[(3-butoxy-4-methoxyphenyl)methyl]imidazolidin-2-one

Ro-20-1724 Ro 20-1724 Ro20-1724

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~179.63 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。