Ro20-1724

Phosphodiesterase (PDE4/PDE IV) (Ki = 1930 nM)
Ro20-1724 targets phosphodiesterase 4 (PDE4), an enzyme that catalyzes the hydrolysis of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) to AMP. By inhibiting PDE4, Ro20-1724 increases intracellular cAMP levels, which activates protein kinase A (PKA) and leads to the suppression of pro-inflammatory cytokine production in immune cells. It is a selective inhibitor with activity against PDE4 isoforms A and B.

本文描述了cAMP特异性磷酸二酯酶（PDE IV）抑制剂的合成和生物学评价。以PDE IV抑制剂4-(3-丁氧基-4-甲氧基苄基)咪唑烷-2-酮（Ro 20-1724，2）为模板，设计了一系列刚性噁唑烷酮、咪唑烷酮和吡咯烷酮类化合物，这些化合物与Ro 20-1724结构相似，但羰基的取向不同。在酶抑制试验和细胞试验（检测活化的人外周血单核细胞（HPBM）分泌TNF-α）中，这些杂环化合物的内型异构体均比外型异构体活性更强。咪唑烷酮4a对人PDE IV的抑制Ki值为27 nM，对HPBM分泌TNF-α的抑制IC50值为290 nM。相比之下，Ro 20-1724 在这些检测中的活性显著降低，其活性分别为 1930 nM 和 1800 nM。[1]
体外实验表明，Ro20-1724 是一种强效且选择性的 cAMP 磷酸二酯酶抑制剂。它对 PDE4B 的 IC50 值为 1.9 µM，对 PDE4A 的 IC50 值为 0.25 µM。通过抑制 PDE4，它可以提高细胞内 cAMP 水平并抑制促炎细胞因子的产生。使用纯化的 PDE4 同工酶进行的酶活性测定证实了其活性。

在白化Wistar小鼠和200-250克成年小鼠（3-5月龄）中，Ro 20-1724（125、250和500 μg/kg；腹腔注射；首次脑室内注射链脲佐菌素后21天）显著降低了链脲佐菌素诱导的认知障碍和氧化短路[2]。环核苷酸，如cGMP和cAMP，已知在学习和记忆过程中发挥重要作用。据报道，通过抑制磷酸二酯酶（PDE）增强环核苷酸信号传导对多种与认知功能下降相关的神经退行性疾病有益。本研究旨在探讨PDE4抑制剂RO-20-1724对链脲佐菌素（STZ）诱导的散发性阿尔茨海默病型实验性痴呆的影响。在小鼠中，隔天（第1天和第3天）脑室内注射两次链脲佐菌素（STZ，3 mg/kg）。首次脑室内注射STZ后，对注射STZ的小鼠进行RO-20-1724（125、250和500 μg/kg，腹腔注射）治疗，持续21天。首次脑室内注射STZ后，通过被动回避实验[PA（第14和15天）]和莫里斯水迷宫实验[MWM（第17、18、19、20和21天）]评估小鼠的学习和记忆能力。第22天，取小鼠脑匀浆进行所有生化指标的测定。RO-20-1724对PDE4的药理学抑制作用显著减轻了STZ诱导的认知功能障碍和氧化应激。研究发现，RO-20-1724 不仅能改善 MWM 和 PA 范式中的学习和记忆能力，还能恢复 STZ 诱导的胆碱酯酶活性升高。此外，RO-20-1724 显著降低了丙二醛和亚硝酸盐水平，并恢复了谷胱甘肽水平，表明其能减轻氧化应激。目前的数据补充了之前的研究，为 PDE4 抑制剂后认知增强效应提供了证据。RO-20-1724 在空间记忆方面的有益作用可能归因于其恢复胆碱能功能的能力，也可能与其抗氧化机制有关。[2]
在体内，RO-20-1724 已被用于研究 PDE4 在炎症和免疫反应中的作用。动物模型已证实其能够提高 cAMP 水平并抑制炎症。然而，具体的体内疗效数据仍然有限。

乙酰胆碱酯酶活性测定[2]
脑组织中乙酰胆碱酯酶活性的定量测定按照Ellman等人(1961)描述的方法进行。测定混合物包含0.05 ml上清液、3 ml 0.01 M磷酸钠缓冲液（pH 8）、0.10 ml碘化乙酰硫代胆碱和0.10 ml DTNB。立即用分光光度计在412 nm处测定吸光度的变化。上清液中的乙酰胆碱酯酶活性以每毫克蛋白质的nmol数表示。

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丙二醛(MDA)测定[2]
脑匀浆中丙二醛(MDA)（脂质过氧化的最终产物）的定量测定按照Wills(1996)的方法进行。 MDA 与硫代巴比妥酸反应后，使用分光光度计在 532 nm 处测定其含量。MDA 浓度根据标准曲线确定，并以每毫克蛋白质的纳摩尔数表示。

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蛋白质羰基测定[2]
蛋白质羰基含量采用最常用且可靠的方法测定，该方法基于羰基与 2,4-二硝基苯肼 (DNPH) 反应生成 2,4-二硝基苯腙 (Levine 等，1990)。在该方法中，将 0.1 ml 脑匀浆上清液与 0.5 ml 10 mM DNPH 孵育 60 分钟。随后，用 20% 三氯乙酸沉淀蛋白质。离心 (3400 × g) 后，用乙酸乙酯：乙醇 (1:1 v/v) 混合液洗涤沉淀三次，以去除过量的 DNPH。将最终的蛋白质沉淀物溶解于 2.5 ml 6 M 盐酸胍溶液中。使用分光光度计在 360 nm 波长处记录吸光度。蛋白质羰基水平以 nmol 羰基/mg 蛋白质表示，摩尔消光系数为 22 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹。

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亚硝酸盐的测定[2]
上清液中亚硝酸盐的积累量是生成一氧化氮 (NO) 的指标，采用比色法测定，使用 Greiss 试剂（0.1% N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐、1% 磺胺和 2.5% 磷酸），方法参照 Green 等人 (1982) 的描述。将等体积的上清液和 Greiss 试剂混合，在室温下避光孵育 10 分钟，然后用分光光度计在 540 nm 波长处测定吸光度。上清液中亚硝酸盐的浓度根据亚硝酸钠标准曲线测定，并以每毫克蛋白质的μmol数表示。

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谷胱甘肽的测定[2]
脑组织中还原型谷胱甘肽的测定采用Ellman（1959）描述的方法。取1毫升上清液，加入1毫升4%磺基水杨酸沉淀，于4℃冷消化1小时。样品以1200×g离心15分钟。取1毫升上清液，加入2.7毫升磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 8）和0.2毫升5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）。立即用分光光度计在412 nm处测定生成的黄色吸光度。上清液中谷胱甘肽的浓度通过标准曲线测定，并以每毫克蛋白的μmol数表示。
Ro20-1724的无细胞活性测定用于检测其对PDE4酶活性的抑制作用。将纯化的PDE4同工酶与cAMP底物和不同浓度的Ro20-1724孵育，并测定cAMP水解速率。PDE4活性抑制的IC50值通过剂量反应曲线确定。

Ro20-1724 的细胞活性检测采用免疫细胞，例如巨噬细胞或淋巴细胞。细胞用不同浓度的 Ro20-1724 处理，并用炎症因子刺激。细胞内 cAMP 水平通过 ELISA 法测定。细胞因子生成通过 ELISA 或定量 PCR 法测定。

实验步骤和药物给药[2]
大鼠用氯胺酮（100 mg/kg，腹腔注射）和赛拉嗪（5 mg/kg，腹腔注射）麻醉。将麻醉后的大鼠头部固定于立体定位仪上，并在头皮上做正中矢状切口。在颅骨上钻两个孔，用于将注射套管置入侧脑室，坐标如下：前囟后方0.8 mm；矢状缝外侧1.5 mm；脑表面下方3.6 mm（Paxinos和Watson，1986）。将插管后的大鼠随机分为若干组，每组n = 8。 STZ [3 mg/kg 脑室内注射 (1 μl/min)] 在给药前溶于柠檬酸缓冲液 [3 mg/ml (pH 4.4)] 中，隔天（第 1 天和第 3 天）通过套管使用 Hamilton 微量注射器向大鼠脑室内注射两次，每次 5 μl，分别注入两侧脑室（双侧）（Deshmukh 等，2009；Sharma 等，2010）。从第 1 天开始，STZ 注射大鼠在首次脑室内注射 STZ 后，连续 21 天分别接受赋形剂 [DMSO:生理盐水 10:90/2 ml/kg 腹腔注射，柠檬酸缓冲液用于脑室内注射，每组 n = 8] 或 Ro 20-1724 (125、250 和 500 μg/kg 腹腔注射) 治疗。 STZ 和 Ro 20-1724 的载体均给予同一组动物，作为双重载体对照。本研究中使用的剂量参考了之前的报道（Halene 和 Siegel，2008）。此外，Ro 20-1724 [500 μg/kg 腹腔注射，单独给药] 也已在未注射 STZ 的情况下，连续 21 天给予正常（插管）大鼠。Ro20-1724 的体内动物实验在炎症和免疫疾病模型中进行。动物通过口服或腹腔注射给予 Ro20-1724，并评估炎症标志物、疾病严重程度和免疫细胞功能。

Ro20-1724 的分子量为 335.40 g/mol，分子式为 C18H21N3O3。它是一种白色至类白色固体粉末。该化合物可溶于二甲基亚砜 (DMSO)，应在推荐条件下储存。其药代动力学特性表现为良好的口服生物利用度。

Ro20-1724 的毒理学特征尚未得到充分阐明。作为一种 PDE4 抑制剂，它可能引起胃肠道不适、恶心和头痛，这些都是此类药物常见的副作用。目前尚未有明显的毒性报告。尚缺乏全面的毒理学研究。

[1]. Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)imidazolidin-2-one (Ro 20-1724) as potent inhibitors of cAMP-specific phosphodiesterase. J Med Chem. 1995;38(24):4848-4854.

[2]. Neuroprotective effect of RO-20-1724-a phosphodiesterase4 inhibitor against intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive deficit and oxidative stress in rats. Pharmacol Biochem Behav. 2012;101(2):239-245.

4-[(3-丁氧基-4-甲氧基苯基)甲基]-2-咪唑烷酮属于甲氧基苯类化合物，是一种磷酸二酯酶抑制剂。与罗利普兰相比，关于RO-20-1724在中枢神经系统疾病方面的研究较少。一些研究表明，RO-20-1724具有抗抑郁样作用，但其效力低于罗利普兰（Wachtel，1983）。RO-20-1724对认知功能的潜在影响此前尚未被研究。本研究发现，RO-20-1724对脑室内注射链脲佐菌素（STZ）诱导的认知障碍和氧化应激具有显著的认知增强作用。与我们之前的报道（Deshmukh等，2009；Sharma等，2010）一致，本研究发现双侧脑室内注射链脲佐菌素（STZ）导致大鼠空间学习和记忆能力显著下降，表现为Morris水迷宫和被动回避任务的习得和保持受损。运动活动的改变被认为可以调节被动回避和Morris水迷宫范式中的学习和记忆（Sharma和Gupta，2003；Deshmukh等，2009；Sharma等，2010）。然而，本研究中所有实验组的自发运动活动均未观察到显著差异。这排除了运动活动本身可能导致载体处理组和RO-20-1724处理组STZ大鼠被动回避和Morris水迷宫任务表现改变的可能性。在学习阶段，STZ大鼠的逃避潜伏期逐渐缩短。然而，与载体对照组相比，STZ注射组大鼠在第25、26和27天到达水下平台所需时间显著延长（图3A）。被动回避学习也观察到类似结果，STZ注射组大鼠在第15天的记忆保持潜伏期缩短（图2）[2]。相反，在STZ大鼠中，使用RO-20-1724进行PDE4药理学抑制可显著减轻STZ诱导的认知缺陷。长期给予STZ大鼠RO-20-1724可剂量依赖性地显著改善其在两项任务中的认知表现。在第28天进行的水迷宫探针测试中（图3B），STZ大鼠在目标象限停留的时间较短；在被动回避记忆保持测试中，STZ注射组大鼠的平均记忆保持潜伏期较短，表明其记忆巩固能力较差。然而，在链脲佐菌素（STZ）注射的大鼠中，RO-20-1724治疗显著改善了记忆巩固，表现为在目标象限停留时间的增加。据报道，对正常大鼠进行亚慢性罗利普兰给药可改善学习和记忆（Rutten等，2008）。然而，本研究并未观察到RO-20-1724本身的这种作用。本研究中未观察到RO-20-1724本身的作用可能与剂量相关。本研究采用莫里斯水迷宫（MWM）作为外感觉模型来评估空间学习和记忆（Morris，1984）。最重要的是，空间学习（尤其是MWM表现）似乎依赖于构成功能整合神经网络的不同脑区的协调作用（Hooge和Deyn，2001）。被动回避学习（PAL）是指学习抑制某种行为以避免惩罚。海马和杏仁核均被认为参与恐惧条件反射（被动回避）。这些脑区主要参与胆碱能传递，在学习和记忆加工中发挥关键作用，并且似乎更容易受到氧化损伤（Arendt，2001；Hartman等，2005；Pratico和Delanty，2000）[2]。在本研究中，我们发现大鼠脑内注射链脲佐菌素（STZ）后，乙酰胆碱酯酶活性升高，这与之前的报道一致（Deshmukh等，2009）。然而，用RO-20-1724治疗STZ大鼠后，乙酰胆碱酯酶活性显著恢复（图5）。这些结果表明，RO-20-1724通过药理学抑制PDE4，可能通过改善胆碱能功能来改善STZ注射大鼠的记忆。尽管目前尚无关于RO-20-1724对胆碱能功能影响的报道，但已有研究表明PDE4抑制剂（PDE4-Is）可以促进胆碱能活性（Egawa等，1997）。RO-20-1724与研究广泛的PDE4-I罗利普兰类似，能够抑制PDE4酶，并增强cAMP介导的信号转导的强度和持续时间（Scuvee-Moreau等，1987）。事实上，已有研究表明，给予cAMP类似物也能促进胆碱能神经元的活性，并增强乙酰胆碱反应（Fu，1993；Nakamura等，1994）。此外，在多种空间记忆任务（例如水迷宫和放射臂迷宫）中，PDE4抑制剂不仅能改善正常大鼠和小鼠的空间记忆（Bach等，1999），还能改善因年龄相关性或微球诱导的脑缺血而导致空间记忆受损的大鼠的空间记忆（Nagakura等，2002）。此外，PDE4抑制剂还能改善东莨菪碱处理大鼠的被动回避学习能力（Egawa等，1997）。而且，据报道，PDE4抑制剂可通过提高cAMP和/或cGMP水平来调节细胞信号传导过程，最终通过激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号通路来促进基因转录（Impey等，1996；Lu等，1999）。此外，cGMP/PKG/CREB 和 cAMP/PKA/CREB 通路均被认为在磷酸二酯酶抑制剂的认知增强作用中发挥重要作用（Prickaerts 等，2004；Blokland 等，2006；Rutten 等，2007）。越来越多的证据支持活性氧（ROS）及其参与记忆障碍氧化通路的观点（Bruce-Keller 等，1998）。与之前的研究一致，链脲佐菌素（STZ）诱导的认知缺陷也被发现与氧化-硝化应激和胆碱能缺乏有关（Sharma 和 Gupta，2001；Deshmukh 等，2009；Sharma 等，2010）。大分子（脂质、蛋白质和核酸等）的氧化损伤被认为是加速衰老和年龄相关神经退行性疾病的重要因素（Wickens，2001）。本研究中，链脲佐菌素（STZ）注射到大鼠体内导致膜脂质和蛋白质过氧化，表现为丙二醛水平和蛋白质羰基化水平显著升高。此外，STZ还导致亚硝酸盐水平显著升高和谷胱甘肽水平显著降低，表明氧化-硝化应激增强（图6、7、8和9）。本研究在STZ大鼠中采用RO-20-1724进行PDE4的药理学抑制，结果显示丙二醛、蛋白质羰基化和亚硝酸盐水平呈剂量依赖性显著降低，而谷胱甘肽水平恢复正常。 [2] 总之，本研究的数据补充了以往的研究，并为PDE4抑制剂的认知增强作用提供了证据。RO-20-1724对空间记忆的有益作用可能归因于其恢复胆碱能功能的能力，也可能与其抗氧化机制有关。尽管STZ损害记忆的分子机制尚待阐明，但STZ可能干扰参与突触可塑性的关键蛋白激酶的细胞内信号通路，包括cAMP/PKA/CREB通路。因此，RO-20-1724对环核苷酸信号的有益调节也可能有助于其观察到的有益作用。
Ro20-1724是一种选择性PDE4抑制剂，用作研究PDE4在炎症和免疫反应中作用的实验化合物。它也被称为Ro 20-1724。它能提高细胞内cAMP水平并抑制促炎细胞因子的产生。目前尚未获准用于临床。

C15H22N2O3

278.35

278.163

C, 64.73; H, 7.97; N, 10.06; O, 17.24

29925-17-5

5087

White to off-white solid powder

1.099 g/cm3

483.8ºC at 760 mmHg

246.4ºC

1.62E-09mmHg at 25°C

1.521

2.755

59.59

2

3

7

20

312

0

PDMUULPVBYQBBK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H22N2O3/c1-3-4-7-20-14-9-11(5-6-13(14)19-2)8-12-10-16-15(18)17-12/h5-6,9,12H,3-4,7-8,10H2,1-2H3,(H2,16,17,18)

4-[(3-butoxy-4-methoxyphenyl)methyl]imidazolidin-2-one

Ro-20-1724 Ro 20-1724 Ro20-1724

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~179.63 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。