RON-IN-1 (SYN1143 )

RON (IC50 = 9 nM)

SYN1143（化合物 I）（10-1000 nM；1 小时）抑制 HT-29 和 BxPC3 细胞的功能活性和 c-Met 介导的信号传导[1]。
SYN1143（10-1000 nM；1 小时）抑制 NIH3T3 RON 和 BxPC3 细胞的 RON 介导的信号传导和功能活性[1]。
SYN1143（0.3-30 μM；2 小时或 3 d）抑制 MC3T3-E1 和 C3H10T1/2 细胞中的 c-Met 信号传导和细胞增殖[ 2].
SYN1143（0.3-2 μM；4-12 d）可增加前体细胞成骨分化[2]。

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化合物I/SYN1143抑制RON和c-Met的激酶活性。[1]
化合物I的结构如图1A所示。体外激酶实验表明，化合物I是人RON和c-Met的有效抑制剂，ic50分别为9和4 nmol/L。为了确定其选择性，化合物1对一组酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶进行了测试。化合物1对Lck、Tie2、Src和BTK具有较弱的抑制活性，ic50值在160 ~ 710 μmol/L之间（图1B），对其他所有被测激酶的ic50值为> μmol/L(>20个激酶；图1 b;数据未显示)。这些数据表明化合物I是RON和c-Met的选择性抑制剂。

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化合物I/SYN1143抑制c- met介导的信号传导和功能活性。[1]
为了证实其对c-Met的活性，我们评估了化合物1抑制hgf介导的c-Met磷酸化和下游信号传导的能力。在这些研究中使用了HT-29和BxPC3细胞，因为它们都表达c-Met和RON（图4A）。在这两种细胞系中，外源性HGF刺激c-Met磷酸化和下游信号传导，Gab1、ERK1/2和AKT的磷酸化证明了这一点（图2A）。化合物I以剂量依赖的方式抑制hgf介导的c-Met磷酸化和下游信号传导。此外，化合物1在两种细胞系中抑制c-Met磷酸化的效力相似（图2A）。

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化合物I/SYN1143抑制ron介导的信号传导和功能活性。[1]
由于化合物I也抑制RON激酶活性，我们评估了其阻断msp介导的信号传导的能力。由于市场上可买到的phospho-RON抗体都不能通过Western blotting识别合适的分子量带（数据未显示），我们采用免疫沉淀法来测试化合物I对msp诱导的NIH3T3 RON或BxPC3细胞中RON磷酸化的影响。用抗磷酸酪氨酸4G10抗体从MSP和/或化合物I处理的细胞裂解物中免疫沉淀Phospho-RON。然后使用针对受体COOH末端的抗体进行Western blotting检测RON。我们发现化合物I在两种细胞系中都以剂量依赖的方式抑制RON磷酸化（图3A和B，顶部）。然后，我们在NIH3T3 RON细胞或BxPC3中测试了MSP和/或化合物I对下游信号的影响，包括Gab1、ERK1/2和AKT的磷酸化。外源性MSP处理导致NIH3T3 RON细胞中Gab1、AKT和ERK1/2的强烈磷酸化（图3A），而MSP处理导致Gab1的磷酸化较弱，对BxPC3细胞中AKT和ERK1/2的磷酸化几乎没有影响（图3B）。由于MSP的唯一已知受体是RON，因此可以合理地推断，Gab1、AKT和ERK1/2的激活是由RON介导的。化合物1在NIH3T3 RON细胞中以剂量依赖性的方式抑制msp诱导的Gab1、ERK1/2和AKT的磷酸化（图3A），在BxPC3细胞中抑制msp介导的Gab1磷酸化（图3B）。与HGF/c-Met信号传导相比（图2A）， MSP/RON信号传导在BxPC3细胞中较弱，对ERK1/2和AKT磷酸化的影响较小（图3B）

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c-Met特异性小分子激酶抑制剂SYN1143和SGX523体外抑制c-Met信号传导和细胞增殖[2]
c-Met化学抑制剂促进前体细胞矿化[2]
我们接下来研究了c-Met抑制剂对前体细胞成骨分化的影响。MC3T3-E1细胞用成骨培养基处理，c-Met抑制剂存在或不存在，浓度为0.3-2 μM)。通过分析MC3T3-E1细胞早期标志物ALP的活性来确定c-Met抑制剂对成骨细胞分化的影响。有趣的是，c-Met抑制剂SYN1143在浓度为1 μM时显著增加ALP活性。SYN1143诱导的ALP活性与BMP2诱导的ALP活性相当（图2A）。细胞外基质矿化是骨形成过程中最重要的过程。基于茜素红染色（AR-S），在相同条件下，c-Met抑制剂SYN1143显著增加矿化（图2A， 2B）。c-Met抑制剂SGX523在低浓度下也具有促进成骨分化的能力（图2A， 2B）。与上述发现一致，c-Met抑制剂还增加了编码骨形成过程中最重要的骨基质蛋白含量的Col1a1、ALP和BSP基因的表达水平（Alford et al., 2015）（图2 - 2e）。在C3H10T1/2细胞中也观察到类似的效果，尽管c-Met抑制剂促进C3H10T1/2细胞成骨分化的能力低于MC3T3-E1细胞（图2F， 2G）。这些结果表明c-Met抑制剂SYN1143和SGX523可能促进前体细胞的成骨分化。

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SYN1143或sgx523介导的c-Met抑制通过独立于Erk-Smad的途径增加Runx2 [2]
据报道，HGF可以通过阻止hMSCs和C2C12细胞中Smads的活性磷酸化来抑制BMP2信号通路（Standal et al., 2007）。为了了解c-Met抑制剂调节成骨细胞分化的机制，我们首先检查了c-Met抑制剂对bmp - smad信号活性的影响。在非成骨和成骨诱导条件下，用SYN1143或SGX523治疗并没有显著影响Smads磷酸化活性形式的水平（Smad1的Ser463/465和Smad5的Ser463/465的磷酸化）（图3A， 3B）。据报道，抑制Smad1功能的磷酸化，包括Smad1连接区域Ser206的磷酸化，可以由Erk1/2激活（Kretzschmar等人，1997，Sapkota等人，2007）和HGF激活Ras-Erk1/2途径（Schlessinger, 2004， Yu等人，2001）引起。然而，c-Met抑制剂不影响MC3T3-E1细胞中的Erk1/2或Smad1 Ser206磷酸化（图3B）。这些数据表明c-Met抑制剂可以通过独立于Erk1/2-Smad的途径促进成骨细胞分化。

SYN1143（10-100 mg/kg；口服 22 d）可抑制表达 RON 的肿瘤的生长，这些肿瘤具有持续活性和 c-Met 依赖性[1]。
SYN1143（20-50 μg；转移到颅骨缺损中） ）促进小鼠颅骨临界尺寸缺损中新骨的生长[2]。

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化合物I/SYN1143抑制c- met依赖性和组成型活性ron表达肿瘤的生长。[1]
尽管已经确定了依赖于c-Met活性的细胞系模型，但很少有（如果有的话）已知RON的等效模型。c-Met、RON的表达，甚至它们的共表达，并不一定意味着肿瘤生长依赖于这些途径。我们的目标是鉴定依赖c-Met或表达组成活性形式的RON的模型，以研究化合物I 的体内抗肿瘤活性 化合物I/SYN1143在两种c- met依赖的异种移植模型中进行评估：U-87 MG和NIH3T3 TPR-Met。这两种模型都依赖于c-Met活性。此外，它们都缺乏RON表达（图4A），排除了通过阻断RON活性介导肿瘤生长抑制的可能性。 [1]

与对照动物相比，每天1次用化合物I/SYN1143治疗NIH3T3 TPR-Met荷瘤小鼠，可产生剂量依赖性的肿瘤生长抑制（图5A）。化合物1在30或100 mg/kg 1次/ d或30 mg/kg 2次/ d剂量下显著抑制肿瘤生长（P < 0.02）。此外，在100mg /kg每日一次的剂量下观察到完全的肿瘤生长抑制。使用化合物I治疗对体重没有不良影响（数据未显示）。为了证实肿瘤生长抑制是由于c-Met活性的抑制而发生的，我们用100 mg/kg的单剂量化合物I治疗NIH3T3 TPR-Met肿瘤小鼠。在给药后的不同时间从小鼠身上摘取肿瘤，分析TPR-Met和Gab1的磷酸化。与未治疗小鼠的肿瘤相比，TPR-Met和Gab1的磷酸化水平在12小时内显著降低，24小时后恢复到接近基础水平（图5B）。从图5A和B所示的实验中评估了化合物I在小鼠血浆中的水平。在两项研究中，以100 mg/kg处理的小鼠在12小时内具有高浓度的化合物I，但在24小时时浓度显著降低(图5C；数据未显示)。这些数据表明，phospho-Gab1和phospho-Met抑制与化合物I的血浆水平相关，反过来，这些变量也与NIH3T3 TPR-Met肿瘤生长抑制相关。化合物1在体内对Src磷酸化没有直接影响，尽管在小鼠体内达到了高浓度（补充图S2B）。 [1]

为了进一步证实化合物I/SYN1143抑制c- met依赖性肿瘤模型的生长，我们对化合物I对已建立的U-87 MG肿瘤异种移植物进行了测试。如图5D所示，化合物1以剂量依赖的方式抑制这些肿瘤的生长。与NIH3T3 TPR-Met模型的数据相似，化合物1在100mg /kg每日1次或30mg /kg每日2次剂量下显著抑制肿瘤生长（P < 0.0001）。 [1]

接下来，我们测试了RONΔ160对HT-29肿瘤生长的贡献。当携带已建立HT-29肿瘤的小鼠每天给药时，化合物I/SYN1143，观察到肿瘤生长有统计学意义的剂量依赖性降低(P < 0.02；图6 a)。移植HT-29异种移植物的小鼠也接受单剂量100 mg/kg的化合物I处理，以评估体内ERK1/2磷酸化的影响。单剂量化合物I后1至12小时，HT-29异种移植物ERK1/2磷酸化被部分抑制（图6B）。体内ERK1/2磷酸化的部分抑制与肿瘤生长的部分抑制相关（图6A），与体外观察到的ERK1/2磷酸化的部分抑制相关（图4C）。有趣的是，O'Toole和他的同事 在使用人类RON单克隆抗体的HT-29异种移植物中也有类似的发现。总之，这些数据表明RONΔ160有助于HT-29细胞的致癌特性。 [1]

为了证实化合物I/SYN1143不具有非特异性抗肿瘤作用，我们在同时表达野生型c-Met和RON的col205异种移植物中对其进行了测试（图4A），但没有显示任何受体构成活性的迹象（数据未显示）。此外，这些细胞与HT-29细胞一样，表达活化的b-Raf突变体V600E。图6C显示，在c- met依赖模型和表达RONΔ160的模型中，化合物I在显著抑制肿瘤生长的剂量下对col205肿瘤的生长没有影响。

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c-Met化学抑制剂刺激小鼠颅骨临界尺寸缺陷的骨形成[2]
受损的骨可以通过成骨细胞再生。在小鼠临界尺寸颅骨缺损中研究了c-Met抑制剂对骨再生的影响。采用可吸收胶原海绵将SYN1143 (20,50 μg)或SGX523 （20,50 μg）转移至颅骨缺损。经SYN1143或SGX523治疗3周后，采用μ-CT和组织学检查骨再生区域。与对照组相比，两种c-Met抑制剂产生了边际愈合（图4A）。μ-CT体积分析显示，与胶原海绵对照相比，c-Met抑制剂以剂量依赖的方式诱导骨形成（图4B，左面板）。在缺损内新骨形成的面积分析中，SYN1143 （50 μg）和SGX523 （50 μg）在50%的骨缺损区域产生新骨。在对照组中，只有10%的骨缺损区域被新骨填充（图4B，右面板）。组织学分析显示，携带c-Met抑制剂的缺损区域充满了新形成的骨。在对照组中，缺损区域仅填充纤维组织，未填充骨组织（图4A）。

激酶化验。[1]
c-Met SYN1143/compound I的IC50测量采用均匀时间分辨荧光法测量，如前所述，略有修改。采用改良的激酶反应缓冲液，包括60 mmol/L HEPES （pH 7.4）、50 mmol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2和5 mmol/L MnCl2。化合物I在10点连续稀释中进行测试，使用ATP浓度为c-Met的三分之二Km值，并使用edie - hofstee和Lineweaver-Burke方法计算。荧光比在RubyStar仪器上读取。为了测量化合物I对RON的IC50，采用Invitrogen LanthaScreen程序，并使用荧光素-聚gt底物。在Tecan Safire II上读取荧光比率。

Western blot分析。[1]
将细胞培养至融合，血清饥饿过夜，然后用不同浓度的SYN1143/化合物I处理1小时。为了研究化合物I抑制配体依赖性受体激活的能力，用增加浓度的化合物I处理血清饥饿细胞1小时，然后在化合物I存在的情况下用重组人HGF刺激10分钟（250 ng/mL）或MSP刺激30分钟（800 ng/mL）。这些生长因子的浓度是根据先前的剂量反应研究选择的，这些浓度表明这些浓度最大限度地激活了它们的受体。

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免疫沉淀反应。[1]
使用抗磷酸酪氨酸4G10抗体，分别从NIH3T3 RON细胞和HT-29细胞中免疫沉淀磷酸化的RON和RONΔ160。随后用RON C-20抗体Western blotting检测RON/RONΔ160。

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单层划痕试验。[1]
将NIH3T3 RON和NIH3T3 TPR-Met细胞接种于六孔板，培养至融合。将细胞血清饥饿过夜，然后用不同浓度的SYN1143/化合物I处理1小时。用P200吸管尖端引入间隙。在NIH3T3 RON细胞中，用160 ng/mL MSP C672A单独或MSP C672A和化合物I刺激细胞在间隙中迁移，而NIH3T3 TPR-Met细胞仅用化合物I处理。孵育过夜后，光镜检查细胞并拍照。放大（×40）显示。

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细胞增殖试验[1]
利用细胞计数试剂盒-8，采用WST法分析单层培养细胞的增殖情况。细胞用含10%胎牛血清的α-MEM或DMEM培养于96孔板中。一旦达到70%的合度，将培养基改为含有2.5% FBS的α-MEM或DMEM，不含或含SYN1143或SGX523 (0.3, 1, 3, 5, 10, 30 μM)，培养24 h。然后在每孔中加入CCK-8溶液（10µl），在37°C下孵育1 h。使用酶标仪测定450 nm处的吸光度。以含10% CCK-8的α-MEM或DMEM为对照。

将携带 NIH3T3 TPR-Met 皮下肿瘤的雌性 CD1 nu/nu 小鼠（6-8 周龄）[1]
10、30、100 mg/kg
每日灌胃一次或两次，持续 22 天

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异种移植研究。[1]
将 NIH3T3 TPR-Met (1 × 10⁶)、U-87 MG (5 × 10⁶)、HT-29 (2 × 10⁶，与 Matrigel 以 2:1 的比例混合) 或 Colo205 (2 × 10⁶，与 Matrigel 混合) 细胞皮下注射到雌性 CD1 nu/nu 小鼠（每组 n = 10）的右侧腹部。SYN1143/化合物 I 治疗在肿瘤植入后 1 天或肿瘤形成（约 200 mm³）时开始。化合物 I/SYN1143 配制于 2% 羟丙基甲基纤维素和 1% Tween 80 的水溶液中（用 HCl 调节 pH 至 2.2）。小鼠每日灌胃给药一次或两次。每周两次使用 Pro-Max Fowler 数字超大游标卡尺（Fred Fowler 公司）测量肿瘤体积，测量指标为长（mm）×宽（mm）×高（mm），单位为立方毫米。数据以各组的平均值 ± 标准误 (SE) 表示，并绘制成时间函数曲线。采用重复测量方差分析 (ANOVA) 和 Scheffe 事后检验评估生长曲线间观察到的差异的统计学意义。为了评估化合物 I 在肿瘤中的药效学作用，将已建立的（约 300–400 mm³）NIH3T3 TPR-Met 或 HT-29 异种移植瘤小鼠用 100 mg/kg 的化合物 I 单次给药。在治疗后指定时间点采集肿瘤组织（每个时间点 n = 3），并立即置于液氮中冷冻。采用蛋白质印迹法分析治疗对 c-Met 和 Gab1（c-Met 的下游衔接蛋白）或 ERK1/2（RON 的下游蛋白）磷酸化的影响。

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动物实验、放射学和组织学分析[2]
将六周龄雄性小鼠随机分配到各实验组。这些动物经腹腔注射佐来替尔（Zoletil，30 mg/kg）和罗普宁（Rompun，10 mg/kg）的混合物进行麻醉。使用直径为 5 mm 的环钻制造一个临界尺寸的颅骨缺损。将 c-Met 抑制剂 SYN1143 或 SGX523 与可吸收胶原海绵一起填充到缺损处。给药三周后，使用二维放射成像设备和三维微型计算机断层扫描 (μ-CT) 系统评估骨形成情况。对于软 X 射线分析，使用诊断 X 射线胶片在以下条件下采集扫描图像：35 kVp 和 400 μA，持续 45 秒。对于 μ-CT 分析，在 50 kV 和 200 μA 的条件下采集扫描图像。使用 NRecon 和 CT 分析仪软件重建这些图像。使用 Mimics 软件获得 3D 表面渲染图像和修复骨体积。成像程序。组织学研究中，取出植入物或颅骨标本，用10%中性缓冲福尔马林固定，用Calci-Clear Rapid脱钙，石蜡包埋，然后切片（厚度4 µm）。这些切片用苏木精/伊红染色，以评估一般组织反应和骨形成情况。

药代动力学。[1]
采用蛋白质沉淀法提取小鼠血浆样品（20 μL），以分离SYN1143/化合物I和内标。提取的样品通过反相液相色谱法在Varian Pursuit C18分析柱（30 × 2.0 mm，5 μm）上进行分离。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液。采用梯度洗脱，流速为0.6 mL/min，总运行时间为2 min。采用液相色谱-串联质谱法测定小鼠样品中SYN1143/化合物I的浓度，使用大气压电离多反应监测正离子模式。峰面积由Sciex Analyst软件（版本1.4.1）进行积分。随后将数据导出至 Small Molecules Discovery Assay Watson 软件，该软件采用加权 (1/×2) 线性回归法，以峰面积比（化合物 I 的峰面积/内标物的峰面积）对校准标准品的理论浓度进行回归，从而确定浓度。校准标准品和质控样品的总体精密度和准确度均由 Small Molecules Discovery Assay Watson 软件测定。

[1]. Identification of a novel recepteur d'origine nantais/c-met small-molecule kinase inhibitor with antitumor activity in vivo. Cancer Res. 2008 Aug 15;68(16):6680-7.

[2]. Chemical inhibitors of c-Met receptor tyrosine kinase stimulate osteoblast differentiation and bone regeneration. Eur J Pharmacol. 2017 Jul 5;806:10-17.

N-[3-氟-4-[(7-甲氧基-4-喹啉基)氧基]苯基]-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-5-甲基-3-氧代-2-苯基-4-吡唑甲酰胺是一种芳香酰胺。

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南特原源受体 (RON) 是一种与 c-Met 密切相关的受体酪氨酸激酶。这两种受体均参与细胞增殖、迁移和侵袭，并且有证据表明它们在癌症中均存在异常表达。受体过表达是最常见的报道，但其他机制也可能导致 RON 和 c-Met 的致癌激活。这些机制包括 c-Met 的激活突变或基因扩增以及 RON 的组成型活性剪接变体。我们鉴定了一种新型的 RON 和 c-Met 抑制剂化合物 I，并对其体外和体内活性进行了表征。化合物 I 选择性且高效地抑制 RON 和 c-Met 的激酶活性，IC50 值分别为 9 和 4 nmol/L。化合物 I 以剂量依赖的方式抑制肝细胞生长因子介导和巨噬细胞刺激蛋白介导的信号传导以及细胞迁移。在异种移植模型中对化合物 I 进行了体内测试，这些模型要么依赖于 c-Met，要么表达组成型活性形式的 RON（HT-29 中的 RONΔ160）。化合物 I 完全抑制了 NIH3T3 TPR-Met 和 U-87 MG 异种移植瘤的生长，但在 HT-29 异种移植瘤中仅表现出部分抑制作用。化合物 I 在 HT-29 异种移植瘤中的作用与激活型 b-Raf V600E 突变的表达相一致，该突变激活了 RON 下游的丝裂原活化蛋白激酶通路。重要的是，肿瘤生长抑制与肿瘤中c-Met依赖性和RON依赖性信号通路的抑制相关。综上所述，我们的研究结果表明，RON/c-Met双重小分子抑制剂具有抑制肿瘤生长的潜力，因此可能对RON和/或c-Met激活的癌症患者具有治疗价值。[1] c-Met受体酪氨酸激酶及其配体肝细胞生长因子（HGF）最近被发现能够负调控骨形态发生蛋白（BMP）诱导的成骨作用。然而，c-Met受体化学抑制剂对成骨细胞分化过程的影响尚未得到研究，尤其是c-Met化学抑制剂在体内骨再生中的应用。本研究表明，c-Met受体酪氨酸激酶的化学抑制剂SYN1143和SGX523能够促进前体细胞向成骨细胞分化，并刺激小鼠颅骨缺损的再生。SYN1143或SGX523处理可抑制MC3T3-E1和C3H10T1/2细胞中HGF诱导的c-Met磷酸化。这些抑制剂的浓度对MC3T3-E1或C3H10T1/2细胞的增殖没有显著影响。c-Met化学抑制剂与成骨诱导培养基联合处理可增强成骨细胞特异性基因的表达和钙结节的形成，并伴有Runx2表达的增加，该过程依赖于c-Met受体但不依赖于Erk-Smad信号通路。值得注意的是，这些c-Met抑制剂的给药显著修复了临界尺寸的颅骨缺损。总的来说，我们的研究结果表明，c-Met受体酪氨酸激酶的化学抑制剂可能作为诱导骨再生的新型治疗方法。[2]

C31H29FN4O5

556.58

556.212

C, 68.88; H, 5.41; F, 3.51; N, 10.36; O, 11.84

913376-84-8

913376-84-8

16757524

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.660

4.39

107.61

2

8

8

41

986

0

O=C(C1=C(C)N(CC(C)(C)O)N(C2C=CC=CC=2)C1=O)NC1C=C(F)C(OC2C3C(=CC(=CC=3)OC)N=CC=2)=CC=1

UYMSIPINLJNNOU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H29FN4O5/c1-19-28(30(38)36(21-8-6-5-7-9-21)35(19)18-31(2,3)39)29(37)34-20-10-13-27(24(32)16-20)41-26-14-15-33-25-17-22(40-4)11-12-23(25)26/h5-17,39H,18H2,1-4H3,(H,34,37)

N-[3-fluoro-4-(7-methoxyquinolin-4-yl)oxyphenyl]-1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-5-methyl-3-oxo-2-phenylpyrazole-4-carboxamide

RON-IN-1; RONIN1; RON inhibitor 1; 913376-84-8; N-[3-Fluoro-4-[(7-methoxyquinolin-4-yl)oxy]phenyl]-1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-5-methyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazole-4-carboxamide; N-(3-Fluoro-4-((7-methoxyquinolin-4-yl)oxy)phenyl)-1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-5-methyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazole-4-carboxamide; N-{3-fluoro-4-[(7-methoxyquinolin-4-yl)oxy]phenyl}-1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-5-methyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazole-4-carboxamide; AMG-1; SYN1143; RON-IN-1; N-[3-fluoro-4-(7-methoxyquinolin-4-yl)oxyphenyl]-1-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-5-methyl-3-oxo-2-phenylpyrazole-4-carboxamide; RON IN 1; Met Kinase Inhbitor IV ; RON inhibitor-1; Ron Inhibitor I

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (179.7 mM)
Ethanol: ~60 mg/mL (107.8 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.49 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。