Seliciclib (Roscovitine)   中文名称: 瑟利西利

cdc2/cyclin B (IC50 = 0.65 μM); cdk2/cyclin A (IC50 = 0.7 μM); Cdk2/cyclin E2 (IC50 = 0.7 μM); CDK5/p35 (IC50 = 0.16 μM); GST-erk1 (IC50 = 30 μM); erk1 (IC50 = 34 μM); erk2 (IC50 = 14 μM); IR tyrosine kinase (IC50 = 70 μM)

体外活性：Roscovitine 对一些细胞周期蛋白依赖性激酶表现出高效和高选择性，对于 cdc2/cyclin B、cdk2/cyclin A、cdk2/cyclin E 和 cdk5/p53 的 IC50 分别为 0.65、0.7、0.7 和 0.16 μM。 Roscovitine 可逆性抑制海星卵母细胞和海胆胚胎微摩尔范围内的前相/中期转变，抑制非洲爪蟾卵提取物中的体外 M 相促进因子活性和体外 DNA 合成，并抑制哺乳动物细胞系的增殖，平均 IC50 16μM。在系膜细胞中，Roscovitine 导致 CDK2 活性呈剂量依赖性降低，在 7.5、12.5 和 25 mM 浓度下，Roscovitine 分别导致 CDK2 活性降低 25、50% 和 100%。最近的一项研究表明，Roscovitine 可抑制盘基网柄菌中的 cdk5 激酶活性、细胞增殖、多细胞发育和 cdk5 核转位，而不影响无菌生长期间 cdk5 蛋白的表达。激酶测定：在 30°C 的缓冲液 C 中测定激酶活性。从数据中减去空白值，并将活性计算为在 10 分钟孵育期间掺入蛋白质受体中的磷酸盐的摩尔量。使用适当稀释的 DMSO 进行对照。在少数情况下，底物的磷酸化通过 SDS/PAGE 后的放射自显影进行评估。 p34cdc2/cyclin B 通过亲和层析从 M 期海星 (M. glacialis) 卵母细胞中纯化。在终体积为 30 μL 的 15 μM [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol；1 mCi/mL) 存在下，用 1 mg 组蛋白 H1/mL 进行测定。在 30 °C 下孵育 10 分钟后，将 25 μL 等份上清液点样到 Whatman P81 磷酸纤维素纸片上，20 秒后，将滤膜清洗 5 次（每次至少 5 分钟）。 10mL磷酸/L水的溶液。将湿滤器转移到 6 mL 塑料闪烁瓶中，添加 5 mL ACS 闪烁液，并在 Packard 计数器中测量放射性。激酶活性表示为 10 分钟孵育期间掺入组蛋白 H1 中的磷酸盐的摩尔量或最大活性的百分比。 p33cdk2/cyclin A 和 p33cdk2/cyclinE 由感染各种杆状病毒的 sf9 昆虫细胞提取物重建。细胞周期蛋白 A 和 E 是与谷胱甘肽 S-转移酶的融合蛋白，复合物在谷胱甘肽-琼脂糖珠上纯化。如 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶所述，在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，用 1 mg/mL 组蛋白 H1 测定激酶活性，持续 10 分钟，最终体积为 30 μL。 p33cdk5/p35 从牛脑中纯化，不包括 Mono S 色谱步骤。将来自 Superose 12 柱的活性级分合并并浓缩至终浓度约为 25 μg 酶/mL。在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，用 1 mg/mL 组蛋白 HI 检测激酶，检测时间为 10 分钟，最终体积为 30 μL，如 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶所述。 p33cdk5/cyclin D1 从昆虫细胞裂解物中获得。 Cdk4 是一种与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，活性复合物在谷胱甘肽-琼脂糖珠上纯化。在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，用纯化的视网膜母细胞瘤蛋白（与谷胱甘肽-S-转移酶复合）测定其激酶活性，最终体积为 30 μL。孵育 15 分钟后，添加 30 μL Laemmli 样品缓冲液。磷酸化底物通过 10% SDS/PAGE 解析，并通过 Hyperfilm MP 过夜暴露的放射自显影和光密度测定法进行分析。 p33cdk4/cyclinD 2 从昆虫细胞裂解物中获得。在终体积为 30 μL 的 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，使用纯化的视网膜母细胞瘤蛋白（与谷胱甘肽-S-转移酶复合）进行测定。孵育 30 分钟后，添加 30 μL Laemmli 样品缓冲液。磷酸化底物通过 10% SDS/PAGE 解析，并通过 Hyperfilm MP 过夜暴露的放射自显影和光密度测定进行分析。 MAP 激酶 erkl（用谷胱甘肽-S-转移酶标记）在细菌中表达，在谷胱甘肽-琼脂糖珠上纯化，并在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下用 1 mg 髓磷脂碱性蛋白/ml 进行测定，如上所述p34cdc2cyclin B 激酶。 His-标记的erk1和erk2在体外被丝裂原激活的蛋白激酶激酶激活、纯化（Ni亲和力和Mono Q）并如上所述在10分钟内以30μL的终体积进行测定。从杆状病毒感染的 sf9 昆虫细胞中纯化蛋白激酶 C 亚型，并在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下用 1 mg/mL 硫酸鱼精蛋白进行测定，在 30 °C 下进行 10 分钟，最终体积为 30 μL。如 cdc2 激酶所述，在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收磷酸化的硫酸鱼精蛋白。如对p34cdc2/细胞周期蛋白B激酶所述，在15μM[γ-32P]ATP存在下用1mg组蛋白H1/ml测定从牛心脏纯化的cAMP依赖性蛋白激酶的催化亚基。在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，如针对 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶所述，用 1 mg 组蛋白 H1/mL 测定从牛气管平滑肌纯化至同质的 cGMP 依赖性蛋白激酶。从大鼠肝细胞质中分离酪蛋白激酶 2，并用 1 mg 酪蛋白/mL 和 15 μM [γ-32P]ATP 进行测定。将底物点样在 Whatmann 3MM 过滤器上并用 10%（质量/体积）三氯乙酸洗涤。从鸡砂中纯化的肌球蛋白轻链激酶在 100 nM 钙调蛋白、100 μM CaCl2、50 mM Hepes、5 mM MgCl、1 mM 二硫苏糖醇和 0.1 mg BSA/ml 存在下在 pH 7.5 下使用基于以下的合成肽进行测定平滑肌肌球蛋白轻链磷酸化位点，并在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，最终体积为 50 μL。如上所述，在磷酸纤维素过滤器上监测放射性磷酸盐的掺入。 ASK-γ 是 GSK-3 的植物同源物，在大肠杆菌中表达为谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，并在谷胱甘肽-琼脂糖上纯化。使用 5 μg 髓磷脂碱性蛋白，在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，在 30 °C 下检测 ASK-γ 激酶 10 分钟，终体积为 30 μL。如 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶所述，在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收磷酸化髓磷脂碱性蛋白。胰岛素受体酪氨酸激酶结构域 (CIRK-41) 在杆状病毒系统中过表达并纯化至均质。在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下，最终体积为 30 μL，使用 5 μg Raytide 在 30 °C 下测定其激酶活性 10 分钟。按照 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶的描述，在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收磷酸化的 Raytide。 c-src 激酶从受感染的 Sf9 细胞中纯化。 v-abl 激酶在大肠杆菌中表达，并在 IgG Affigel 10 上进行亲和纯化。两种激酶均在 30 °C 下使用 5 μg Raytide、在 15 μM [γ-32P]ATP 存在下、在最终体积为 30 μL。按照 p34cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶的描述，在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收磷酸化的 Raytide。细胞测定：包含九种肿瘤类型的 60 个人类肿瘤细胞系（白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、中枢神经系统癌症、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌）提前培养 24 小时连续暴露于 0.01-100 μM roscovitine 48 小时。使用磺基罗丹明 B 蛋白测定来评估细胞毒性。

Roscovitine，剂量为 50 mg/kg，可显着抑制尤文氏肉瘤家族肿瘤 (ESFT) 异种移植物的生长。 Roscovitine 增强阿霉素的抗肿瘤作用，而不增加毒性，其机制涉及细胞周期停滞而不是荷有已建立的 MCF7 异种移植物的裸鼠的细胞凋亡。

缓冲液 C 中的激酶活性在 30 °C 下测量。数据去除空白值，活性计算为在 10 分钟孵育过程中掺入蛋白质受体中的磷酸盐的摩尔量。适当的 DMSO 稀释液用于对照。 SDS/PAGE 后，有时使用放射自显影来评估底物的磷酸化。通过使用亲和层析，从 M 期海星 (M. glacialis) 卵母细胞中分离出 p34^cdc2/cyclin B。在最终体积为 30 μL 的情况下，测定中使用 1 mg 组蛋白 H1/mL 以及 15 μM [γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol；1 mCi/mL)。 30 °C 孵育 10 分钟后，将 25 μL 等份上清液点样到 Whatman P81 磷酸纤维素纸上。 20 秒后，将过滤器在 10mL 磷酸/L 水的溶液中洗涤五次（每次至少五分钟）。将湿滤器转移至 6 mL 塑料闪烁瓶中后，添加 5 mL ACS 闪烁液，并使用 Packard 计数器测量放射性。激酶活性报告为最大活性的百分比或孵育 10 分钟后掺入组蛋白 H1 中的磷酸盐的摩尔量。重组的 p33^cdk2/cyclin A 和 p33^cdk2/cyclin E 由杆状病毒感染的 sf9 昆虫细胞提取物制成。谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白、细胞周期蛋白 A 和 E 在谷胱甘肽-琼脂糖珠上纯化。与 p34^cdk2/细胞周期蛋白 B 激酶一样，使用 1 mg/mL 组蛋白 H1 和 15 μM [γ-³²P]ATP 在 10 分钟内测量激酶活性最终体积为 30 μL。采用牛脑纯化p33^cdk5/p35；不包括 Mono S 色谱步骤。将 Superose 12 柱的活性级分合并并浓缩，直至达到约 25 μg 酶/mL 的最终浓度。与 p34^cdk2/cyclin B 激酶一样，在 15 μM [γ-³²P]ATP 存在下，使用 1 mg/mL 组蛋白 HI 检测该激酶，超过过程 10 分钟，最终体积为 30 μL。 p33^cdk5/cyclin D1 的来源是昆虫细胞裂解物。谷胱甘肽-S-转移酶和 Cdk4 形成融合蛋白，并使用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化活性复合物。在最终体积为 30 μL 的情况下，在 15 μM [γ-³²P]ATP 存在下，使用纯化的视网膜母细胞瘤蛋白（与谷胱甘肽-S-转移酶复合）测量其激酶活性。孵育 15 分钟后，添加 30 μL Laemmli 样品缓冲液。使用 10% SDS/PAGE 分离已磷酸化的底物，并使用放射自显影、光密度测定法和 Hyperfilm MP 过夜暴露进行检查。 p33^cdk4/cyclinD 2 的来源是昆虫细胞裂解物。在终体积 30 μL 中，使用纯化的视网膜母细胞瘤蛋白（与谷胱甘肽-S-转移酶复合）和 15 μM [γ-³²P]ATP 进行测试。孵育 30 分钟后，添加 30 μL Laemmli 样品缓冲液。使用 10% SDS/PAGE 分离磷酸化底物，并在暴露于 Hyperfilm MP 整夜后使用光密度测定法和放射自显影术进行检查。在谷胱甘肽-琼脂糖珠上纯化，并在 15 μM [γ-³²P]ATP 存在下用 1 mg 髓磷脂碱性蛋白/ml 进行测定，MAP 激酶 erkl（用谷胱甘肽-S-转移酶标记）是在细菌中产生，如前面提到的 p34^cdc2cyclin B 激酶。在体外，丝裂原激活的蛋白激酶激酶激活His标记的erk1和erk2，然后使用Ni亲和力和Mono Q进行纯化。按照前面提到的方案，在最终体积为30微升的情况下进行测定十分钟。使用受感染的 sf9 昆虫细胞分离蛋白激酶 C 亚型，然后使用 1 mg/mL 硫酸鱼精蛋白和 15 μM [γ-^{32P]ATP。 Whatman P81 磷酸纤维素纸用于回收磷酸化的硫酸鱼精蛋白，就像用于 CDC2 激酶一样。 cAMP 依赖性蛋白激酶的催化亚基从牛心脏中纯化出来，使用 1 mg 组蛋白 Hl/ml 和 15 μM [γ-32P]ATP 进行测量，就像 p34 cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶。从牛气管平滑肌中匀浆和纯化后，使用 1 mg 组蛋白 Hl/mL 和 15 μM [γ-32P]ATP 测量 cGMP 依赖性蛋白激酶，就像 p34 cdc2/细胞周期蛋白 B 激酶。使用大鼠肝细胞质分离酪蛋白激酶 2，然后使用 1 mg 酪蛋白/mL 和 15 μM [γ-32P]ATP 进行测试。在 Whatmann 3MM 过滤器上点样后，用 10%（质量/体积）三氯乙酸清洁基材。基于平滑肌肌球蛋白轻链磷酸化位点的合成肽用于分析从鸡砂中纯化的肌球蛋白轻链激酶。测定的最终体积为 50 μL，条件包括 100 nM 钙调蛋白、100 μM CaCl₂、50 mM Hepes、5 mM MgCl、1 mM 二硫苏糖醇和 0.1 mg BSA/ml，pH 值7.5。如前所述，在磷酸纤维素过滤器上跟踪放射性磷酸盐的掺入。 GSK-3 的植物同源物 ASK-γ 在大肠杆菌中表达为谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白后，在谷胱甘肽-琼脂糖上纯化。 30°C 10 分钟，将 5 μg 髓磷脂碱性蛋白添加到终体积 30 μL 的 15 μM [γ-32P]ATP 中，以测试 ASK-γ 激酶。在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上，以与 p34cdc2/cyclin B 激酶相同的方式回收磷酸化髓磷脂碱性蛋白。在杆状病毒系统中，胰岛素受体酪氨酸激酶结构域 (CIRK-41) 过度表达并均质纯化。使用 5 μg Raytide 和 15 μM [γ-32P]ATP 在最终体积 30 μL 中在 30 °C 下测量 10 分钟，测量其激酶活性。如 p34cdc2/cyclin B 激酶所述，磷酸化的 Raytide 在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收。从被感染的 Sf9 细胞中分离出 c-src 激酶。在大肠杆菌中表达后，使用 IgG Affigel 10 亲和纯化 v-abl 激酶。该测定在 30°C 下进行 10 分钟，使用 5 μg Raytide，15 μM [γ-32P]ATP，最终体积为 30 μL。如 p34cdc2/cyclin B 激酶所述，磷酸化的 Raytide 在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上回收。}

使用的细胞是大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）。 NRK52E 细胞的治疗涉及使用 CDK5 抑制剂 (R)-Roscovitine (Seliciclib) (Ros.；10 μM) 和激活剂 p35 (15 μM)、PPARγ 激动剂 BRL 49653 (Rosi.；50 nM) 和 ERK1/2 抑制剂U0126 (50 nm)。 72 小时治疗期后，从每组中提取细胞进行进一步分析。

Rats: Male Sprague Dawley rats (6–8 weeks old) receive a single intraperitoneal injection of either citrate buffer (non-diabetic) or 0.1 M citrate buffer pH 4.5 (diabetic) diluted with streptozotocin (65 mg/kg). Three days following the injection, the glucose oxidase method is used on a glucose analyzer to measure plasma glucose concentrations. The study includes rats that are classified as diabetics if their blood glucose level is greater than 16.7 mM. The level of plasma glucose is measured once a week. Seliciclib (25 mg/kg) is injected intraperitoneally into diabetic rats once a day until they are sacrificed in order to study the impact of CDK5 inhibition on renal tubulointerstitial fibrosis. As controls, DMSO is used.
Mice: Subcutaneous injections of exponentially growing UMSCC47 cells are made into the sacral region of female NUDE mice. Each mouse is inoculated with 2×10⁵ cells in 50% matrigel and 50% PBS at a volume of 100 μL. The mice receive intraperitoneal injections of either vehicle or Seliciclib at a dose of 16.5 mg/kg once the tumors have grown to a detectable size. General behavior, tumor growth, and body weight are tracked. Every three days, tumor volumes are measured. Once the tumor grows larger than 0.5 cm³, the mice are killed.

[1]. Eur J Biochem . 1997 Jan 15;243(1-2):527-36.

[2]. J Clin Invest . 1997 Nov 15;100(10):2512-20.

[3]. J Cell Biochem . 2012 Mar;113(3):868-76.

[4]. Cancer Res . 2005 Oct 15;65(20):9320-7.

[5]. Int J Cancer . 2009 Jan 15;124(2):465-72.

C19H26N6O

354.45

354.22

C, 64.38; H, 7.39; N, 23.71; O, 4.51

186692-46-6

Solid powder

CC[C@H](CO)NC1=NC(=C2C(=N1)N(C=N2)C(C)C)NCC3=CC=CC=C3

BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N

InChI=1S/C19H26N6O/c1-4-15(11-26)22-19-23-17(20-10-14-8-6-5-7-9-14)16-18(24-19)25(12-21-16)13(2)3/h5-9,12-13,15,26H,4,10-11H2,1-3H3,(H2,20,22,23,24)/t15-/m1/s1

(2R)-2-[[6-(benzylamino)-9-propan-2-ylpurin-2-yl]amino]butan-1-ol

Seliciclib; R-Roscovitine; CYC202; CYC202; Roscovitin; Roscovitine; CYC202; CYC 202

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

1%DMSO+30% polyethylene glycol+1%Tween 80: 30 mg/mL

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。