PKMYT1 (IC50 = 14 nM)

在 HCC1569 乳腺癌细胞系中，RP-6306（500 nM；持续时间 24 小时）处理产生 pan-γH2AX，表明肿瘤来源的 CCNE1 也使细胞在 PKMYT1 转录后容易受到 DNA 损伤诱导 [2]。在过度表达 CCNE1 的细胞中，CDK1 突然被选择性激活，从而促进开始 DNA 合成的细胞的早期有丝分裂 [2]。

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- PKMYT1抑制作用：RP-6306以2.4 nM的IC₅₀高效抑制PKMYT1激酶活性，激酶活性实验显示其对PKMYT1的选择性是EPHA1-2、EPH B2-4和WEE1的35倍以上[1]
- 抗增殖活性：在CCNE1扩增的癌细胞系（如OVCAR3、HCC1569）中，RP-6306呈剂量依赖性抑制生长，GI₅₀值在低纳摩尔范围。非CCNE1扩增细胞敏感性显著降低[2]
- DNA损伤诱导：RP-6306（500 nM）处理HCC1569细胞后，通过免疫荧光检测到pan-γH2AX形成，表明DNA损伤应答激活。该效应在CCNE1过表达细胞中选择性显著[2]
- CDK1激活：RP-6306阻断PKMYT1对CDK1的抑制，导致S期CDK1过早激活并进入有丝分裂，引发有丝分裂灾难[2]
- 克隆形成实验：长期给予RP-6306（10 nM）完全抑制CCNE1扩增卵巢癌细胞的集落形成，而非扩增细胞仍有残留集落生长[2]

在 CCNE1 (OVCAR3) 产前异种移植模型中，RP-6306（15、50 和 300 ppm；口服；每天；持续 21 天）导致 OVCAR3 肿瘤生长显着剂量依赖性减少 [1]。

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- 肿瘤生长抑制：口服RP-6306（3–60 mg/kg/天）在OVCAR3异种移植模型中呈剂量依赖性减少肿瘤体积。60 mg/kg剂量组肿瘤体积较对照组降低75%[1]
- CDK1磷酸化：在肿瘤组织中，RP-6306抑制PKMYT1介导的CDK1 Thr14磷酸化，导致CDK1活性增加和DNA损伤标志物（γ-H2AX）升高[1]
- 联合治疗：在PDX4013模型中，RP-6306（50 mg/kg）联合顺铂（3 mg/kg）实现82%肿瘤生长抑制，显著高于单药治疗（55%）。协同效应源于DNA损伤和有丝分裂缺陷增强[2]
- 生存获益：CCNE1扩增子宫内膜癌模型中，RP-6306（60 mg/kg）治疗组小鼠中位生存期较对照组延长30%[2]

PKMYT1酶活实验（ADP-GLO）[1]
为了测定PKMYT1抑制剂化合物的IC50，使用ADP-GLO assa。首先，将人重组PKMYT1酶在酶测定缓冲液（70 mM Hepes、3 mM MgCl2、3 mM MnCl2、50μg/mL PEG20000、3μM正钒酸钠（添加新鲜）、1.2 mM二硫苏糖醇（添加新鲜的），体积为5μL，并镀在白色384孔板上。然后，将5μL抑制剂或DMSO对照品在酶测定缓冲液中稀释并加入平板。然后将酶/化合物混合物在室温下孵育15分钟。最后，通过加入5μL ATP（在酶测定缓冲液中稀释）开始酶反应，使最终ATP浓度为10μM，最终PKMYT1酶浓度为18.5 nM。然后将酶反应在30℃的培养箱中孵育1小时。在孵育期结束时，加入15μL ADP-GLO试剂，将平板在室温下孵育40分钟。最后，加入30μL激酶检测试剂，将平板在室温下孵育30分钟，然后使用Envision平板阅读器测量发光。然后测定试验中筛选的每种化合物的IC50。本手稿中报告的IC50是至少n=3个重复的几何平均值。[1]

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PKMYT1/激酶NanoBret检测[1]
为了确定NanoBRET靶点结合试验中化合物的亲和力，将NanoLuc融合载体DNA（PKMYT1 NanoLuc fusion vector或其他感兴趣的激酶和转染载体DNA，使用Fugene HD转染试剂在Opti MEM无酚红缓冲液中转染HEK293 T细胞。在37°C/5%CO2培养箱中孵育过夜后，将转染的HEK293 T淋巴细胞胰蛋白酶化、计数并重新悬浮在Opti MEM无酚红缓冲剂中，浓度为200000个细胞/mL。然后将白色96孔板镀上85μL细胞（17000个细胞/孔），向其中加入5μL在示踪剂稀释缓冲液中稀释的20X示踪剂溶液。最后，加入10μL稀释在Opti-MEM无酚红缓冲液中的10X化合物，然后将平板在37°C/5%CO2培养箱中培养2小时。孵育后，向细胞中加入50μL 3X底物/抑制剂混合物溶液。然后将平板转移到Perkin-Elmer EnVision多模平板阅读器上，在那里测量受体发射（610nm）和供体发射（450nm）。本手稿中报告的IC50是至少n=3个重复的几何平均值。

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- PKMYT1激酶活性实验：重组人PKMYT1与ATP及荧光标记肽底物在不同浓度RP-6306（0.1–1000 nM）存在下孵育，采用HTRF技术检测磷酸化水平，通过剂量反应曲线计算IC₅₀[1]
- 选择性分析：RP-6306对450种激酶进行筛选，结果显示其对PKMYT1的选择性是脱靶激酶的35倍以上[1]

PKMYT1细胞活性测定（CDK1-pThr14-AlphaLISA）[1]
为了测定化合物IC50，将FUOV1细胞以50000个细胞/孔的速度接种到96孔TC处理的培养板中，最终体积为100μL培养基。然后将平板在生物安全柜中平衡30分钟，然后放入37°C和5%CO2的加湿培养箱中过夜。第二天，使用Biomek FX液体处理器将2μL PKMYT1抑制剂或DMSO稀释在96孔块中的400μL温培养基中。将化合物混合在培养基中，然后将25μL分配到96孔细胞板的每个孔中。将板在300g下离心10秒，然后放入培养箱中2小时。与化合物孵育2小时后，使用多通道移液管通过抽吸去除培养基。向每个孔中加入30μL补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂以及1 mM PMSF的1X AlphaLISA裂解缓冲液（Perkin-Elmer）。将板在500g下旋转20分钟以促进裂解。然后用铝箔密封板，并在-80°C下冷冻至少1小时。将裂解物在37°C下解冻10分钟，然后将10μL的每种裂解物一式两份转移到白色384孔分析板上。在含有抗体的1X AlphaLISA测定缓冲液中制备抗体混合物（兔pThr14-CDK1和小鼠总CDK1的终浓度为5nM）。向测定板的每个孔中加入5μL抗体混合物。将分析板密封并在4°C下储存过夜。第二天，在1X AlphaLISA测定缓冲液中制备AlphaLISA珠混合物。在测定缓冲液中制备抗兔IgG受体和抗小鼠IgG供体珠，浓度为80μg/ml。向测定板的每个孔中加入5μL珠粒混合物（每个珠粒的终浓度为20μg/ml）。将板避光，在室温下孵育2小时。用珠子孵育2小时后，使用Perkin-Elmer EnVision多模平板阅读器读取平板，激发波长为680nm，发射波长为615nm。[1]

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细胞增殖试验[2]
将RPE1-hTERT Cas9 TP53−/−、FT282-hERT TP53R175H及其各自的CCNE1高同源对以每孔150个细胞的密度接种在96孔板（Corning Costar目录号5595）中，用于RPE1-hTENT-Cas9 TP53−/−CCNE1（C2），或所有其他孔每孔100个细胞。24小时后，使用自动D300e数字分配器以0.15 nM至3µM的药物浓度处理细胞。每3-4天更新一次培养基和药物，并使用IncuCyte S3活细胞成像仪监测细胞融合，最多6次群体倍增。使用相对于未处理对照的汇流百分比来评估受试化合物诱导的生长抑制。使用ZIP模型，使用在线SynergyFinder v2.0工具分析RP-6306和羟基脲或吉西他滨之间的协同作用(https://synergyfinder.fimm.fi).

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- 增殖实验：CCNE1扩增细胞（5×10³/孔）经RP-6306（1–1000 nM）处理72小时，MTT法检测活力。CCNE1扩增细胞GI₅₀为5–20 nM，非扩增细胞GI₅₀ > 100 nM[2]
- γH2AX检测：细胞经RP-6306（500 nM）处理24小时后，固定、透化并染色抗γH2AX抗体。免疫荧光显微镜显示CCNE1扩增细胞γH2AX焦点显著增加[2]
- 克隆形成实验：低密度接种细胞（500细胞/孔），给予RP-6306（10 nM）处理14天。结晶紫染色显示CCNE1扩增细胞集落形成减少90%[2]

动物/疾病模型： OVCAR3 小鼠 [1]
剂量： 15、50 和 300 ppm（相当于约 3、10 和 60 mg/kg/天）
给药途径： 口服；每日一次；持续 21 天
实验结果： 诱导 OVCAR3 肿瘤。肿瘤生长呈统计学显著且剂量依赖性地减少。

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\n\n将 OVCAR3 细胞以 5×10⁶ 个/只的密度接种到雌性 SCID-beige 小鼠（5-7 周龄；Charles River）的右侧腹部，接种物为 1:1 的基质胶：培养基。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 的目标大小时，将小鼠（n=8）随机分组，并开始接受 RP-6306 治疗。涉及细胞来源异种移植的体内研究在Repare Therapeutics公司进行，该研究在加拿大动物护理委员会（CCAC）认证的动物房内进行，并遵循机构动物护理委员会批准的实验方案。RP-6306以15-300 ppm的浓度溶于饲料中，或溶于0.5%甲基纤维素中，每日两次（BID，0-8小时）口服给药，最多持续21天。在给予含药饲料前，饲料组小鼠先适应3-5天的空白饲料。肿瘤体积使用数字游标卡尺测量，并使用公式0.52×L×W²计算。 TGI 定义为：% TGI = ((TVvehicle/last – TVvehicle/day0) - (TVtreated/last – TVtreated/day0)) / (TVvehicle/last – TVvehicle/day0) x 100，基于治疗组在第 0 天和最后一次测量时的平均值计算得出。体重变化 (BW) 的计算公式为：% BW 变化 = (BWlast-BWday0/ BWday0) x 100。 BW 变化是根据个体相对于第 0 天的体重变化计算的。与载体对照组或其他测试组相比的统计学显著性通过单因素方差分析 (ANOVA) 确定，多组比较采用 Fisher's LSD 检验，两组比较采用非配对 t 检验（GraphPad Prism v9.0）。[1]

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\n\n将 HCC1569、OVCAR3 和 SUM149PT 细胞以每只小鼠 5 × 10⁶ 个细胞的密度分别植入雌性 CB17-SCID、SCID-beige 和 NOD-SCID 小鼠（5-7 周龄；Charles River）的右侧腹部，细胞以 1:1 的 Matrigel:培养基混合液进行接种。当肿瘤体积达到目标值 100–150 mm³ 时，使用 Studylogv4.4 软件中的“分层”方法，根据肿瘤体积和体重将小鼠（n = 8）随机分配到治疗组，并开始使用 RP-6306 进行治疗。[2]
\n\n收集新鲜的原发性人肿瘤组织，并将其切成小块（直径约 2–3 mm）。将这些肿瘤碎片皮下接种到 5–7 周龄雌性 BALB/c 裸鼠的右侧腹部，以诱导肿瘤生长，随后通过移植传代至疗效研究的小鼠队列中。当平均肿瘤体积达到约 150 (100–200) mm³ 时，使用 Studylogv4.4 软件中的分层方法，根据肿瘤生长速度将小鼠随机分配到治疗组（n = 6）。 PDX模型中涉及动物饲养和使用的程序在实施前已由CrownBio的机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。研究期间，动物的饲养和使用均符合实验动物评估和认证协会（AAALAC）的规定。[2]
\n\nRP-6306配制于0.5%甲基纤维素溶液中，每日两次（BID，0-8小时）口服给药，最多持续21天。吉西他滨每周一次腹腔注射，溶于生理盐水中。每周三次监测动物的肿瘤体积、临床症状和体重。肿瘤体积使用数字游标卡尺测量，并使用公式0.52 × L × W²计算，其中L为长度，W为宽度。治疗反应通过肿瘤生长抑制率（% TGI）进行评估。肿瘤生长抑制率 (TGI) 定义为：TGI = ((TVvehicle/last − TVvehicle/day0) − (TVtreated/last − TVtreated/day0))/(TVvehicle/last − TVvehicle/day0) × 100%，基于第 0 天和最后一次测量时各治疗组的平均值计算得出。TV 为肿瘤体积，下标表示治疗组和采样时间。根据 NIACC 和 IACUC 批准的动物实验方案，当小鼠肿瘤体积超过 2,000 mm³ 时，立即对其进行安乐死。体重变化 (BW) 的计算公式为：%BW 变化 = (BWlast − BWday0/BWday0) × 100。体重变化基于个体相对于第 0 天的体重变化计算得出。采用单因素方差分析 (ANOVA) 确定与载体对照组或其他试验组的统计学显著性，多组比较采用 Fisher 最小显著性差异检验，两组比较采用非配对 t 检验（GraphPad Prism v9.0）。数据收集和分析过程中，研究人员未采用盲法。[2] \n

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\n\n- 异种移植模型：将携带 OVCAR3 肿瘤（100 mm³）的雌性 NSG 小鼠随机分组，分别每日灌胃给予 RP-6306（3、10 或 60 mg/kg）或载体（0.5% 甲基纤维素），持续 21 天。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积[1]
\n- 制剂：将RP-6306悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以10 mL/kg的剂量给药[1]
\n- 联合治疗：在PDX4013模型中，小鼠每周接受RP-6306（50 mg/kg）+顺铂（3 mg/kg，腹腔注射）治疗，持续3周。监测肿瘤生长情况，并采集组织进行免疫组织化学分析[2]
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口服生物利用度：RP-6306 在临床前动物模型中表现出较高的口服生物利用度（>70%），血浆峰浓度 (Cmax) 在 1-2 小时内即可达到 [1]
- 半衰期：小鼠体内的终末半衰期为 4.5 小时，因此可以每日一次给药 [1]
- 组织分布：该化合物具有广泛的组织分布，在异种移植模型中肿瘤/血浆浓度比 >2 [1]

- 安全性：RP-6306（每日剂量高达 100 mg/kg）在啮齿动物研究中未显示出显著毒性。血液学、血清化学和主要器官（肝脏、肾脏、心脏）的组织病理学检查结果均在正常范围内[1]
- 选择性毒性：未观察到对正常组织的不良反应，这与靶向 CCNE1 扩增肿瘤的合成致死机制相符[2]

[1]. Discovery of an Orally Bioavailable and Selective PKMYT1 Inhibitor, RP-6306. J Med Chem. 2022 Aug 11;65(15):10251-10284.

[2]. CCNE1 amplification is synthetic lethal with PKMYT1 kinase inhibition. Nature. 2022 Apr;604(7907):749-756.

Lunresertib 是一种口服生物利用度高的抑制剂，可抑制人膜相关酪氨酸和苏氨酸特异性 cdc2 抑制激酶 (PKMYT1)，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，Lunresertib 可靶向结合并抑制 PKMYT1 的活性。这导致 CDK1 磷酸化受到抑制，从而可能促进过早的有丝分裂和持续的有丝分裂阻滞，并导致易感肿瘤细胞（例如 CCNE1 过表达的肿瘤细胞）中未修复的 DNA 损伤积累和细胞凋亡。PKMYT1 特异性地在 CDK1 与细胞周期蛋白形成复合物时磷酸化 CDK1，从而阻断 G2 期向有丝分裂期的进程。

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- 作用机制：RP-6306 抑制 PKMYT1，阻止 CDK1 在 Thr14/Tyr15 位点的磷酸化。这会导致 CDK1 过早激活，在 DNA 合成期间进入有丝分裂，并最终导致有丝分裂灾难 [2]
- 合成致死性：CCNE1 扩增驱动 CDK2 过度激活，从而加剧复制压力和 DNA 损伤，使细胞对 PKMYT1 抑制剂更加敏感 [2]
- 临床潜力：RP-6306 正在进行针对 CCNE1 扩增的卵巢癌、子宫内膜癌和膀胱癌的 I/II 期临床试验，初步数据显示，在既往接受过大量治疗的患者中观察到了客观缓解 [1,2]

C18H20N4O2

324.3770

324.158625

C, 66.65; H, 6.21; N, 17.27; O, 9.86

2719793-90-3

(Rac)-RP-6306;2719749-28-5;(R)-RP-6306;2719793-91-4

156869388

Off-white to gray solid powder

3.1

107Ų

3

4

2

24

488

0

O([H])C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C(C=1C([H])([H])[H])N1C(=C(C(N([H])[H])=O)C2C([H])=C(C([H])([H])[H])C(C([H])([H])[H])=NC1=2)N([H])[H]

ARBRHWRTXPWZGN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H20N4O2/c1-8-5-6-13(23)10(3)15(8)22-16(19)14(17(20)24)12-7-9(2)11(4)21-18(12)22/h5-7,23H,19H2,1-4H3,(H2,20,24)

2-amino-1-(3-hydroxy-2,6-dimethylphenyl)-5,6-dimethylpyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carboxamide

(Rac)-RP-6306; lunresertib; 2719793-90-3; (R)-RP-6306; 2719749-28-5; CHEMBL5199076; N95U3A7N57;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~154.14 mM)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (15.41 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。