RPI-1

JNK2; Akt
Ret receptor tyrosine kinase (including Ret/Ptc1 oncoprotein, MEN2A-associated RET mutants C634R and C634W) [1][2].

经72小时处理后，RPI-1对TPC-1细胞的生长抑制作用较为敏感，IC50值为5.1 μM。在TPC-1细胞中，RPI-1（7.5–60 μM）可抑制Ret/Ptc1的自身磷酸化。在TPC-1细胞培养条件下，RPI-1的抑制作用导致JNK2和AKT相关信号通路的抑制[1]。
在表达Ret突变体的NIH3T3细胞中，RPI-1的IC50值为3.6 µM，而未转染的NIH3T3细胞中该值为16 µM；在转染RET突变体和转染H-RAS的NIH3T3细胞中，软琼脂克隆形成所需的IC50值分别为2.4 µM和26 µM。经 RPI-1 处理 24 小时后，表达 Ret 突变体的 NIH3T3 细胞中 Ret 蛋白和酪氨酸磷酸化水平均无法检测到。RPI-1 可抑制 TT 细胞增殖、Ret 酪氨酸磷酸化、Ret 蛋白表达以及 PLCγ、ERK 和 AKT 的激活[2]。在人乳头状甲状腺癌 TPC-1 细胞（自发表达 RET/PTC1）中，RPI-1 处理 72 小时后，IC50 值为 5.1 ± 0.4 μM，可抑制细胞增殖。持续数天的生长抑制作用表明其具有细胞抑制作用[1]。

- RPI-1（60 μM，72 小时）处理 TPC-1 细胞可诱导细胞周期 G2 期积累，增加细胞周期蛋白 A 和 B1 的表达，导致 pRb 部分过度磷酸化，并强烈诱导 p21WAF1 的表达。未检测到有丝分裂特异性磷酸肽[1]。

- 在 TPC-1 细胞中，RPI-1 以剂量依赖的方式抑制 Ret/Ptc1（p59 和 p64 两种亚型）的酪氨酸磷酸化（72 小时后浓度 >15 μM 时完全去磷酸化；10 分钟后即可检测到抑制作用）。它还破坏了Ret/Ptc1与Shc和PLCγ的结合，并降低了PLCγ的酪氨酸磷酸化水平。Shc的结合位点（Ret/Ptc1上的pTyr451，对应于pTyr1062）被去磷酸化。p66Shc的表达下调，p52Shc的酪氨酸被去磷酸化，而p46Shc不受影响[1]。

在TPC-1细胞中，RPI-1以剂量依赖的方式抑制JNK2（54 kDa）和AKT（Ser473磷酸化）的激活，但不影响JNK1、p42/p44 ERK或p38 MAPK。在NIH3T3PTC1转染细胞中，JNK和AKT通路的激活也受到抑制[1]。

-RPI-1（60 μM，72 h）使TPC-1细胞中的端粒酶活性降低了约85%。在Ret/Ptc1阴性的NPA细胞中，端粒酶活性降低了约65%。体外实验中，当细胞提取物暴露于该药物时，未观察到端粒酶的直接抑制作用[1]。

- 在转染了MEN2A相关RET C634R突变体的NIH3T3成纤维细胞（NIH3T3MEN2A细胞）中，RPI-1在72小时后抑制细胞增殖的IC50为3.6 μM（95% CI = 1.8至5.4 μM），而亲代NIH3T3细胞的IC50为16 μM（95% CI = 12.3至19.7 μM），H-RAS转染的NIH3T3细胞的IC50为14.1 μM（95% CI = 8.0至20.2 μM）[2]。

- 在软琼脂克隆形成实验中，RPI-1的IC50为NIH3T3MEN2A 细胞的 RPI-1 浓度为 2.4 μM（95% CI = 0.8 至 4.0 μM），H-RAS 转染的 NIH3T3 细胞的 RPI-1 浓度为 26 μM（95% CI = 17 至 35 μM）。亲代 NIH3T3 细胞在软琼脂中不形成克隆 [2]。

在 NIH3T3MEN2A 细胞中，RPI-1 (10 μM) 可在 2 小时内抑制 Ret 酪氨酸磷酸化，并且在长时间处理 (24-72 小时) 后，可降低成熟 (170 kDa) 和前体 (150 kDa) Ret 蛋白的表达。该化合物还能逆转细胞形态，使其呈现更扁平、更有序的表型[2]。

- 在人甲状腺髓样癌TT细胞（内源性表达RET C634W突变体）中，RPI-1处理7天后，IC50为7.2 μM（95% CI = 6.6至7.8 μM），抑制细胞增殖。浓度>10 μM时观察到细胞生长停滞[2]。

- 在TT细胞中，RPI-1（处理24小时）呈剂量依赖性地抑制Ret酪氨酸磷酸化和Ret表达（170和150 kDa）。它还能降低Ret与PLCγ的结合，抑制PLCγ酪氨酸磷酸化，并使Ret上的pY1062对接位点去磷酸化。同时，ERK和AKT的磷酸化（激活）受到抑制[2]。

RPI-1（50、100 mg/kg；口服；每日两次，持续 10 天）可抑制 TT 异种移植瘤生长 81%[2]。

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在携带皮下人甲状腺髓样癌 TT 异种移植瘤的裸鼠中，口服 RPI-1，剂量为 2 × 100 mg/kg/天（每日两次），持续 10 天，可抑制 75% 的肿瘤重量（与对照组相比，P<.001），且 8 只小鼠中有 2 只在实验结束时（第 53 天）肿瘤完全消失。延长治疗时间（40 天），剂量为 2 × 100 mg/kg/天，在第 66 天可抑制 81% 的肿瘤重量（P<.001）。在第 140 天，8 只小鼠中有 2 只仍未出现肿瘤。较低剂量（2 × 50 mg/kg/天，持续 10 天）可抑制 60% 的肿瘤重量（与对照组相比，P = 0.003）[2]。

- RPI-1 治疗（2 × 100 mg/kg/天，持续 40 天）显著降低了 TT 肿瘤荷瘤小鼠的血浆降钙素水平（与对照组相比，P = 0.01）。降钙素水平与肿瘤重量呈显著线性相关（r = 0.95，P<0.001）[2]。

细胞增殖实验（TPC-1、NPA、K1、Nthy-ori 3-1）：将细胞接种于6孔或96孔板中，用RPI-1或溶剂（DMSO，终浓度0.5%）处理72小时或更长时间。采用胰蛋白酶消化和库尔特计数器或磺基罗丹明B比色法测定细胞密度。IC50值根据剂量反应曲线计算[1]。

- 非锚定依赖性生长实验（软琼脂）：将细胞悬液（15,000个细胞/mL）置于含有0.33%琼脂糖的培养基中，并加入RPI-1或溶剂，然后铺于0.5%琼脂糖底层上。 8-10天后，对菌落进行染色和计数[2]。

- 细胞周期分析：用RPI-1（60 μM，72 h）处理TPC-1细胞，然后用70%乙醇固定，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术进行分析。对于细胞周期蛋白B1双参数分析，细胞先用抗细胞周期蛋白B1抗体染色，再用FITC标记的二抗染色，最后用碘化丙啶复染[1]。

- 免疫沉淀和蛋白质印迹：细胞用SDS上样缓冲液或Triton X-100裂解缓冲液裂解。蛋白质浓度用BCA法测定。对于免疫沉淀，将提取物（0.5-5 mg蛋白质）与抗Ret或抗PLCγ抗体和蛋白A-琼脂糖孵育。免疫沉淀物或全细胞裂解物（30-60 μg）经 SDS-PAGE 电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，并用针对磷酸酪氨酸、Ret、Shc、PLCγ、pY1062-Ret、pAKT、pERK 等的抗体进行探针检测。膜经剥离后重新探针检测总蛋白[1][2]。

- 端粒酶活性测定 (TRAP)：制备细胞提取物，并使用 [32P] 标记的 TS 引物，通过端粒重复序列扩增法测定端粒酶活性。产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用内标 (ITAS) 和 TSR8 定量标准品进行密度分析定量。结果以相对于未处理对照组的抑制百分比表示[1]。

- 端粒酶组分的RT-PCR：提取总RNA，进行逆转录，并使用hTR、TEP1、hTERT和β-actin的特异性引物进行扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭染色显影[1]。

8～11周龄雌性无胸腺裸鼠CD-1（携带TT细胞）[2]
50、100 mg/kg
口服；每日两次，持续10天

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异种移植模型：将人TT甲状腺髓样癌细胞（1.6 × 10⁷）皮下接种到8～11周龄雌性无胸腺裸鼠CD-1的右侧腹部。当肿瘤可测量时（平均约50 mg，接种后约25天）开始治疗[2]。

- 药物配制和给药：RPI-1溶于无水乙醇和Cremophor EL（各占最终体积的5%）中，于4℃搅拌至澄清，然后用冷的0.9% NaCl溶液稀释（占最终体积的90%）。最终浓度为3.3 mg/mL。药物通过灌胃法口服给药，每日两次（每12小时一次），剂量为2 × 50或2 × 100 mg/kg/天。对照组小鼠接受赋形剂（乙醇：Cremophor EL：0.9% NaCl = 5:5:90）[2]。

- 肿瘤测量：每周两次使用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤重量（mg）计算公式为(d² × D)/2，其中d和D分别为最短直径和最长直径，假设密度为1。肿瘤重量抑制率（%）= 100 – (治疗组平均肿瘤重量 / 对照组平均肿瘤重量 × 100)[2]。

- 降钙素测定：在麻醉状态下通过眼眶穿刺采集血液。使用两种不同的抗人降钙素抗体，通过免疫放射测定法测定血浆降钙素水平[2]。

[1]. Inactivation of Ret/Ptc1 oncoprotein and inhibition of papillary thyroid carcinoma cell proliferation by indolinone RPI-1. Cell Mol Life Sci. 2003;60(7):1449-1459.

[2]. Cellular effects and antitumor activity of RET inhibitor RPI-1 on MEN2A-associated medullary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst. 2004;96(13):1006-1014.

RPI-1（1,3-二氢-5,6-二甲氧基-3-[(4-羟基苯基)亚甲基]-H-吲哚-2-酮，曾用名Cpd1）是一种2-吲哚啉酮衍生物，被鉴定为Ret酪氨酸激酶抑制剂。此前研究表明，它能抑制NIH3T3成纤维细胞中Ret/Ptc1的转化活性[1][2]。

- 该化合物抑制Ret的自身磷酸化并降低Ret的表达，可能通过蛋白酶体介导的降解途径（与相关抑制剂类似）[2]。

- RPI-1对RET转化细胞的选择性高于H-RAS转化细胞或正常细胞。它对乳头状甲状腺癌（RET/PTC1）和髓样甲状腺癌（MEN2A相关RET突变体）模型均有效[1][2]。

- 抗肿瘤疗效、口服生物利用度（尽管较低）和耐受性支持RPI-1治疗RET驱动的甲状腺癌（尤其是对传统化疗反应不佳的髓样甲状腺癌）的治疗潜力[2]。

C17H15NO4

297.31

297.1

C, 68.68; H, 5.09; N, 4.71; O, 21.53

269730-03-2

269730-03-2

1749978

Yellow to brown solid powder

1.3±0.1 g/cm3

533.6±50.0 °C at 760 mmHg

276.5±30.1 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.660

3.08

67.79

2

4

3

22

442

0

OC1C=CC(/C=C2/C3C(=CC(OC)=C(OC)C=3)NC/2=O)=CC=1

JGSMCYNBVCGIHC-QPEQYQDCSA-N

InChI=1S/C17H15NO4/c1-21-15-8-12-13(7-10-3-5-11(19)6-4-10)17(20)18-14(12)9-16(15)22-2/h3-9,19H,1-2H3,(H,18,20)/b13-7-

(3Z)-3-[(4-hydroxyphenyl)methylidene]-5,6-dimethoxy-1H-indol-2-one

RPI1; RPI 1; RPI-1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 59~125 mg/mL (198.5~420.4 mM)
Ethanol: ~2 mg/mL (~6.7 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (7.00 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。