SB225002

^125I-IL-8-CXCR2 ( IC50 = 22 nM )

体外活性：在体外，SB225002抑制 GROα 刺激的钙动员，并有效抑制 IL-8 和 GROα 诱导的人和兔中性粒细胞趋化性。 SB 225002 显着降低磷酸化 ERK1/2 的水平，并降低 WHCO1 细胞的细胞增殖。 SB225002 还显示出作为微管抑制剂的抗肿瘤活性。激酶测定：在 96 孔微量滴定板中进行测定，其中反应混合物含有 1.0 μg/ml 膜蛋白，溶于 20 mM Bis-Tris-丙烷（pH 8.0），并含有 1.2 mM MgSO4、0.1 mM EDTA、25 mM NaCl 和 0.03以指定浓度添加 % CHAPS 和 SB 225002（Me2SO 中的 10 mM 库存），在标准结合条件下，最终 Me2SO 浓度<1%。通过添加 0.25 nM 125I-IL-8 (2,200 Ci/mmol) 启动结合。在室温下孵育 1 小时后，使用 Tomtec 96 孔收集器将板收集到用 1% 聚乙烯亚胺、0.5% BSA 封闭的玻璃纤维滤垫上，并用 25 mM NaCl、10 mM Tris·HCl、1 mM 洗涤 3 次MgSO4、0.5 mM EDTA、0.03% CHAPS、pH 7.4。将过滤器干燥，密封在含有 10 ml Wallac 205 Betaplate 液体闪烁液的样品袋中，并用 Wallac 1205 Betaplate 液体闪烁计数器进行计数。细胞测定：最初从原发性食管鳞状细胞癌手术活检中建立的三种食管鳞状细胞癌细胞系 WHCO1、WHCO5 和 WHCO6 在含有 10% FCS 的 DMEM 中于 37°C、5% CO2 的湿润气氛中培养。 MTT 测定使用细胞增殖试剂盒 I 进行。简而言之，将 1.5 × 103 个细胞铺在 96 孔板中，每孔终体积为 180 μL DMEM。将 SB 225002（CXCR2 拮抗剂，400 nM）添加到细胞中，并添加 0.001% DMSO（溶剂）作为对照。在指定的孵育期后，向每孔中添加 18 μL MTT 标记试剂（终浓度 0.5 mg/mL），并在潮湿气氛中孵育 4 小时。将 180 微升溶解溶液添加到每个孔中，并将板在 37°C 下放置过夜。使用微量滴定板读数器在 595 nm 处测量样品的分光光度吸光度。

---

---

通过高通量筛选和化学优化发现了一种选择性抑制CXCR2的化学先导物SB225002（N-（2-羟基-4-硝基苯基）-N’-（2-溴苯基）脲）是第一个报道的强效选择性非肽趋化因子受体抑制剂。它是125I-IL-8与CXCR2结合的拮抗剂，IC50=22 nM。SB 225002的选择性比CXCR1和其他四种7-TMR高出150倍以上。在体外，SB 225002能有效抑制IL-8和GROα诱导的人和兔中性粒细胞趋化性
为了确定用非肽、低分子量拮抗剂靶向单个IL-8受体的可行性，使用125I-IL-8结合CHO-CXCR1或CHO-CXCR2细胞膜进行高通量筛选。从该筛选中鉴定出的一种化合物是SK&F 83589（图1A），其选择性抑制125I-IL-8与CHO-CXCR2的结合，IC50为500 nm。SK&F 83589的化学修饰导致SB 225002，N-（2-羟基-4-硝基苯基）-N′-（2-溴苯基）脲（图1B），其抑制125I-IL-8与CHO-CXCR2膜的结合，IC50=22 nm（图2）。SB 225002在高达3.3μm的浓度下（图2），未能显著抑制125I-IL-8与CHO-CXCR1或[3H]fMLP、[3H]LTB4、[3H]LTD4或125I-C5a与其同源受体的结合<因此，与其他测试的7-TMR相比，SB225002对CXCR2的选择性至少是>150倍
为了确定SB225002是否是一种功能性CXCR2拮抗剂，我们监测了它对IL-8或GROα刺激的细胞内钙动员的影响。对Me2SO分化的HL60细胞的交叉脱敏研究表明，这些细胞主要表达CXCR2（约80%），CXCR1受体数量较少（约20%）（图3A）。在这些细胞中，SB 225002对IL-8和GROα介导的钙动员产生了浓度依赖性的抑制作用，IC50值分别为8和10 nm（图3B）。同样，在用CXCR2稳定转染的3ASubE细胞中，SB 225002剂量依赖性地抑制了GROα和IL-8诱导的钙动员，IC50值分别为20和40 nm（图3B）。与HL60细胞相比，人中性粒细胞在其细胞表面表达相同数量的CXCR1和CXCR2。在这些细胞中，SB 225002抑制GROα-，但不抑制IL-8-，刺激钙动员（IC50值分别为30 nm和>10μm，图3C）。此外，在用CXCR1稳定转染的RBL-2H3细胞中，SB 225002未能抑制IL-8或LTD4诱导的钙动员（IC50>10μm，图3C）。SB 225002未能阻断IL-8诱导的人中性粒细胞钙动员，这可能反映了IL-8通过激活CXCR1来绕过CXCR2阻断的能力，而CXCR1不受该化合物的抑制。SB 225002也表现出功能选择性，因为它未能抑制PMNs中LTB4（图3C）或单核细胞中RANTES、MIP-1α或MCP-1（数据未显示）的最佳浓度诱导的钙动员。 [1]

---

RObeta通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）途径增强EGR-1的转录，该途径可被CXCR2的特异性拮抗剂（SB 225002）或GRObeta的特异性抗体阻断。用SB 225002处理的WHCO1细胞显示出40%的细胞增殖减少。[2]

---

SB225002（SB）是一种IL-8受体B（IL-8RB）拮抗剂，其先前已显示可抑制基于IL-8的癌症细胞侵袭，并具有体内抗炎和抗伤害作用。本研究提供了SB225002/SB在一组不同来源的p53毛人癌症细胞系中的细胞周期靶向活性的证据，并研究了潜在的分子机制。细胞周期分析、免疫细胞测定、免疫印迹和RNA干扰的结合表明，SB诱导了BubR1依赖性有丝分裂阻滞。从机制上讲，SB被证明具有微管失稳活性，这可以通过Bcl2和BclxL的过度磷酸化、微管聚合的抑制和前β相阻滞的诱导来证明。分子对接研究表明，SB对β-微管蛋白亚基上的长春花碱结合位点具有良好的亲和力。值得注意的是，SB265610是SB225002的紧密结构类似物，具有强效的IL-8RB拮抗活性，但没有表现出类似的抗有丝分裂活性。重要的是，在P-糖蛋白过表达的NCI/Adr-Res细胞中，SB的抗肿瘤活性不受多药耐药性的影响。有趣的是，SB诱导的细胞死亡机制是细胞系依赖性的，在浸润性肝细胞癌HLE细胞中，BAK依赖性线粒体凋亡的显著贡献得到了证实。相反，SB激活了结直肠腺癌细胞SW480中的p38 MAPK信号传导，对p38 MAPK活性的药物抑制揭示了其在介导SB诱导的胱天蛋白酶非依赖性细胞死亡中的关键作用。总之，本研究介绍了SB作为一种有前景的抗肿瘤剂，它具有通过微管靶向和干扰IL-8驱动蛋白癌症进展的双重机制发挥其活性的潜力。[3]

---

CXCR2 siRNA或拮抗剂对ICC细胞增殖的影响[4]
在体外评估了siRNA或拮抗剂（SB225002）对ICC细胞增殖的CXCR2抑制作用。在施用CXCR2-siRNA 3天后收获细胞，并通过结晶紫染色程序进行计数。与对照组相比，CXCR2 siRNA显著抑制了RBE（P=0.009）和SSP25细胞（P=0.01）中ICC细胞的增殖（图2，A和B左）。CXCR2的抑制也使用CXCR2拮抗剂SB225002进行。在SB225002给药后3天收获ICC细胞，并使用相同的方法进行计数。SB225002和siRNA一样抑制RBE（P=0.03）和SSP25（P=0.02）细胞中ICC细胞的增殖（图2，A和B右侧）。 CXCR2 siRNA或拮抗剂对ICC细胞迁移的影响[4]
在伤口试验中，对照组的两种ICC细胞系在24小时内从最初的粘附部位迁移到板上。相反，与对照组相比，CXCR2 siRNA和SB225002都抑制了细胞迁移（图2，C，左图显示了RBE细胞的代表性结果）。对10个高倍视野（×200）中迁移的细胞数量进行计数的结果显示，与对照组相比，CXCR2 siRNA和SB225002均抑制ICC细胞迁移，差异具有显著性（图2，C，右图；RBE中的siRNA，P=0.04；RBE的SB225002，P=0.018；SSP25中的siRNA（P=0.004）；SSP225中的SB225000，P=0.001）。

在兔子中，SB225002 选择性阻断 IL-8 诱导的中性粒细胞边缘化。在小鼠肝内胆管细胞癌模型中，SB225002（1 mg/kg ip）可抑制移植皮下肿瘤的生长。此外，SB225002 还表现出持久的抗伤害作用，并减少小鼠模型中 TNBS 诱发的结肠炎。

---

在体内，SB225002选择性阻断IL-8诱导的兔中性粒细胞边缘化。[1]
在兔子中，静脉注射LTB4或其他趋化因子会迅速促进中性粒细胞的形状变化和中性粒细胞向肺微毛细血管内皮细胞的边缘化（27，30，31，32）。因此，这是研究中性粒细胞活化和附着到内皮的初始阶段的有用模型的基础。如图5、A和B所示，IL-8或fMLP的给药导致中性粒细胞快速边缘化（分别为62%和68%），并持续整个输注期（30分钟）。SB 225002的联合给药（图5，A和B）以剂量依赖的方式抑制了IL-8-介导的PMN隔离，但没有抑制fMLP-介导的中性粒细胞隔离（图5C）。

---

皮下SSP25细胞瘤的生长抑制[4]
雄性BALB/c裸鼠侧腹皮下注射5×106个SSP25细胞。在癌症细胞注射后7天，通过腹膜内注射每2天一次给予1mg/kg的SB225002（n＝4）或DMSO（0.001%）作为对照（n＝四），直到癌症细胞注射后28天。SB225002对肿瘤的生长抑制如图2，E所示。尽管在SB225002组中没有发现肿瘤完全消失，但SB225002注射显著抑制了肿瘤生长。对照组未观察到抑制作用（21天时P=0.02，28天时P=0.021）。

---

本研究评估了选择性和非肽CXCR2拮抗剂SB225002在小鼠疼痛模型中的镇痛作用。正如在不同的自发伤害感受测试中所评估的那样，腹腔注射（i.p.）SB225002会导致醋酸诱导的腹部收缩的一致和剂量相关的减少，而它对福尔马林、辣椒素、谷氨酸或佛波酯乙酸酯（PMA）引起的伤害感受没有显著影响。SB225002的全身治疗显著降低了8-溴-cAMP（8-Br-cAMP）诱导的自发伤害感受，或前列腺素E（2）（PGE（2））、肾上腺素或角质形成细胞衍生趋化因子（KC）诱导的机械性高伤害感受。在角叉菜胶模型中，当通过腹腔注射、鞘内注射（i.t.）或侧脑室注射（i.c.v.）途径给药时，SB225002显著降低了机械性痛觉过敏，甚至当与角叉菜聚糖共同给药到小鼠爪中时，表明SB225002的外周和中心作用位点。此外，腹腔注射SB225002显著减轻了角叉菜胶注射后MPO活性的增加或IL-1β、TNF-α或KC水平的升高。在完全弗氏佐剂（CFA）或坐骨神经部分结扎（PLSN）诱发的持续疼痛模型中，反复服用SB225002显示出显著而持久的镇痛作用。值得注意的是，SB225002没有引起非特异性的中枢效应，正如在开放场和旋转杆测试中评估的那样，甚至在热刺激的潜伏期反应中也没有。我们的数据证实了之前关于趋化因子在疼痛中发挥关键作用的观点，表明选择性CXCR2拮抗剂，如SB225002，可能很好地代表了治疗急性和慢性疼痛的有趣和创新的替代方案。[5]

---

尽管中性粒细胞与消除病原体密切相关，但过度募集可能会导致组织损伤。因此，在炎症过程中减少细胞内流可能是治疗炎症性肠病（IBD）的潜在靶点。由于CXCR2参与中性粒细胞迁移，本研究旨在评估选择性CXCR2拮抗剂SB225002的全身治疗是否能改善2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）在小鼠中诱导的实验性结肠炎。结肠炎建立后（24小时），用SB225002治疗小鼠。在随后的时间点，长达72小时，监测小鼠的体重减轻和总体死亡率。在处死时，对结肠组织进行宏观和微观损伤评分，并分析细胞因子水平、髓过氧化物酶（MPO）活性和蛋白质表达。TNBS给药引起结肠组织的宏观和微观损伤，在大多数情况下导致动物死亡。SB225002的治疗显著降低了所有分析的参数，从而改善了炎症症状。SB225002降低了中性粒细胞内流、MPO活性、IL-1β、MIP-2和角质形成细胞衍生的趋化因子（KC）水平，以及血管内皮生长因子、诱导型NO合酶和环氧化酶-2蛋白在结肠组织中的表达。用SB225002治疗的动物结肠中IL-4和IL-10的水平显著升高。此外，用小鼠抗KC的治疗性治疗显著降低了MPO活性和结肠损伤。这些结果共同表明，选择性阻断CXCR2可以持续减少TNBS诱导的结肠炎，表明使用SB225002是治疗IBD和其他相关炎症性疾病的潜在治疗方法[6]。

CHO-CXCR1 和 CHO-CXCR2 有现成的膜。实验在 96 孔微量滴定板中进行，其中含有 1.0 μg/mL 膜蛋白，溶于 20 mM Bis-Tris-丙烷（pH 8.0）和 1.2 mM MgSO₄、0.1 mM EDTA、25 mM NaCl ，以及按指定浓度添加 0.03% CHAPS 和 SB225002（Me₂SO 中的 10 mM 库存）。标准结合条件下，Me₂SO终浓度小于1%。添加 0.25 nM ¹²⁵I-IL-8 (2,200 Ci/mmol) 后，开始结合。在室温下孵育一小时后，将板收获到用 1% 聚乙烯亚胺和 0.5% BSA 封闭的玻璃纤维过滤垫上。然后使用 25 mM NaCl、10 mM Tris•HCl、1 mM MgSO₄、0.5 mMEDTA、0.03% CHAPS 和 pH 7.4 将板清洗三次。干燥后将过滤器密封在装有10 mL Wallac 205 Betaplate液体闪烁液的样品袋中，并使用Wallac 1205 Betaplate液体闪烁计数器对结果进行计数。

---

微管蛋白聚合测定[3]
根据制造商的说明使用基于荧光的微管蛋白聚合分析试剂盒。展示了4个独立实验的代表。 通过小干扰RNA和拮抗剂敲除抑制CXCR2[4]
通过2种策略抑制CXCR2。在体外使用小干扰RNA（siRNA）沉默CXCR2基因表达。用CXCR2-siRNA质粒（20mmol/L；和Lipofectamine 2000）的混合物转染ICC细胞。转染后24小时，用含有5%胎牛血清的新鲜培养基替换培养基，转染后≤72小时。作为CXCR2-siRNA的对照，通过相同的方法转染隐形RNAi-siRNA阴性对照双链SB225002是CXCR2的小分子拮抗剂，用于在下文所述的小鼠模型中体外和体内抑制CXCR2。0.001%二甲亚砜（DMSO）用作溶剂对照。

三种食管鳞状细胞癌细胞系 - WHCO1、WHCO5 和 WHCO6 - 在含有 10% FCS 的 DMEM 中于 37°C、5% CO₂ 的湿润气氛中培养。这些细胞系最初是通过原发性食管鳞状细胞癌的手术活检建立的。要进行 MTT 测定，请使用细胞增殖试剂盒。在 96 孔板中，将 1.5×10³ 细胞铺板，每孔终体积为 180 μL DMEM。使用 400 nM SB 225002 处理细胞，并添加 0.001% DMSO（溶剂）作为对照。在指定的孵育时间后，每孔加入 18 μL MTT 标记试剂（终浓度 0.5 mg/mL），然后在潮湿环境中孵育 4 小时。将溶解溶液以 180,000 微升的体积倒入每个孔中，然后将板在 37°C 下放置过夜。使用微量滴定板读数器测量样品在 595 nm 处的分光光度吸光度。

---

抑制Ca2+动员[1]
采用Hypaque-Ficoll一步法从健康志愿者的全血中分离出人中性粒细胞。在孵育条件下，用Me2SO（0.5%）分化HL60细胞3天。如前所述，用Fura-2AM装载细胞（PMN、HL60、CXCR1-RBL-2H3或3ASubE）。对于拮抗剂研究，以指定浓度将SB225002（最终Me2SO<0.35%）添加到Krebs-Ringer Henseleit缓冲液中的106个细胞/ml中，15秒后添加指定浓度的激动剂。如前所述，对激动剂刺激后达到的最大钙浓度进行了定量。

---

中性粒细胞趋化性的抑制[1]
用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤中性粒细胞两次，并重新悬浮在含有1mm MgCl2和1mmCaCl2的PBS中。如所述，使用改良的Boyden室程序测定细胞运动 为了测量趋化性，下腔室填充30μl IL-8（1nm）或GROα（10nm），将空的上腔降低到位，并以指定浓度加入50μl PMN悬浮液（5×106个细胞/ml），不含（对照）或含有SB225002以10mg/ml的浓度溶解在Me2SO（100%）中，在PBS中稀释至所需浓度；最终Me2SO浓度<0.1%。中性粒细胞在37°C的细胞培养箱中迁移60分钟，然后拆卸培养箱。在固定（75%甲醇）和染色（Diff-Quick）后，在四个连续的高功率场（HPF）中对迁移的细胞进行计数。

---

细胞增殖、创伤和侵袭试验[4]
ICC细胞系、RBE和SSP25（3×104）被CXCR2 siRNA（20 mmol/l）或CXCR2拮抗剂（SB225002，50 nm/l）抑制。在施用抑制剂后3天收获细胞，并通过结晶紫染色程序进行计数。空siRNA（20mmol/L）或DMSO（0.001%）用作对照。之前已经描述了侵袭和伤口检测。23对于伤口检测，RBE和SSP25细胞的CXCR2被CXCR2 siRNA或SB225002抑制。生长24小时后，用无菌剃须刀片刮掉每个板一半上的细胞。用磷酸缓冲盐水洗涤剩余细胞3次，并用无血清RPMI孵育24小时。最后，将细胞固定在平板上，用苏木精和伊红染色。随机选取10个高功率场（×200），2名研究人员统计迁移癌症细胞的数量。将CXCR2-siRNA抑制CXCR2的RBE和SSP25细胞加入Matrigel侵袭室的内杯。经过22小时的培养后，估计会发生入侵。

小鼠：7-8周龄雄性野生型（C57BL/6J，Harlan）和ApoE^−/−小鼠，均饲养于相同的C57BL/6背景下，在进行左侧大脑中动脉闭塞（MCAO）20分钟或假手术前，分别给予正常饮食或高胆固醇饮食6周。动物接受的治疗方案随机分配，实验人员在整个干预和数据分析过程中均采用盲法。缺血后0、24和48小时，分别腹腔注射（ip）载体（1% DMSO PBS溶液）或选择性CXCR2拮抗剂SB225002（2 mg/kg）。在其他研究中，分别于缺血后0小时、24小时和48小时，腹腔注射300 μL中和性兔抗CXCR2血清，特异性阻断CXCR2。在后续研究中，使用正常兔血清（NRS）作为对照。在某些实验中，于缺血前24小时和缺血后24小时，腹腔注射200 μg抗小鼠Ly6G抗体以清除中性粒细胞。在这些实验中，使用200 μg同型对照抗体作为对照。大鼠：在本研究中，每只母鼠产下10-12只Sprague-Dawley大鼠幼崽。将溶于含0.33% Tween 80的生理盐水（NS）中的SB225002（1或3 mg/kg）或载体（含0.33% Tween 80的生理盐水）腹腔注射到幼鼠体内，注射时间为脂多糖（LPS）给药前30分钟和缺氧缺血（HI）后立即进行。幼鼠随机分为四组：载体组（LPS给药前30分钟和HI后立即注射生理盐水，n=18）、SB-1组（1 mg/kg，n=14）和SB-3组（3 mg/kg，n=18）（LPS给药前30分钟和HI后立即注射SB225002）。

---

\n\n体内中性粒细胞滞留抑制[1]
\n如前所述，在兔体内建立了中性粒细胞滞留模型。采用无菌技术，通过手术将导管植入兔的颈外静脉。在有或无SB225002（1.39–5.5 μg/kg/min）的情况下，通过耳缘静脉将IL-8（150 ng/kg/min）或fMLP（5 ng/kg/min）直接输注到血液中。每隔2.5–5分钟，通过颈外静脉的血管通路端口抽取血样。使用库尔特计数器测定白细胞计数，并使用Diff-Quick染色血涂片进行分类计数。PMN计数的百分比变化相对于基线值计算。\n

---

\n\n实验动物模型[3]
\n6–7周龄的雄性Balb/c裸鼠购自日本CLEA公司，用于构建皮下肿瘤模型。将密度为 5 × 10⁶ 个的 SSP25 细胞注射到每只小鼠侧腹部的某一部位。注射癌细胞 7 天后，分别腹腔注射 1 mg/kg 的 CXCR2 拮抗剂 SB225002（n = 4）或 DMSO (0.001%)（n = 4），每 2 天注射一次，直至注射癌细胞后 35 天。每周使用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积采用公式：体积 = 宽度² × 长度 × 0.5² 计算。所有小鼠均饲养于无特定病原体的条件下，本研究中所有实验动物研究方案均已提交兵库医科大学实验动物审查委员会并获得批准。\n

---

\n\n醋酸诱导的腹部收缩[5]
\n根据先前描述的方法（Vaz等人，1996），通过腹腔注射（ip）醋酸（0.6%）诱导腹部收缩。在注射醋酸前30分钟，分别给予动物不同剂量的SB225002（0.1–1 mg/kg，腹腔注射）或溶剂（10 ml/kg，1% Tween 80的0.9% NaCl溶液）。对动物进行单独观察，并在注射醋酸后20分钟内累计计数腹部收缩次数，以此作为伤害感受的指标。以二吡酮（60 mg/kg，腹腔注射，30 分钟）作为阳性对照药物。\n

---

\n\n福尔马林诱导的伤害性感受[5]
\n所用方法与之前描述的方法类似（Mendes 等，2000）。在注射福尔马林前 30 分钟，动物接受SB225002（1 或 3 mg/kg，腹腔注射）或载体（10 ml/kg，1% Tween 80 的 0.9% NaCl 溶液）处理。随后，小鼠右后爪足底注射 20 μl 2.5% 福尔马林溶液。将动物立即放入直径为 20 cm 的玻璃圆筒中，并在 30 分钟内观察其舔舐注射爪的时间，以此作为伤害感受的指标。\n

---

\n\n显性伤害感受模型 [5]
\n在其他自发性伤害感受小鼠模型中进一步评估了 SB225002 的作用。为此，在注射致痛剂前 30 分钟，预先给予动物 SB225002（1 或 3 mg/kg，腹腔注射）或载体（10 ml/kg，1% Tween 80 的 0.9% NaCl 溶液）。小鼠接受 20 μl 的足底注射。将以下试剂之一注射到右后爪：辣椒素（5.2 nmol/爪；Sakurada等人，1992）、谷氨酸（30 μmol/爪；Beirith等人，2002）、佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）（30 ng/爪；Taniguchi等人，1997）或8-溴-cAMP（10 nmol/爪；Otuki等人，2005）。将动物单独置于透明玻璃圆筒（直径20 cm）中，分别观察注射辣椒素后5分钟、谷氨酸后15分钟、PMA后45分钟或8-溴-cAMP后10分钟的反应。用计时器记录舔舐注射爪的时间，并将其视为伤害感受的指标。\n

---

\n\nKC、PGE2 或肾上腺素诱导的机械性痛觉过敏[5]
\n为了评估机械性痛觉过敏，在小鼠接受SB225002（1 mg/kg，腹腔注射）或载体（10 ml/kg，1% Tween 80 的 0.9% NaCl 溶液）处理，30 分钟后，在小鼠足底注射 KC（10 ng/爪，Cunha 等，2005）、前列腺素 E2 (PGE2)（0.1 nmol/爪，Kassuya 等，2007）或肾上腺素（100 ng/爪，Khasar 等，2005）。如下所述，在足底注射致痛介质后的不同时间点，使用冯·弗雷丝（VFH）测量机械性痛觉过敏。\n

---

\n\n角叉菜胶诱导的机械性痛觉过敏[5]
\n为了诱导炎症性疼痛，小鼠右后爪皮下注射50 μl角叉菜胶（300 μg/爪）（Quintão等人，2005）。为了评估药物治疗的全身效应，小鼠在注射角叉菜胶前30分钟腹腔注射SB225002（0.1–3 mg/kg）或载体（10 ml/kg，1% Tween 80的0.9% NaCl溶液）。为了评估SB225002可能的作用部位（中枢或外周），另一组动物接受了足底注射SB225002（35–106 μg/爪），并同时注射角叉菜胶（300 μg/爪）。另一些动物在注射角叉菜胶前10分钟，接受了鞘内注射（it）或脑室内注射（icv）5 μl SB225002（3.5–35 μg/注射部位）。鞘内注射按照Hylden和Wilcox（1980）描述的方法进行，并进行了一些修改。为避免麻醉剂的干扰，鞘内注射时动物处于清醒状态。通过聚乙烯管连接微量注射器的针头经皮肤插入，将5 μl载体溶液（对照组）或SB225002注射到L5-L6椎间隙。对于脑室内注射，动物用异氟烷轻度麻醉，并将5 μl SB225002溶液直接注射到侧脑室（坐标：距前囟1 mm，侧方1 mm，垂直3 mm），如Laursen和Belknap（1986）所述。所有组的机械性痛觉过敏均通过VFH进行评估，持续至角叉菜胶给药后24小时，具体方法如下。\n

---

\n\n完全弗氏佐剂（CFA）诱导的机械性痛觉过敏[5]
\n为了产生持续的炎症反应，小鼠接受20 μl皮下注射（i.pl.）将 CFA（1 mg/ml 热灭活干燥的结核分枝杆菌；每毫升溶剂含 0.85 ml 石蜡油和 0.15 ml 甘露醇单油酸酯）注射到右后爪（Quintão 等，2005）。为了观察重复给药的效果，将 SB225002（1 mg/kg）口服，每日两次（每次 12 小时），持续 7 天。每天首次给药后 6 小时，使用 VFH 评估机械性痛觉过敏。对照组动物接受载体（10 ml/kg，1% Tween 80 的 0.9% NaCl 溶液），采用与 SB225002 相同的治疗方案。\n

---

\n\n坐骨神经部分结扎术 (PLSN) 的手术操作 [5]
\n为了评估神经性疼痛样行为，所采用的手术方法与 Quintão 等人 (2005) 描述的方法类似。小鼠用 7% 水合氯醛（8 ml/kg；腹腔注射）麻醉。PLSN 手术方法是用 8.0 丝线结扎坐骨神经背侧 1/3 至 1/2。在假手术对照组中，仅暴露坐骨神经而不进行结扎。经过一段恢复期（术后4天），接受PLSN手术的动物接受全身性SB225002（1 mg/kg，腹腔注射）或赋形剂（10 ml/kg，含0.9% NaCl的Tween 80溶液）治疗，每日两次（每次12小时），持续5天，然后在治疗后6小时内使用von Frey毛发（VFH）进行评估。\n

---

\n\nvon Frey毛发诱导的后爪缩回反应[5]
\n为了评估机械性痛觉过敏，将小鼠单独放置在透明的有机玻璃盒（9 × 7 × 11 cm）中，盒子置于架高的金属网平台上，以便接触到小鼠右后爪的腹侧。使用von Frey毛发（VFH，Stoelting，Chicago，IL，USA）进行10次刺激（每次持续1秒），测量缩回反应的频率。刺激从下方施加于右后爪足底。动物在行为测试前适应环境30分钟，并在多个时间点评估机械性痛觉过敏。0.6 g的VFH（垂直力刺激）产生的平均缩爪频率约为15%，这被认为是测量机械性痛觉过敏的合适值（Quintão等人，2005）。因此，本研究全程使用0.6 g的VFH。为了确定基础机械阈值，所有组在测试或手术操作前均进行了评估。\n

---

\n\n髓过氧化物酶（MPO）活性[5]
\n根据先前描述的方法（Cunha等人，2005），通过组织髓过氧化物酶（MPO）活性间接评估中性粒细胞向小鼠爪的募集。为此，动物经腹腔注射SB225002（0.1–3 mg/kg）处理30分钟后，在其右爪皮下注射50 μl角叉菜胶（300 μg/爪）。注射生理盐水的爪子作为对照。注射角叉菜胶6小时后处死动物。取出爪子皮下组织，在5% (w/v) EDTA/NaCl缓冲液（pH 4.7）中匀浆，并在4℃下以10,000 rpm离心15分钟。将沉淀物重悬于0.5%十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（pH 5.4）中，并将样品在液氮中反复冻融三次。解冻后，样品再次离心（10,000 rpm，15 分钟，4 °C），取 25 μl 上清液进行 MPO 测定。酶促反应采用 1.6 mM 四甲基联苯胺、80 mM NaPO4 和 0.3 mM 过氧化氢进行检测。在 650 nm 处测定吸光度，结果以每毫克组织的 OD 值表示。\n

---

\n\n小鼠爪中 IL-1β、TNFα 或 KC 水平的测定 [5]
\n根据 Cunha 等人 (2005) 描述的方法测定促炎细胞因子 IL-1β、TNFα 或 KC 的组织水平。动物经腹腔注射SB225002（0.1–3 mg/kg）处理后，30分钟后，在其右爪皮下注射50 μl角叉菜胶（300 μg/爪）。注射角叉菜胶6小时后处死小鼠。注射生理盐水的爪子作为对照。将组织置于含有 0.4 M NaCl、0.1 M PMSF、10 mM EDTA、0.05% Tween 20、0.5% BSA 和 2 mg/ml 抑蛋白酶的 PBS 缓冲液（PBS；pH 7.4；NaCl 137 mM、KCl 2.7 mM、Na2HPO4 8.1 mM、KH2PO4 1.5 mM）中，匀浆，以 3000g 离心 10 分钟，并储存在 -70 °C 直至进一步分析。根据制造商的建议，使用 ELISA 试剂盒评估细胞因子水平。\n

---

\n\n非特异性效应的测量[5]
\n为了排除SB225002对运动协调性、运动活性或反应潜伏期的可能非特异性效应，分别对小鼠进行了转棒试验、旷场试验和热板试验（Quintão 等，2005）。不同组别的动物预先接受 SB225002（1 和 3 mg/kg，腹腔注射）或载体（10 ml/kg，腹腔注射）处理，并进行所有测试。\n

---

\n\n动物处理[6]
\nN-(2-羟基-4-硝基苯基)-N9-(2-溴苯基)脲（SB225002）的合成方法如前所述。为了评估SB225002在实验性结肠炎中的潜在治疗效果，在诱导结肠炎24小时后，动物每天两次接受不同剂量的SB225002（0.1、0.3和1 mg/kg，腹腔注射）。在诱导结肠炎24小时或72小时后，分析宏观评分和髓过氧化物酶（MPO）活性。将最有效剂量（0.3 mg/kg）用于其他实验，例如细胞因子含量、COX-2、VEGF和iNOS蛋白表达的检测。采用类似的方案，使用阳性对照药物地塞米松（1 mg/kg，皮下注射）和抗小鼠KC抗体（30 μg/kg，静脉注射）。SB225002在使用前溶解于含0.33% Tween 80的0.9% NaCl溶液中，对照组小鼠接受该溶剂处理。

[1]. J Biol Chem. 1998 Apr 24;273(17):10095-8.

[2]. Cancer Res. 2006 Mar 15;66(6):3071-7.

[3]. Biochem Pharmacol. 2013 Jun 15;85(12):1741-52.

[4]. Surgery. 2014 Apr;155(4):640-9.

[5]. Eur J Pain. 2010 Jan;14(1):23-31.

[6]. J Leukoc Biol. 2008 Oct;84(4):1213-21.

SB225002 属于苯脲类化合物，其结构为脲，其中一个氨基被 (2-溴苯基)氨基取代，另一个氨基被 (2-羟基-4-硝基苯基)氨基取代。它是一种强效的 CXCR2 趋化因子受体拮抗剂 (IC50 = 22 nM)。SB225002 具有抗炎、抗肿瘤、镇痛、诱导细胞凋亡和拮抗 CXCR2 等多种药理活性。它是一种硝基苯酚，属于溴苯类和苯脲类化合物。

---

白细胞介素-8 (IL-8) 和与其密切相关的含谷氨酸-亮氨酸-精氨酸 (ELR) 的 CXC 趋化因子，包括生长相关癌基因 (GRO) α、GROβ、GROγ 和上皮细胞衍生中性粒细胞激活肽-78 (ENA-78)，是强效的中性粒细胞趋化和激活肽，被认为是炎症的主要介质。IL-8 通过与两种不同的七次跨膜 (7-TMR) G 蛋白偶联受体 CXCR1 (IL-8RA) 和 CXCR2 (IL-8RB) 结合来激活中性粒细胞，而 GROα、GROβ、GROγ 和 ENA-78 仅与 CXCR2 结合并激活 CXCR2。通过高通量筛选发现了一种选择性抑制CXCR2的先导化合物，并对其进行了化学优化。SB 225002（N-(2-羟基-4-硝基苯基)-N'-(2-溴苯基)脲）是首个报道的高效选择性非肽类趋化因子受体抑制剂。它能拮抗¹²⁵I-IL-8与CXCR2的结合，IC₅₀值为22 nM。SB 225002对CXCR1和其他四种受试的7-TMR的选择性超过150倍。体外实验表明，SB 225002能有效抑制IL-8和GROα诱导的人和兔中性粒细胞趋化作用。体内实验表明，SB 225002能选择性阻断IL-8诱导的兔中性粒细胞边缘化。本研究结果表明，CXCR2 负责 IL-8 诱导的中性粒细胞趋化和边缘化。这种选择性拮抗剂将成为研究 CXCR2 在中性粒细胞发挥重要作用的炎症性疾病中作用的有效工具化合物。[1]生长相关癌基因 (GRO) 是 CXC 趋化因子亚家族的成员，在炎症和伤口愈合中发挥重要作用。CXC 趋化因子已被发现与肿瘤发生、血管生成和转移相关。尽管已有报道称 GRO 在多种人类癌症中表达升高，但 GRO 及其受体 CXCR2 在食管癌中的表达和作用尚不清楚。本研究采用实时逆转录 PCR (RT-PCR) 和免疫组织化学方法，证实 GROα、GROβ 和 CXCR2 在食管肿瘤组织中表达上调。此外，GROα、GROβ 和 CXCR2 在 WHCO1 细胞系中组成型表达，WHCO1 是一种食管癌细胞系，本研究将其用作模型系统。GROβ 通过细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2) 通路增强 EGR-1 的转录，该通路可被 CXCR2 的特异性拮抗剂 (SB 225002) 或 GROβ 的特异性抗体阻断。经 SB 225002 处理的 WHCO1 细胞增殖减少了 40%。稳定的 WHCO1 GROα RNA 干扰 (RNAi) 克隆显示，实时 RT-PCR 检测显示 GROα mRNA 水平降低了 43%，荧光显微镜观察显示 GROα 水平降低，磷酸化 ERK1/2 水平降低了 60%。表达 GROβ RNAi 的稳定克隆显示 GROβ mRNA 水平降低 95% 以上，荧光显微镜观察显示 GROβ 水平降低，磷酸化 ERK1/2 水平降低 80%。此外，这些表达 GROα RNAi 和 GROβ RNAi 的克隆分别显示细胞增殖降低 20% 和 50%。我们的结果表明，GROα-CXCR2 和 GROβ-CXCR2 信号通路对食管癌细胞增殖有显著贡献，并且该自分泌信号通路可能参与食管肿瘤的发生。[2]

---

背景/目的：完全手术切除是治愈肝内胆管细胞癌 (ICC) 的唯一方法，但该疾病的预后极差。迫切需要一种新的治疗方法。 CXC趋化因子受体2 (CXCR2) 与人类癌症的肿瘤发生和转移密切相关。本研究旨在探讨阻断CXCR2对ICC生长的抑制作用。材料与方法：本研究采用人ICC细胞系RBE和SSP25评估CXCR2的作用。使用CXCR2小干扰RNA (siRNA) 和拮抗剂 (SB225002) 阻断CXCR2。通过增殖实验、迁移实验和侵袭实验验证阻断CXCR2的抑制作用。在无胸腺裸鼠皮下建立SSP25肿瘤模型，并给予小鼠SB225002。采用免疫组织化学染色法检测34例ICC标本中CXCR2的表达。我们研究了CXCR2表达与ICC预后的关系。结果：ICC中CXCR2高表达患者的预后显著较差（P = .004）。CXCR2 siRNA治疗显著抑制了RBE和SSP25细胞中CXCR2的表达。与对照组相比，CXCR2 siRNA和SB225002均显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭。SB225002还抑制了移植性皮下肿瘤的生长（P = .02）。结论：我们的结果表明，阻断CXCR2可显著抑制ICC的发生发展。阻断CXCR2可能是一种有前景的ICC治疗方法。[4]

---

在本研究中，我们发现SB225002在急性及持续性疼痛小鼠模型中均表现出显著的镇痛作用。众所周知，包括中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞和神经元在内的多种细胞类型均表达CXCR2配体或受体（Charo和Ransohoff，2006）。在本研究评估的不同实验模型中，这些细胞产生的趋化因子可能到达感觉神经末梢，导致伤害感受器敏化。此外，这些趋化因子也可能激活其他与疼痛产生相关的通路（White和Wilson，2008），例如PKA-cAMP通路激活或前列腺素和拟交感神经胺的释放。最后，外周部位的炎症和/或损伤与中枢神经系统中趋化因子及其受体的上调有关（Gosselin等，2008）。 SB225002 可能通过抑制 CXCR2 在上述任何水平的激活来阻断疼痛的产生，这一推测是合理的。综上所述，我们的研究结果扩展了趋化因子受体在疼痛变化中发挥关键作用的观点，并指出选择性 CXCR2 拮抗剂是很有前景的治疗选择。[5]

---

最后，SB225002 治疗引起的抗炎细胞因子（IL-4 和 IL-10）水平升高、IL-1β、MIP-2 和 KC 水平降低以及 iNOS、VEGF 和 COX-2 蛋白表达减少，极大地减轻了组织损伤和炎症迹象，最重要的是，显著提高了 TNBS 诱导的结肠炎小鼠的存活率。值得注意的是，SB225002 具有治疗作用；也就是说，它能够在炎症建立后减轻 TNBS 诱导的结肠炎。我们的数据不仅表明 CXCR2 是 IBD 治疗中一个有趣且有吸引力的靶点（目前针对 IBD 的疗法仍然不足），而且强烈表明选择性非肽 CXCR2 拮抗剂 SB225002 是治疗 IBD 的潜在候选药物。[6]

C13H10BRN3O4

352.14

350.985

C, 44.34; H, 2.86; Br, 22.69; N, 11.93; O, 18.17

182498-32-4

3854666

White solid powder

1.8±0.1 g/cm3

401.6±45.0 °C at 760 mmHg

196.7±28.7 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.765

4.36

107.18

3

4

2

21

390

0

O=C(NC1C(Br)=CC=CC=1)NC1C(O)=CC([N+](=O)[O-])=CC=1

MQBZVUNNWUIPMK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H10BrN3O4/c14-9-3-1-2-4-10(9)15-13(19)16-11-6-5-8(17(20)21)7-12(11)18/h1-7,18H,(H2,15,16,19)

1-(2-bromophenyl)-3-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)urea

SB225002; 182498-32-4; sb 225,002; 1-(2-bromophenyl)-3-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)urea; SB225,002; SB-225,002; N-(2-Bromophenyl)-N'-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)urea; N-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea; Urea, N-(2-bromophenyl)-N'-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)-; SB 225002; SB225002

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 2.08 mg/mL (5.91 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

配方 4 中的溶解度: 2% DMSO +Castor oil : 10mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。