SGX-523

c-Met (IC50 = 4 nM)
The sole target of SGX-523 is mesenchymal-epithelial transition factor (MET) tyrosine kinase, with ultra-high selectivity for MET over other kinases. Specific IC50 values:
- Recombinant human MET kinase: IC50 = 1.2 nM [1]
- MET (cellular activity, MET-amplified gastric cancer MKN-45 cells): IC50 = 15 nM [1]
- MET (cellular activity, MET-overexpressing lung adenocarcinoma H441 cells): IC50 = 20 nM [1]
- MET (cellular activity, MET-driven EBC-1 lung cancer cells): IC50 = 25 nM [1]
It shows no significant inhibition (IC50 > 1000 nM) against 200+ non-target kinases (e.g., EGFR, VEGFR2, PDGFRα, c-Kit, ALK) [1]

SGX-523 属于 c-Met/肝细胞生长因子受体 (HGFR) 酪氨酸激酶抑制剂类。 SGX-523 将 MET 稳定在其他蛋白激酶无法接近的独特非活性构象中，这解释了其选择性。 SGX523 有效抑制纯化的 MET 催化结构域，但不抑制密切相关的受体酪氨酸激酶 RON。 SGX523 表明 ATP 竞争性抑制，与活性较高的磷酸酶 [MET-KD(3P)，与活性较低的非磷酸化形式的 MET [MET-KD(0P)，Ki 为 2.7 nM] 相比，具有更高的表观亲和力。 Ki 为 23 nM]，这种现象与优先结合非活性酶构象一致。 SGX523 在纳摩尔浓度下抑制 MET 介导的信号传导、细胞增殖和细胞迁移，但对依赖于其他蛋白激酶（包括密切相关的 RON）的信号传导没有影响，即使在微摩尔浓度下也是如此。激酶测定：初始速率常数在 21 °C 下测量，存在 100 mM HEPES (pH 7.5)、0.3 mg/mL 聚 (Glu-Tyr) 肽底物、10 mM MgCl2、1 mg/mL 牛血清白蛋白、5 % DMSO、20 nM MET-KD 以及不同浓度的 ATP 和 SGX523。用 20 μL Kinase-Glo 检测缓冲液淬灭总反应体积 (20 μL)。在读板光度计中检测发光，并通过非线性回归分析结果。细胞测定：将 MDCK 细胞按每孔 1 × 103 接种到 24 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 和 MEM 和 10% 胎牛血清中孵育 1 周。添加 HGF (90 ng/mL) 和不同浓度的 SGX523，将细胞再孵育 18 小时（37 °C，5% CO2 湿润培养箱）并观察。将 A549 细胞铺板于 12 孔板（每孔 6 × 104）中并孵育至汇合以研究细胞迁移。通过用移液器尖端刮擦将通道引入单层中。在存在和不存在HGF (90 ng/mL)的情况下将化合物的各种稀释度添加到饥饿培养基中。24小时后检查孔的细胞迁移。

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1. 对MET驱动肿瘤的抗增殖活性:
- SGX-523强效抑制MET扩增胃癌细胞：MKN-45（IC50 = 15 nM）、NCI-N87（IC50 = 18 nM）[1]
- 对MET过表达肺腺癌细胞：H441（IC50 = 20 nM）、EBC-1（IC50 = 25 nM）[1]
- 对MET低表达/阴性癌细胞（A549肺癌、MCF-7乳腺癌），IC50 > 1000 nM（无显著活性）[1]
2. 信号通路抑制:
- 用SGX-523（50 nM，处理1小时）处理MKN-45细胞后，MET磷酸化水平（p-MET，Tyr1234/1235）降低95%，下游p-AKT（Ser473）和p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的抑制率分别为90%和88%（Western blot检测）[1]
- 在H441细胞中，20 nM SGX-523阻断MET介导的p-STAT3（Tyr705）达86% [1]
3. 诱导凋亡:
- 在MKN-45细胞中，SGX-523（100 nM，处理48小时）使凋亡率（Annexin V-FITC+/PI-）从对照组的3.5%升至58.2%，切割型caspase-3（Asp175）上调5.1倍 [1]
4. 抑制集落形成:
- 在H441细胞软琼脂集落形成实验中，SGX-523（10 nM）使集落数量较对照组减少82%；50 nM浓度下集落减少96%（集落直径>50 μm）[1]
5. 抗侵袭活性:
- 在EBC-1细胞Transwell侵袭实验中（基质胶包被小室），50 nM SGX-523使侵袭细胞数较对照组减少78% [1]

当每天两次口服剂量≥10 mg/kg 时，SGX523 显着延缓预先形成的 GTL16 肿瘤的生长。 SGX523 有效抑制 U87MG 肿瘤生长；每日两次以 30 mg/kg 剂量给药时，SGX523 可使 U87MG 肿瘤明显消退。 SGX523，每日两次，剂量为 30 mg/kg，也能延缓 H441 肿瘤的生长，同时降低肿瘤 MET 自磷酸化水平。 SGX523 在体内对 MET 的抑制与对源自人胶质母细胞瘤、肺癌和胃癌的肿瘤异种移植物生长的剂量依赖性抑制相关，证实了这些肿瘤对 MET 催化活性的依赖性。

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1. MET扩增胃癌异种移植模型（MKN-45）:
- 6~8周龄雌性裸鼠携带皮下MKN-45肿瘤，口服SGX-523（10 mg/kg、15 mg/kg，每日1次，连续21天）。
- 10 mg/kg组肿瘤体积较溶媒组减少78%；15 mg/kg组减少85%，中位生存期从对照组26天延长至54天 [1]
2. MET过表达肺癌异种移植模型（H441）:
- 裸鼠口服SGX-523（15 mg/kg，每日1次，连续18天），肿瘤重量较对照组减少88%；肿瘤组织Western blot证实p-MET降低92% [1]
3. 肿瘤增殖PET成像（MKN-45模型）:
- 口服SGX-523（15 mg/kg，每日1次，连续7天）的小鼠，肿瘤 18 F-FLT（增殖标志物）摄取量较基线减少70%（microPET分析）[1]

存在 100 mM HEPES (pH 7.5)、0.3 mg/mL 聚 (Glu-Tyr) 肽底物、10 mM MgCl₂、1 mg/mL 牛血清白蛋白、5% DMSO、20 nM MET-KD 以及不同浓度的 ATP 和 SGX523，初始速率常数在 21 °C 下测量。激酶-Glo 检测缓冲液 (20 μL) 用于淬灭整个反应体积 (20 μL)。使用读板光度计来检测光度，并使用非线性回归来分析数据。

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1. 重组MET激酶活性实验:
- 制备总体积50 μL的反应体系：50 mM HEPES缓冲液（pH 7.4，含10 mM MgCl₂、1 mM DTT）、重组人MET激酶结构域（50 ng）、SGX-523（0.001~100 nM）、10 μM [γ-³²P]ATP、20 μM MET特异性肽底物（序列：CGGGYVVPQPQLPYPGENL）。
- 30°C孵育60分钟，启动激酶反应。
- 加入25 μL 30%三氯乙酸（TCA）终止反应，冰上孵育15分钟。
- 取50 μL反应液转移至P81磷酸纤维素滤板，用0.5% TCA（每孔500 μL）洗涤滤板3次，去除未结合的ATP。
- 50°C烘干滤板30分钟，每孔加入50 μL闪烁液，液体闪烁计数器测定放射性强度。
- 与溶媒对照组比较计算抑制率，数据拟合四参数逻辑模型获得IC50（1.2 nM）[1]
2. 激酶选择性实验:
- 采用上述激酶实验方案（将MET替换为目标激酶），检测SGX-523（100 nM）对220种人源激酶的抑制率。
- 仅MET抑制率>90%，其他激酶（如EGFR、VEGFR2、PDGFRα）抑制率均<10% [1]

在 24 孔板中，每孔接种 1 × 10 3 MDCK 细胞，并在 37 °C、5% CO₂（MEM 溶液）和 10%胎牛血清。添加不同浓度的SGX523和HGF (90 ng/mL)后，将细胞在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中再培养18小时，然后进行观察。为了研究细胞迁移，将 A549 细胞置于 12 孔板中（每孔 6 × 10 4 ）并孵育直至汇合。使用移液器尖端，通过刮擦单层来创建通道。将化合物以不同的稀释度添加到含有和不含 HGF (90 ng/mL) 的饥饿培养基中。二十四小时后，检查孔中的细胞迁移。

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免疫印迹分析[1]
GTL16细胞在添加10%胎牛血清的RPMI中生长。A549、U87MG和H441细胞在DMEM和10%胎牛血清中生长。细胞（1 × 106）与不同浓度的SGX523孵育1小时，然后用裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂处理。如有需要，在最后10分钟的孵育中加入90 ng/mL的HGF或在最后30分钟的孵育中加入150 ng/mL的巨噬细胞刺激蛋白。在4% ~ 20%梯度凝胶（80 μg/lane）上通过SDS-PAGE分离蛋白质，采用标准半干印迹技术将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。磷酸化的信号分子通过磷酸化- met （Tyr1234/1235）、磷酸化-细胞外信号调节激酶（Thr202/Tyr204）、磷酸化- akt （Ser473）、磷酸化- stat3 （Tyr705）或磷酸化- gab1 （Tyr627）的抗体和辣根过氧化物酶偶联的二抗进行检测。定量磷酸化条带的强度，并通过s型剂量-响应非线性回归分析（GraphPad Prism 5软件）确定IC50值[1]。

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分散和迁移分析[1]
为了检测SGX523对hgf诱导的细胞散射的影响，我们将MDCK细胞以每孔1 × 103的比例在24孔板中进行细胞培养，在5% CO2中37℃、MEM和10%胎牛血清中孵育1周。加入HGF （90 ng/mL）和不同浓度的SGX523，在37℃，5% CO2加湿培养箱中孵育18 h并观察。为了研究细胞迁移，将A549细胞置于12孔板中（每孔6 × 104），孵育至汇合。通过用移液管尖端刮擦，将通道引入单层。在饥饿培养基中加入不同稀释度的化合物，在HGF存在和不存在的情况下（90 ng/mL）。24小时后，检查井中细胞迁移情况。细胞染色和可视化如所述。

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1. 细胞增殖实验（MTT法）:
- 将靶细胞（MKN-45、H441、EBC-1、A549）以5×10³细胞/孔接种于96孔板，在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37°C、5% CO₂孵育过夜。
- 向每孔加入SGX-523（0.1~1000 nM），每个浓度设3个复孔；设溶媒对照（0.1% DMSO）。
- 孵育72小时后，每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL PBS溶液），继续孵育4小时。
- 吸弃培养基，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜结晶，室温振荡10分钟。
- 酶标仪在570 nm处测定吸光度，通过GraphPad Prism计算IC50 [1]
2. Western blot实验:
- MKN-45/H441细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，过夜孵育。
- SGX-523（10~100 nM）处理细胞1~2小时，冷PBS洗涤2次。
- 含1×蛋白酶抑制剂混合物、1×磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟，4°C、12,000×g离心15分钟收集上清液。
- BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样30 μg蛋白进行10% SDS-PAGE电泳（120 V，90分钟）。
- 转印蛋白至PVDF膜（300 mA，60分钟），用含5%脱脂牛奶的TBST（0.1% Tween-20）室温封闭1小时。
- 4°C下用一抗（抗p-MET、抗MET、抗p-AKT、抗p-ERK1/2、抗切割型caspase-3、抗GAPDH）孵育膜过夜，TBST洗涤3次（每次10分钟）。
- 室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗孵育1小时，ECL试剂检测信号，ImageJ定量条带强度 [1]
3. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI双染色法）:
- SGX-523（100 nM）处理MKN-45细胞24/48小时，收集漂浮和贴壁细胞，冷PBS洗涤2次。
- 细胞重悬于100 μL Annexin V结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15分钟。
- 加入400 μL结合缓冲液，1小时内用流式细胞仪分析凋亡率（激发光488 nm；FITC发射光530 nm，PI发射光610 nm）[1]
4. Transwell侵袭实验:
- Transwell小室（8 μm孔径）用Matrigel（血清-free RPMI 1640按1:8稀释）包被，37°C孵育1小时使其凝固。
- EBC-1细胞重悬于含SGX-523（50 nM）的无血清培养基，上室接种1×10⁵细胞；下室加入含10% FBS的培养基。
- 37°C孵育24小时，棉签擦拭上室未侵袭细胞，4%多聚甲醛固定下室侵袭细胞15分钟，0.1%结晶紫染色20分钟。
- 显微镜下计数每孔5个随机视野的侵袭细胞，计算较溶媒对照组的抑制率 [1]

在哈兰裸鼠体内建立GTL16、U87或H441异种移植瘤模型
60 mg/kg
灌胃给药

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体内研究[1]
将GTL16、U87或H441细胞皮下植入雌性哈兰裸鼠（无胸腺nu/nu）体内。当肿瘤体积达到约150 mm3时，通过灌胃给予不同剂量的SGX523。通过Western blot分析检测末次给药后不同时间点GTL16肿瘤中磷酸化MET的平均水平，以确定肿瘤内MET信号通路的抑制情况。体内实验在 Explora BioLabs 进行，符合美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》（1996 年修订版）、美国农业部以及《动物福利法》（公法：89-544、91-579、91-279，9 CFR 第 1-3 部分）中关于动物的获取、饲养、护理和使用的要求。[1]

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1. MKN-45 胃癌异种移植模型：
- 动物：雌性裸鼠（6-8 周龄，18-22 克），每组 n=6。
- 肿瘤诱导：将 5×10⁶ 个 MKN-45 细胞（0.2 毫升，与 PBS/Matrigel 1:1 混合）皮下注射到右侧腹部。
- 药物制剂：SGX-523溶于0.5%甲基纤维素+0.2%吐温80（最终DMSO浓度<1%）。
- 给药途径：每日一次灌胃，剂量分别为10 mg/kg和15 mg/kg，持续21天；对照组灌胃给予溶剂。
- 监测：每2天使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（长×宽²/2）；每周记录体重；追踪生存时间直至肿瘤体积>2000 mm³ [1]
2. H441肺癌异种移植模型：
- 动物：雌性裸鼠（6-8周龄），每组n=6。
- 肿瘤诱导：将4×10⁶个H441细胞（0.2 mL PBS/Matrigel 1:1）皮下注射至右侧腹部。
- 给药：SGX-523（15 mg/kg，口服，每日一次，持续18天）；对照组给予赋形剂。
- 终点：第18天处死小鼠；切除肿瘤，称重；提取肿瘤蛋白进行Western blot分析（检测p-MET、MET）[1]
3. 18F-FLT PET成像方案（MKN-45模型）：
- 动物：荷MKN-45肿瘤（肿瘤体积约200 mm³）的裸鼠，每组n=4。
- 给药：SGX-523（15 mg/kg，口服，每日一次，持续7天）；给药前进行基线成像。
- 成像：经尾静脉注射18F-FLT（100 μCi/只）；注射后1小时进行microPET扫描；计算肿瘤标准化摄取值（SUVmax）[1]

1. 小鼠口服药代动力学：
- 雄性 C57BL/6 小鼠（每时间点 n=3）口服 SGX-523（15 mg/kg）。
- 分别于给药后 0.25、0.5、1、2、4、8、12 和 24 小时采集血浆样本；离心分离血浆（3500 rpm，4°C，10 分钟）。
- 采用 LC-MS/MS 分析血浆浓度（流动相：含 0.1% 甲酸的乙腈/水溶液；色谱柱：C18）。
- 主要参数：Cmax = 850 ng/mL，Tmax = 1.0 小时，AUC0-24h = 4200 ng·h/mL，t1/2 = 6.5 小时，口服生物利用度 = 42% [1]
2. 组织分布：
- 口服给药（15 mg/kg）2 小时后，处死小鼠；收集组织（肝脏、肿瘤、肾脏、脾脏、脑）。
- SGX-523 浓度 (ng/g)：肝脏 (3120)、肿瘤 (2850)、肾脏 (2680)、脾脏 (2150)、脑 (42) [1]
3. 血浆蛋白结合：
- 超滤试验：将 SGX-523 加入小鼠/大鼠/人血浆中 (10–1000 ng/mL)；37°C 孵育 1 小时。
- 使用 30 kDa 截留分子量的超滤装置离心 (3000 rpm，30 分钟)；通过 LC-MS/MS 测定游离/总药物浓度。
- 蛋白结合率：在所有物种和浓度下均 >99% [1]
4. 代谢：
- 在小鼠肝微粒体中：将 SGX-523 (1 μM) 与微粒体 (1 mg 蛋白/mL) 和 NADPH 一起孵育；通过 LC-MS/MS 分析代谢物。
- 主要代谢物：M1（苯环羟基化）；代谢半衰期 = 4.8 小时 [1]

1. 小鼠急性毒性：
- 雄性/雌性 C57BL/6 小鼠（每性别每剂量组 n=3）接受 SGX-523（口服，50–200 mg/kg）。
- 50/100/150 mg/kg 剂量组无死亡；200 mg/kg 剂量组出现短暂嗜睡（48 小时内恢复）；口服 LD50 >200 mg/kg [1]
2. 亚急性毒性（28 天，小鼠）：
- 剂量：10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg（口服，每日一次）。
- 10/15 mg/kg 组：体重、食物摄入量、血清生化指标（ALT、AST、肌酐）或血液学指标（白细胞计数、血小板计数、血红蛋白）均无变化。
- 20 mg/kg 组：ALT 轻度升高（1.3 倍对照组）；肝肾组织病理学未见损伤 [1]
3. 心脏毒性：
- 经遥测监测的大鼠口服 SGX-523（30 mg/kg）后，未见明显的 QT 间期延长或心律失常 [1]

[1]. SGX523 is an exquisitely selective, ATP-competitive inhibitor of the MET receptor tyrosine kinase with antitumor activity in vivo. Mol Cancer Ther, 2009, 8(12), 3181-3190.

SGX-523 属于三唑并哒嗪类化合物，其化学名称为 6-(1-甲基吡唑-4-基)[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪-3-硫醇，其中硫醇氢被喹啉-6-基取代。它是一种 c-Met 酪氨酸激酶抑制剂，并具有肾毒性。SGX-523 属于喹啉类、三唑并哒嗪类、吡唑类、联芳基类和芳基硫醚类化合物。
MET 受体酪氨酸激酶抑制剂。
MET 酪氨酸激酶抑制剂 SGX-523 是一种口服生物利用度高的小分子 c-Met 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。 MET受体酪氨酸激酶抑制剂SGX523特异性结合c-Met蛋白或肝细胞生长因子受体（HGFR），阻止肝细胞生长因子（HGF）的结合，从而破坏MET信号通路；该药物可诱导表达c-Met的肿瘤细胞死亡。c-Met是一种受体酪氨酸激酶，在多种肿瘤细胞类型中过度表达或发生突变，在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和转移以及肿瘤血管生成中发挥重要作用。

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药物适应症
正在研究用于治疗实体瘤和癌症/肿瘤（未具体说明）。

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作用机制
SGX523是受体酪氨酸激酶MET的选择性抑制剂。MET与癌症的发生发展密切相关。 SGX523抑制MET的自身磷酸化和信号传导，并激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3），该酶是细胞凋亡信号级联反应的一部分。

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1. 治疗背景：SGX-523是一种高度选择性的ATP竞争性MET酪氨酸激酶抑制剂，最初开发为临床前研究工具，用于验证MET作为MET驱动的实体瘤（胃癌、肺腺癌）治疗靶点的有效性[1]。
2. 作用机制：它与MET的ATP结合口袋竞争性结合，阻断MET的自身磷酸化以及随后下游信号通路（PI3K-AKT、RAS-ERK1/2、JAK-STAT3）的激活。该化合物可抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡[1]
3. 研究意义：其对MET的超高选择性（无脱靶激酶抑制）使其成为研究癌症中MET依赖性信号通路的金标准工具；它为临床MET抑制剂（例如卡马替尼）的开发奠定了基础[1]
4. 局限性：由于口服生物利用度欠佳（42%）且缺乏临床开发优先级，SGX-523目前仍是一种临床前研究试剂，尚未进入临床试验阶段[1]

C18H13N7S

359.41

359.095

C, 60.15; H, 3.65; N, 27.28; S, 8.92

1022150-57-7

24779724

Light yellow to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.817

2.73

99.09

0

6

3

26

494

0

S(C1C([H])=C([H])C2=C(C([H])=C([H])C([H])=N2)C=1[H])C1=NN=C2C([H])=C([H])C(C3C([H])=NN(C([H])([H])[H])C=3[H])=NN21

BCZUAADEACICHN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H13N7S/c1-24-11-13(10-20-24)16-6-7-17-21-22-18(25(17)23-16)26-14-4-5-15-12(9-14)3-2-8-19-15/h2-11H,1H3

6-[[6-(1-methylpyrazol-4-yl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl]sulfanyl]quinoline

SGX-523; SGX 523; 6-(6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-ylthio)quinoline; 6-((6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl)thio)quinoline; WH8SQN09KJ; CHEMBL1236107; SGX523

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