cIAP-1 (Ki = 0.31 nM); cIAP-2 (Ki = 1.1 nM); cIAP
XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), specifically targeting both the BIR2 and BIR3 domains concurrently. The binding affinity (IC50) to XIAP protein containing both BIR2 and BIR3 domains (residues 120-356) is 1.39 nM. [1]

SM-164 与含有两个 BIR 结构域的 XIAP 结合，IC50 值为 1.39 nM，其效力分别是其单价对应物和天然 Smac AVPI 肽的 300 倍和 7000 倍。浓度低至 1 nM 时，SM-164 可通过靶向细胞 XIAP 有效诱导 HL-60 白血病细胞系凋亡。[1] SM-164 可诱导癌细胞发生 caspase-8 和 caspase-3 依赖性凋亡。SM-164 还可诱导 TNFα 依赖性凋亡和 cIAP-1 降解。[2] 体外实验表明，SM-164 与 TRAIL 联合使用对 TRAIL 敏感和耐药的乳腺癌、前列腺癌和结肠癌细胞系均具有良好的抑制作用。 SM-164 通过增强 caspase-8 介导的外源性凋亡通路，增强 TRAIL 诱导的癌细胞凋亡。[3]

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SM-164（化合物 4）能有效抑制 HL-60 人白血病细胞系的生长，IC50 值为 1 nM。
它能以剂量依赖的方式强效诱导 HL-60 细胞凋亡。在 10 nM 和 100 nM 浓度下处理 24 小时，分别可诱导 57% 和 69% 的 HL-60 细胞发生凋亡。浓度低至 1 nM，作用 24 小时即可诱导 17% 的 HL-60 细胞发生凋亡。
在 HL-60 细胞中，浓度低至 10 nM 的 SM-164 可在 24 小时内显著激活 caspase-9 和 caspase-3，并裂解 PARP（聚（ADP-核糖）聚合酶）。
在使用 HL-60 细胞裂解液进行的共免疫沉淀实验中，10 nM 的 SM-164 可竞争性地抑制超过 50% 与生物素标记的单价 Smac 模拟物（10 μM 的 BL-SM-122）结合的 XIAP，而 100 nM 的 SM-164 则完全阻断了这种结合，表明其与细胞 XIAP 的亲和力更高。[1]

在 MDA-MB-231 异种移植瘤组织中，SM-164 除了能引起肿瘤消退外，还能引起强烈的细胞凋亡和 cIAP-1 的快速降解，但对正常小鼠组织没有毒性作用。[2]
SM-164 与 TRAIL 联合使用可引起肿瘤消退，且对动物无毒性，因为 SM-164 可诱导肿瘤组织中 cIAP1 的降解，并显著增强 TRAIL 的体内抗肿瘤活性。 [3]在SCID小鼠的MDA-MB-231异种移植模型中，单次静脉注射5 mg/kg的SM-164，1小时内cIAP-1蛋白水平显著降低，且该作用至少持续24小时。在3小时时，肿瘤组织中观察到caspase-8、caspase-9和caspase-3的强烈激活以及PARP的裂解，并持续24小时。[2]TUNEL检测显示，治疗后3小时肿瘤组织中即可观察到强烈的细胞凋亡； 6小时时间点，超过50%的肿瘤细胞TUNEL染色呈阳性。[2]
H&E染色显示，SM-164治疗后肿瘤组织受到显著损伤（细胞收缩、核固缩、染色质浓缩）。[2]
在同一异种移植模型中，以1 mg/kg的剂量（静脉注射，每日一次，每周5天，持续2周）治疗SM-164，在治疗期间完全抑制了肿瘤生长。[2]
以5 mg/kg的剂量（相同给药方案）治疗SM-164，使肿瘤体积从147±54 mm³减少至54±32 mm³（减少65%），并实现了肿瘤消退。[2]
SM-164的抗肿瘤活性持久而非短暂。[2]
5 mg/kg的SM-164在统计学上比7.5 mg/kg的多西他赛更有效。治疗结束时，SM-164 的剂量为 1 mg/kg（P<0.01）。接受 1 或 5 mg/kg SM-164 治疗的小鼠未观察到明显的体重减轻或其他毒性迹象。与肿瘤组织不同，SM-164 对所检查的正常小鼠组织（包括小肠、胃、肝脏和脾脏）没有影响。[2]

本文描述了一种基于荧光偏振（FP）的XIAP BIR3蛋白检测方法。简而言之，将5-羧基荧光素偶联到具有特定序列的突变Smac肽的赖氨酸侧链上，并将这种荧光标记肽（命名为SM5F）用作基于FP的XIAP BIR3结合检测中的荧光示踪剂。该荧光示踪剂与XIAP BIR3的解离常数（Kd）值为17.9 nM。在竞争性结合实验中，将待测物质与 30 nM 的 XIAP BIR3 蛋白和 5 nM 的 SM5F 在测定缓冲液（100 mM 磷酸钾，pH 7.5；100 μg/ml 牛 γ 球蛋白；0.02% 叠氮化钠）中孵育。测得 SM5F 与 cIAP-1 BIR3 蛋白的 Kd 值为 4.1 nM。在竞争性结合实验中，使用 10 nM 的 cIAP-1 BIR3 蛋白和 2 nM 的 SM5F 示踪剂。测得 SM5F 与 cIAP-2 BIR3 蛋白的 Kd 值为 6.6 nM。在竞争性结合实验中，使用 25 nM 的 cIAP-2 BIR3 蛋白和 2 nM 的 SM5F 示踪剂。一种名为 Smac-1F 的二价荧光标记示踪剂用于……采用基于荧光偏振 (FP) 的竞争性结合实验测定 Smac 模拟物与含有 BIR2 和 BIR3 结构域的 XIAP 蛋白的结合亲和力。与含有 BIR2 和 BIR3 结构域的 XIAP 蛋白结合的二价标记示踪剂的解离常数 (Kd) 为 2.3 nM。在竞争性结合实验中，将待测物质与 3 nM 含有 BIR2 和 BIR3 结构域的 XIAP 蛋白（氨基酸残基 120–356）以及 1 nM 的 Smac 模拟物在同一实验缓冲液中孵育。

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使用竞争性荧光偏振 (FP) 实验测定了 SM-164 与含有 BIR2 和 BIR3 结构域的 XIAP 蛋白的结合亲和力。使用荧光标记的二价 Smac 肽 Smac-1F 作为示踪剂。实验通过将待测化合物与 3 nM XIAP 蛋白（氨基酸残基 120–356）和 1 nM 的 Smac 模拟物孵育来进行。在96孔黑色圆底板中，将Smac-1F (0.5 nM)溶于测定缓冲液（100 mM磷酸钾，pH 7.5，100 μg/ml牛γ球蛋白，0.02%叠氮化钠）中。对照组包括XIAP和Smac-1F（0%抑制）以及仅Smac-1F（100%抑制）。孵育2小时后，使用Ultra酶标仪测量极化值。IC50值，即50%结合示踪剂被置换时的浓度，通过非线性最小二乘分析作图确定。[1]
使用重组XIAP BIR3-only（残基241-356）和BIR2-BIR3（残基156-356）蛋白，通过分析型凝胶过滤实验探究SM-164与XIAP的结合模式。实验在 Superdex 75 柱上进行分离，流动相为 Tris-HCl (pH 7.5, 20 mM)、NaCl (200 mM)、乙酸锌 (50 μM) 和 DTT (1 mM)。重组蛋白 (1 mg/ml) 单独上样，或与 1:1 摩尔比的 Smac 模拟物孵育后上样。对于仅含 BIR3 的蛋白，SM-164 诱导蛋白二聚化，表明形成 1:2 复合物。对于 BIR2-BIR3 蛋白，SM-164 不诱导二聚化，但使蛋白结构更加紧凑。在相同的凝胶过滤实验中使用突变蛋白（BIR2(E219R)-BIR3 和 BIR2-BIR3(E314S,W323E)）证实 BIR2 和 BIR3 结构域均直接参与结合。[1]
采用异核单量子相关 (HSQC) 核磁共振波谱法进行分析。研究结合模式。在 500 MHz 核磁共振波谱仪上记录了 15N HSQC 谱图，样品包含 100 μM 的 15N 标记的 BIR2-BIR3 蛋白（残基 156-356），溶于 50 mM Tris (pH 7.2)、50 μM ZnCl2 和 1 mM DTT 缓冲液中，温度为 25°C，并分别添加或不添加终浓度为 10-150 μM 的测试化合物。谱图显示，蛋白质中的许多残基受到 SM-164 的影响。线宽分析表明，无论是否存在 SM-164，蛋白质的分子量均相同，证实不存在二聚化。SM-164 影响的蛋白质残基比单价化合物 1 更多，且在最低测试浓度（10 μM，与蛋白质的比例为 1:10）下即可观察到明显变化。对 BIR3 残基的分析（例如， V298) 和 BIR2 残基的分析表明，SM-164 能以高亲和力与这两个结构域结合。[1]
采用无细胞 caspase 功能分析来评估 SM-164 拮抗 XIAP 的能力。制备 MDA-MB-231 细胞裂解液，并通过添加细胞色素 c 和 dATP 激活 caspase-9 和 caspase-3/-7。加入重组 XIAP L-BIR2-BIR3 蛋白 (50 nM) 以完全抑制 caspase 活性。加入不同浓度的 SM-164 (1 nM - 100 μM) 以确定 caspase 活性的恢复情况。加入 25 μM 的 caspase-9 底物 (Z-LEHD-AFC) 或 caspase-3/-7 底物 (Z-DEVD-AFC)。使用荧光检测仪进行检测。激发波长为 400 nm，发射波长为 505 nm。SM-164 以剂量依赖的方式拮抗 XIAP，在与 XIAP 等摩尔浓度下，SM-164 完全克服了 XIAP 的抑制作用，并完全恢复了 caspase-9 和 caspase-3/-7 的活性。[1]

将SM-164 (1 μM) 应用于先前已用高糖 (HG，5 μM) 处理 30 分钟的细胞。

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采用 WST-8 法评估SM-164对 HL-60 细胞生长的影响。将细胞（每孔 3000-4000 个细胞）接种于 96 孔板中，并在含有不同浓度SM-164的培养基中培养 4 天。孵育结束后，加入 WST-8 染料，孵育 1-3 小时，然后在 450 nm 处测量吸光度。细胞生长抑制率以样品吸光度与对照组吸光度的比值来评估。IC50 值为 1 nM。[1]
使用 Annexin-V/碘化丙啶 (PI) 凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。将HL-60细胞用SM-164处理24小时。收集细胞，用冰冷的PBS洗涤，并在室温下避光用Annexin-V-FITC和PI染色15分钟。用流式细胞仪分析染色后的细胞。Annexin-V阳性细胞被定义为凋亡细胞。10 nM和100 nM的SM-164分别诱导57%和69%的细胞凋亡。1 nM的SM-164诱导17%的细胞凋亡。[1] 对于Western blotting实验，将HL-60细胞用SM-164处理24小时。细胞沉淀物用双裂解缓冲液（50 mmol/L Tris、150 mmol/L 氯化钠、1 mmol/L EDTA、0.1% SDS 和 1% NP-40）裂解。蛋白质经 4-20% 梯度 SDS-PAGE 电泳分离后，转移至 PVDF 膜上，并与针对裂解型 caspase-9、裂解型 caspase-3、裂解型 PARP 和 β-actin 的特异性一抗孵育，随后与 HRP 标记的二抗孵育。10 nM 的 SM-164 可显著激活 caspase-9 和 caspase-3 并裂解 PARP。[1]
采用生物素-链霉亲和素下拉实验研究 SM-164 与细胞 XIAP 的相互作用。 HL-60 细胞裂解液先用链霉亲和素-琼脂糖珠预清除，然后分别与生物素标记的 SM-122 (BL-SM-122) 单独孵育，或先与 SM-164 预孵育 5 分钟，再与 BL-SM-122 共孵育。复合物用链霉亲和素-琼脂糖珠在 4°C 下孵育 2 小时回收，洗涤后用 SDS 上样缓冲液煮沸洗脱。洗脱的蛋白用单克隆 XIAP 抗体进行 Western 印迹检测。10 nM 的 SM-164 可竞争性抑制 50% 以上与 BL-SM-122 结合的 XIAP，而 100 nM 的 SM-164 则完全阻断了这种结合。[1]

在体内药效学研究中，将5×10⁶个MDA-MB-231癌细胞与Matrigel混合后皮下注射到雌性SCID小鼠背部（每只小鼠一个肿瘤）。已建立异种移植瘤的小鼠分别接受单次静脉注射SM-164（5 mg/kg）、多西他赛（7.5 mg/kg）或载体对照治疗。在指定时间点（1、3、6、12、24 小时）收集肿瘤组织和正常小鼠组织，用于蛋白质印迹、TUNEL 染色和 H&E 染色。[2]
在体内抗肿瘤疗效研究中，将携带 MDA-MB-231 异种移植瘤的 SCID 小鼠（每组 8-10 只）静脉注射 SM-164（1 mg/kg 或 5 mg/kg）、多西他赛（7.5 mg/kg）或载体对照，每日一次，每周 5 天，持续 2 周。每周测量三次肿瘤大小和动物体重。计算肿瘤体积，并以平均值 ± 标准误 (SE) 表示。[2]
所有动物实验均按照机构动物使用和护理委员会的指导方针进行。[2]

单次静脉注射 5 mg/kg 的 SM-164 未在所检测的正常小鼠组织中引起可检测到的毒性，包括小肠、胃、肝脏和脾脏等高度增殖的组织，这通过 H&E 染色确定。[2]
在一组正常人细胞（成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞）中，SM-164 单独使用或与 TNFα 联合使用均未显示出毒性或仅显示出极低的毒性。[2]
在为期 2 周的疗效研究（每日静脉给药，每周 5 天）中，接受 1 或 5 mg/kg SM-164 治疗的小鼠未出现明显的体重减轻或其他毒性迹象。[2]
与肿瘤细胞系相比，所有检测的正常人细胞中 cIAP-1 的表达均极低，表明正常细胞不依赖 cIAP-1 来阻断凋亡信号。[2]

[1]. J Am Chem Soc . 2007 Dec 12;129(49):15279-94.

[2]. Cancer Res . 2008 Nov 15;68(22):9384-93.

[3]. Mol Cancer Ther . 2011 May;10(5):902-14.

SM-164 是一种强效的、可透过细胞膜的二价 Smac 模拟物，能够与 XIAP、cIAP-1 和 cIAP-2 蛋白结合（Ki 值分别为 0.56 nM、0.31 nM 和 1.1 nM）。它能在肿瘤异种移植模型中诱导细胞凋亡和肿瘤消退。SM-164 具有多种活性，包括放射增敏剂、抗肿瘤剂和细胞凋亡诱导剂。它属于三唑、苯、仲酰胺和有机杂双环化合物。

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XIAP 是一种重要的细胞凋亡调节因子，它通过结合并抑制 caspase-3/-7 和 caspase-9 来抑制细胞凋亡。Smac 蛋白拮抗 XIAP。SM-164 通过同时靶向 XIAP 中的 BIR2 和 BIR3 结构域来模拟这一作用。二价SM-164在结合、功能和细胞实验中的效力比相应的单价Smac模拟物高2-3个数量级。它是阐明XIAP细胞功能的有力工具，也是开发旨在克服癌细胞凋亡抵抗的新型抗癌疗法的极具前景的先导化合物。[1]

C62H84N14O6

1121.45

1120.67

C, 66.40; H, 7.55; N, 17.49; O, 8.56

957135-43-2

SM-164 Hydrochloride

17756618

White to light yellow solid powder

7.6

242.5

6

12

24

82

1930

10

C([C@@H]1CC[C@@H]2CCCC[C@@H](C(N12)=O)NC(=O)[C@H](C)NC)(=O)N[C@@H](C1C=CC=CC=1)C1N=NN(CCCCC2C=CC(CCCCN3N=NC([C@H](C4C=CC=CC=4)NC([C@@H]4CC[C@@H]5CCCC[C@@H](C(N45)=O)NC(=O)[C@H](C)NC)=O)=C3)=CC=2)C=1

LGYDZXNSSLRFJS-IOQQVAQYSA-N

InChI=1S/C62H84N14O6/c1-41(63-3)57(77)65-49-27-13-11-25-47-33-35-53(75(47)61(49)81)59(79)67-55(45-21-7-5-8-22-45)51-39-73(71-69-51)37-17-15-19-43-29-31-44(32-30-43)20-16-18-38-74-40-52(70-72-74)56(46-23-9-6-10-24-46)68-60(80)54-36-34-48-26-12-14-28-50(62(82)76(48)54)66-58(78)42(2)64-4/h5-10,21-24,29-32,39-42,47-50,53-56,63-64H,11-20,25-28,33-38H2,1-4H3,(H,65,77)(H,66,78)(H,67,79)(H,68,80)/t41-,42-,47-,48-,49-,50-,53-,54-,55-,56-/m0/s1

(3S,6S,10aS)-N-[(S)-[1-[4-[4-[4-[4-[(S)-[[(3S,6S,10aS)-6-[[(2S)-2-(methylamino)propanoyl]amino]-5-oxo-2,3,6,7,8,9,10,10a-octahydro-1H-pyrrolo[1,2-a]azocine-3-carbonyl]amino]-phenylmethyl]triazol-1-yl]butyl]phenyl]butyl]triazol-4-yl]-phenylmethyl]-6-[[(2S)-2-(methylamino)propanoyl]amino]-5-oxo-2,3,6,7,8,9,10,10a-octahydro-1H-pyrrolo[1,2-a]azocine-3-carboxamide

SM 164; SM-164; SM164

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 3~25 mg/mL (2.7~22.3 mM)

配方 1 中的溶解度: 0.83 mg/mL (0.74 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 8.3 mg/mL澄清的DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；再将50 μL Tween-80+加入到上述溶液中，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。