SQ109 (NSC 722041)

Trypanosoma; MmpL3
Uncoupler of mitochondrial membrane potential (Δψm) and pH gradient (ΔpH) in Trypanosoma cruzi
Inhibitor of T. cruzi squalene synthase (TcSQS) (IC50 ~100 μM)
Binds to active site of T. cruzi and human squalene synthase (structural evidence) [1]

SQ109 的选择性指数约为 10 至 20，还抑制临床相关的细胞内无鞭毛体（IC50，~0.5 至 1 μM）和细胞外上鞭毛体（IC50，4.6±1 μM）。 SQ109 在测量红细胞溶血的测定中表现不佳（EC50，~80 μM）。此外，如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和光学显微镜（LMC）所示，SQ109显着改变了所有三种生命周期形式的超微结构特征[1]。

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研究人员测试了抗结核药物SQ109对锥虫寄生虫克氏锥虫（恰加斯病的病原体）的体外活性，该药物目前正处于治疗药物敏感和耐药结核病的高级临床试验中。SQ109被发现是一种强效的寄生虫胰蛋白酶体抑制剂，对细胞杀伤的50%抑制浓度（IC50）为50±8 nM，但在红细胞溶血试验中几乎没有效果（50%有效浓度[EC50]，约80μM）。它还抑制了细胞外表睾吸虫（IC50，4.6±1μM）和临床相关的细胞内无鞭毛虫（IC50，≈0.5至1μM，选择性指数为≈10至20。通过光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察到，SQ109在所有三种生命周期形式中都引起了重大的超微结构变化。它迅速破坏琥珀酸激活线粒体中的线粒体内膜电位（Δψm），其作用方式与解偶联剂FCCP[羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙]相同，并导致内部酸性室碱化，这些作用可能对其作用机制做出重大贡献。该化合物还具有抗角鲨烯合酶的活性，与其活性位点结合；它抑制甾醇侧链减少，在无鞭毛体试验中，与抗真菌药物泊沙康唑协同作用，分数抑制浓度指数（FICI）为0.48，但这些作用不太可能解释对细胞形态和细胞杀伤的快速影响。因此，SQ109最有可能至少部分地通过破坏Δψ/ΔpH来发挥作用，这是之前证明其对结核分枝杆菌作用的主要机制之一。总体而言，研究结果表明，目前正在进行治疗药物敏感和耐药结核病的高级临床试验的SQ109也可能成为治疗恰加斯病的药物先导[1]。

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SQ109 对克氏锥虫的锥鞭毛体形式表现出强效活性，细胞杀灭IC50为 50 ± 8 nM，而对红细胞的溶血作用很弱（EC50 > 80 μM）。它还能抑制细胞外上鞭毛体（IC50 4.6 ± 1 μM）和细胞内无鞭毛体（IC50 ~0.5 至 1 μM），选择性指数约为 10 至 20。该化合物引起所有三种生命周期形式的显著超微结构改变，瓦解琥珀酸供能的线粒体的内膜电位，碱化内部酸性区室，并抑制甾醇侧链还原。它与泊沙康唑在抗细胞内无鞭毛体方面具有协同作用（FICI = 0.48）。[1]

连续 28 天，口服 SQ109（每天 0.1-25 毫克/公斤）的小鼠显示出肺和脾脏分枝杆菌负荷的剂量依赖性减少，这与每天服用 100 毫克/公斤的 EMB 相似，但效果不如异烟肼。 INH）每天给予 25 mg/kg。单次给药后，SQ109 在小鼠体内的药代动力学特征显示，静脉注射 (iv) 的 Cmax 为 1038，口服给药的 Cmax 为 135 ng/mL，口服 Tmax 为 0.31 小时。对于 SQ109，消除 t1/2 为 3.5 (iv) 和 5.2 小时 (po)。口服生物利用度达 4% [2]。狗的 SQ109 分布体积显着大于大鼠（7-8 小时，平均 7.4 小时），表明狗的 SQ109 终末半衰期 (t1/2) 更长。研究发现，SQ109在大鼠中的口服生物利用度为12%，在狗中为5%[3]。

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SQ109是通过高通量组合筛选开发的一种新型[1,2]-二胺基乙胺丁醇（EMB）类似物。本研究旨在表征其药效学和药代动力学。SQ109的抗菌活性在体外（结核分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞）和体内（结核分枝菌感染的C57BL/6小鼠）得到证实，并与异烟肼（INH）和EMB进行了比较。SQ109在抑制细胞内结核分枝杆菌方面显示出与INH相似的效力和疗效，但优于EMB。对小鼠体内口服SQ109（0.1-25mg/kg（-1）天（-1））28天，导致脾脏和肺部分枝杆菌载量的剂量依赖性减少，与100mg/kg（-1）天后（-1）给药的EMB相当，但不如25mg/kg（-1）时（-1）的INH有效。在28天口服给药（10 mg/kg（-1）天（-1））后的第1、14和28天，对小鼠组织中SQ109水平的监测表明，肺和脾脏中SQ109的浓度最高，至少比其MIC高10倍。单次给药后，SQ109在小鼠体内的药代动力学特征显示，其C（max）为1038（静脉注射（i.v.））和135 ng ml（-1）（口服），口服T（max）值为0.31 h。SQ109的消除T（1/2）为3.5（静脉注射）和5.2 h（口服）。口服生物利用度为4%。然而，SQ109在各种组织中显示出大量的分布。SQ109的最高浓度存在于肺部（>MIC），比血浆高出至少120倍（口服）和180倍（静脉注射）。排名第二的组织是脾脏和肾脏。单次给药后，大多数组织中的SQ109水平明显高于血液中的水平。观察期（10小时）内，SQ109的高组织浓度持续存在。本研究表明，SQ109具有良好的体内外抗结核活性和靶向组织分布特性。[2]

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本研究旨在表征新型二胺类抗结核药物N-香叶基-N'-（2-金刚烷基）乙烷-1,2-二胺（SQ109）的种间吸收、分布、代谢和消除（ADME）特征。对啮齿动物和狗进行单次剂量的SQ109给药（静脉注射（i.v.）和口服（p.o.）），并通过液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）分析血液样本。根据静脉注射等效体表面积剂量，犬体内SQ109的终末半衰期（t1/2）长于啮齿动物，这反映在犬体内的分布体积（Vss）较大，SQ109的清除率高于啮齿动物。SQ109在狗、大鼠和小鼠体内的口服生物利用度分别为2.4-5%、12%和3.8%。大鼠口服[14C]SQ109后，肝脏的放射性水平最高，其次是肺、脾和肾。[14C]SQ109的组织血液比大于1。[14C]SQ109的粪便排泄量占[14C]SQ109总剂量的22.2%，而尿排泄量仅占5.6%。[14C]SQ109（0.1-2.5微克/毫升）与血浆蛋白的结合率因物种（人类、小鼠、大鼠和狗）而异，从6%到23%不等。SQ109被大鼠、小鼠、狗和人肝微粒体代谢，在37摄氏度下孵育10分钟后，SQ109的残留率分别为22.8%、48.4%、50.8%或58.3%。人肝微粒体中的主要代谢物在195、347和363m/z时发出强烈的离子信号，表明SQ109的氧化、环氧化和N-脱烷基。使用重组cDNA表达的人CYP结合特定CYP抑制剂进行P450反应表型分析表明，CYP2D6和CYP2C19是参与SQ109代谢的主要CYP[3]。

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在结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/6小鼠模型中，口服给予SQ109 28天可导致脾脏和肺脏中的细菌载量（菌落形成单位，CFU）呈剂量依赖性减少。在10和25 mg kg⁻¹ day⁻¹的剂量下，SQ109 将两个器官的细菌CFU减少到与100 mg kg⁻¹ day⁻¹剂量EMB相当的水平。其效果弱于25 mg kg⁻¹ day⁻¹的INH。即使在低剂量0.1 mg kg⁻¹ day⁻¹下，SQ109 仍能显著降低脾脏中的细菌载量。所有给药处理的小鼠均存活，而部分未处理小鼠死亡。[2]

SQ109的微粒体代谢[3]
微粒体测定与之前描述的相似（Jia等人，2003）。简而言之，SQ109（10μM）分别与小鼠、大鼠、狗和人肝微粒体在含有1.3 mM NADP的NADPH生成系统中孵育，3.3mM葡萄糖-6-磷酸，0.4 U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和3.3 mM MgCl2在100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中的溶液。制备两份反应混合物，并在37°C下预孵育5分钟。然后通过加入微粒体（30μl 20 mg ml-1的250 mM蔗糖溶液，最终蛋白质浓度为0.5 mg ml-1）引发反应。每种反应混合物的最终体积为1.2ml。阴性对照反应是通过孵育混合物制备的，混合物中不包括微粒体或SQ109。对于排除微粒体的阴性对照培养，在用乙腈淬灭后将其重新加入反应混合物中。在0、10、20、40或80分钟时取出样品，并与冷乙腈涡旋混合以停止反应。离心后，通过质谱分析每种所得上清液的一部分，以检测未改变的SQ109。

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cDNA表达的重组人CYPs对SQ109的代谢[3]
在由转染有编码人CYP1A2、CYP2A6、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19或CYP2D6的cDNA的昆虫细胞制备的微粒体中，也评估了SQ109代谢。来自未转染昆虫细胞的重组酶和微粒体并行用作对照。SQ109（10μM）与上述NADPH生成系统在37°C下预孵育5分钟，共两次。然后通过加入单个CYP（最终100 pmol CYP ml−1）或相应的未转染细胞来引发反应。通过倒置混合样品，在0和30分钟时取出，并与冰冷的乙腈混合以停止反应。离心（14000×g，4°C下20分钟）后，使用质谱法分析每种提取物，以监测代谢物形成或SQ109耗竭。根据与SQ109分子量相比的预测质量增益和损失，进行电喷雾电离（ESI）全质量扫描，以获得预期代谢物的离子色谱图。ESI作为一种温和的电离技术，在代谢物分析中是首选的，因为ESI通常不会广泛解离化合物。代谢物分析基于质子化、去质子化或加合离子的检测，而不是片段离子（Kostiainen等人，2003）。对样品进行负离子和正离子分析，以确保检测到所有潜在的代谢物，并确定结构。代谢物定量基于每种代谢物的峰面积百分比，作为孵育时间与所有色谱峰总面积的函数。

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放射性测定[3]
所有样品的放射性在Tri-Carb 2100TR液体闪烁分析仪中测量。所有计数均通过自动化学发光和淬灭校正转换为绝对放射性（d.p.m.）。放射性（d.p.m.）小于或等于背景d.p.m.两倍的样品被认为低于定量限值，因此出于计算目的，读数被认为为零d.p.mSQ109生物样品中的当量是通过将样品d.p.m.除以[14C]SQ109的比活性来确定的，单位为d.p.m.每微克，并以微克/克组织表示。[14C]SQ109当量也表示为器官或组织中[14C]SQ109量占每只动物施用的总[14C]SQ109量的百分比。大鼠尿液和粪便中的放射性以每个时间间隔给药剂量的百分比和累积百分比表示。

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化学抑制研究[3]
以下抑制剂以所示浓度与相应的CYP亚型一起孵育。这些浓度基于文献信息（Parkinson，1996；Tucker等人，2001；Bjornsson等人，2003）：呋喃茶碱（CYP1A2；0.1、1和10μM）、奎尼丁（CYP2D6；0.5、1和1μM），噻氯匹啶（CYP2C19；5、20和100μM）（Donahue等人，1997；Tateishi等人，1999；Ha Duong等人，2001）和曲来度霉素（CYP3A；0.5、2和10μM）。在加入培养混合物之前，将所有抑制剂溶解在甲醇中。将含有人cDNA表达的CYP2D6或CYP2C19（100 pmol P450 ml−1反应混合物）、NADPH生成系统、选择性CYP抑制剂和100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）的反应混合物在37°C下预孵育15分钟。然后通过加入SQ109（10μM）开始每个反应，随后通过倒置混合每个样品。立即取出样品，并与冷乙腈混合，在孵育0和30分钟后停止反应。通过LC/MS/MS方法鉴定了SQ109及其代谢产物。形成的峰面积用于定量分析。对照孵育混合物包括不含抑制剂的混合物、与用作微粒体对照的未转染昆虫细胞微粒体的混合物，以及含有甲醇而非抑制剂的混合物（甲醇对照）。通过将抑制反应的峰面积与其各自的甲醇对照进行比较来进行定量分析。体外反应混合物的总有机溶剂含量小于2%。

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表达并纯化了克氏锥虫角鲨烯合成酶（TcSQS）和人源角鲨烯合成酶（HsSQS）。在法尼基-S-硫代二磷酸（FSPP）存在下获得TcSQS晶体，并用含SQ109的冷冻保护剂溶液浸泡。通过共结晶获得与SQ109复合的HsSQS晶体。收集X射线衍射数据并通过分子置换解析结构，揭示了SQ109与两种酶活性位点的结合模式。[1]

将 SQ109 (2.5–20 μM) 应用于 LLC-MK2 细胞，然后在 37°C 下孵育 96 小时。向未处理的样品中添加含有 10% FBS 的新鲜 RPMI 1640 培养基作为对照。 MTS/PMS 测试用于评估毒性。根据其针对克氏锥虫的锥鞭毛体和细胞内无鞭毛体形式的活性，SQ109 的选择性指数计算为寄生虫的 50% 裂解浓度 (LC50) 或 IC50 与哺乳动物细胞的 50% 细胞毒性浓度 (CC50) 的比率。每个实验均一式两份进行。三个或更多实验得出平均值[1]。

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体外感染模型[2]
RAW 264.7（ATCC TIB-71）小鼠巨噬细胞系在37°C和5%CO2的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中以每孔5×105个细胞的速度接种过夜，该培养基含有必需氨基酸和谷氨酰胺，并补充了10%热灭活胎牛血清（FBS）。含有萤光素酶报告构建体pSMT1（hsp60启动子驱动的萤光素酶）的重组结核分枝杆菌H37Rv的对数相培养物（Snewin等人，1999）在Middlebrook 7H9中生长，补充了牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖、过氧化氢酶和50μg ml−1潮霉素B，温度为37°C，来自冷冻储备的5%CO2。通过2500×g离心10分钟收集分枝杆菌，用无血清DMEM洗涤两次，然后以5×106个细胞ml-1的浓度重新悬浮在补充了5%热灭活FBS的DMEM中。巨噬细胞在37°C下以10:1的比例与细菌（结核分枝杆菌：细胞）孵育过夜而感染；然后在Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中洗涤三次。感染的细胞用INH、EMB和溶解在含有5%FBS的DMEM中的SQ109以不同MIC处理7天，一式三份。通过在搅拌下每孔加入1ml含有0.1%Triton X-100的无菌蒸馏H2O 2分钟来裂解巨噬细胞，从每个孔中取样100μl裂解物，加入等量的1%N-癸醛乙醇溶液。使用Luminiskan光度计（Packard）立即定量发光，每孔停留时间为10秒，以测试每种药物在感染的RAW 264.7细胞上的活性。基于生物发光的检测采用结核分枝杆菌的报告菌株，该菌株内源性表达萤火虫荧光素酶，催化底物产生发光。因此，可以根据发光强度来估计感染细胞内分枝杆菌的生长（Snewin等人，1999）。

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血浆蛋白结合[3]
通过超速离心法测定[14C]SQ109与小鼠、大鼠、狗和人血浆蛋白的结合百分比（Barre等人，1985；Boulton等人，1998）。简而言之，[14C]SQ109的加标溶液是通过用无水乙醇稀释储备[14C]SQ109（1 mCi，5.9 mg−1 ml−1）制备的，得到含有5、25或125μg ml−1[14C]SQ109的加样溶液。对于每种物种，将10.8 ml等分血浆与0.22 ml[14C]SQ109的适当加标溶液混合，得到0.1、0.5或2.5μg ml−1的最终SQ109浓度。将血浆混合物放入单独的聚碳酸酯超离心管中，在4°C下以100000×g离心24小时。
[3]
在离心期结束时，分离上乳糜微粒层、中水层和下蛋白颗粒，并测定每层的体积。将蛋白质颗粒溶解在Solune350组织增溶剂中。测定乳糜微粒和水层的重复部分以及溶解蛋白质层的放射性，并计算每层的放射性总量。通过将每层中的放射性量与所有三个离心后血浆样品中的放射性总量之和进行比较，确定每层中放射性的百分比。水层中总放射性的百分比被认为代表SQ109的未结合部分，而乳糜微粒和较低（颗粒）蛋白质层中的放射性总和被认为代表药物的结合部分。

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从感染的LLC-MK2细胞上清液中获取锥鞭毛体，与SQ109（0.05 至 5 μM）在37°C孵育24小时。通过Neubauer计数板计数评估细胞裂解。上鞭毛体在含10% FBS的LIT培养基中培养，并用SQ109（0.5 至 10 μM）在28°C处理120小时；每24小时计数细胞。对于细胞内无鞭毛体，用锥鞭毛体感染LLC-MK2细胞，洗涤，24小时后用SQ109（0.5 至 6 μM）处理96小时。细胞固定，吉姆萨染色，计数寄生虫。感染指数计算为感染宿主细胞百分比乘以每个感染细胞内的平均无鞭毛体数量。[1]
使用番红精作为探针测量线粒体膜电位。将上鞭毛体加入含琥珀酸和番红精的缓冲液中，添加或不添加毛地黄皂苷，加入SQ109或FCCP后监测荧光变化。[1]
溶血实验使用4%的新鲜去纤维蛋白人血悬液，用SQ109（10 至 80 μM）在37°C处理24小时。测量540 nm处的吸光度以确定溶血百分比。[1]
通过在上鞭毛体培养物中添加或不添加6 μM SQ109培养96小时来评估甾醇生物合成抑制。提取脂质，皂化，并通过气相色谱-质谱联用（GC/MS）分析甾醇种类。[1]

小鼠[2]
\n\n本研究使用8周龄雌性C57BL/6小鼠。接种20天后，小鼠分别口服异烟肼（INH，25 mg/kg）、乙胺丁醇（EMB，100 mg/kg）和SQ109（0.1、10和25 mg/kg）。感染但未治疗的对照组小鼠在治疗开始时（早期对照组）或治疗结束后处死。每组包含6只小鼠。治疗开始4周后，小鼠每周接受5天化疗，直至死亡。称重后，无菌取出肺和脾脏。使用2 mL含0.05% Tween-80的无菌PBS匀浆。将不同组织的匀浆样品用PBS稀释10倍后，接种于7H10琼脂平板上。在计算菌落形成单位 (CFU) 之前，将接种后的培养皿在室温下于 37°C 培养三周。使用对数刻度转换活菌计数，并调整读数以反映所有器官的总数。小鼠器官中的存活率和平均 CFU 数用于评估感染程度和治疗效果。\n

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\n\n药代动力学研究 [2]
\n\n雄性 CD2F1 小鼠（23–27 g）分别以 3 mg kg−1（静脉注射）或 25 mg kg−1（口服）的剂量给予 SQ109。在单次静脉注射SQ109后，分别于以下时间点用异氟烷麻醉4至5只小鼠，并从每只小鼠的臂部采集血液样本：单次静脉注射后2、5、10、15和30分钟以及1、3、6、10和24小时；单次口服给药后5、15和30分钟以及1、2、4、6、10和24小时。将每份血液样本收集到含有EDTA的试管中，并离心（2000 × g，10分钟）以分离血浆和红细胞。向每200 μl血浆样本中加入10 μl内标溶液（10 μg ml⁻¹）。然后按照先前描述的方法分离和分析SQ109。绘制SQ109与内标的峰面积比值与理论浓度的关系图。样品中的药物浓度根据标准校准曲线计算。药代动力学参数使用 WinNonlin 计算机程序（Pharsight 公司，美国加利福尼亚州山景城）计算，生物利用度计算公式为 (AUCp.o. AUCi.v.−1) × (dosei.v. × dosep.o.−1) × 100%。\n

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\n\nSQ109 在多次给药 28 天后重要组织中的水平 [2]
\n\n为了确定 SQ109 的组织水平是否与其在 H37Rv 感染小鼠模型中的疗效相关，以及 SQ109 是否会在多次给药的长期过程中在靶组织中积累，在多次给药期间监测了肺、脾、肝、肾和心脏中的 SQ109 水平。简而言之，C57BL/6 小鼠连续 28 天以 10 mg kg⁻¹ day⁻¹ 的剂量灌胃给予 SQ109。分别于第 1、14 和 28 天，在灌胃给药后 1 小时，每组 5 只小鼠用 CO₂/O₂ 麻醉。采集血液和五种重要组织。采用下述方法制备血浆和组织匀浆进行分析。绘制 SQ109 在不同组织基质中的标准曲线以进行定量分析。\n

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\n\n单次给药后 SQ109 的组织分布和消除 [2]
\n\n雄性 CD2F1 小鼠（25–27 g）饲养于悬挂式金属代谢笼中，以收集其尿液和粪便，测定 SQ109 的排泄量。给药前小鼠禁食过夜。研究期间提供饮水。小鼠分别以3 mg kg⁻¹（静脉注射）或25 mg kg⁻¹（口服）的剂量接受SQ109给药。每组四只小鼠，分别于给药后1、4和10小时用异氟烷麻醉，并从每只小鼠的臂部采集血液至含有EDTA的试管中。立即取出组织和器官，分别称重，用冷生理盐水冲洗，并在-20°C下保存，以备后续分析SQ109的含量。分析当天，用剪刀将组织和器官剪碎，并在冰冷的5 mM乙酸铵缓冲液（1:5，w:w）中匀浆。取匀浆液等分试样（200 μl）按先前所述方法提取。\n[2]
\n\n在进行SQ109消除研究时，将四只小鼠分组饲养于代谢笼中，尿液和粪便通过锥形装置分离。在给药前以及单次给药（3 mg kg−1，静脉注射；25 mg kg−1，口服）后4、8、24和32小时，分别收集尿液和粪便。将粪便在12倍粪便体积的5 mM乙酸铵缓冲液中匀浆，离心后取200 μl等分试样按先前所述方法提取。尿液样本用 5 mM 乙酸铵以 1:10 的比例稀释，无需进一步处理。\n

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\n\nSQ109 在大鼠和犬中的药代动力学研究[3]
\n\n药代动力学研究采用留置颈静脉导管的大鼠。大鼠分别接受单次静脉注射 1.5 mg kg−1 (9 mg m−2) 或口服 13 mg kg−1 (78 mg m−2) 的 SQ109（每剂量组 n=8）；大鼠被分为若干亚组，每亚组 4 只。在每个亚组的每只大鼠中，于不同的时间点从颈静脉导管抽取 0.7 ml 血液。单次静脉给药后，分别于 2、5、10、15 和 30 分钟以及 1、3、6、10 和 24 小时采集血样；单次口服给药后，分别于 5、15 和 30 分钟以及 1、2、4、6、10 和 24 小时采集血样。每个血样均经离心分离血浆，然后将血浆储存在 -70°C 直至分析。\n[3]
\n\n比格犬分别以灌胃方式给药，剂量为 3.75 或 15 mg kg−1（75 或 300 mg m−2），或以静脉方式给药，剂量为 0.45 或 4.5 mg kg−1（9 和 90 mg m−2）。单次静脉给药后 2、5、10、20 和 30 分钟以及 1、2、4、8、12、18 和 24 小时，或单次口服给药后 10、20 和 30 分钟以及 1、2、4、8、12、18 和 24 小时，从犬颈静脉抽取 0.7 ml 血液。\n [3]
\n\n每份血液样本均收集于含 EDTA 的试管中，并离心（2000 × g，10 分钟）以分离血浆和红细胞。向每 200 μl 血浆样本中加入 10 μl 内标溶液（10 μg ml−1）。然后根据先前描述的步骤（Jia 等，2005b），采用 LC/MS/MS 方法分离和分析 SQ109。将 SQ109 与内标的峰面积比值与理论浓度作图。根据标准曲线计算血浆样品中的药物浓度。使用 WinNonlin 计算机程序计算药代动力学参数，生物利用度计算公式为 (AUCp.o. AUCi.v.−1) × (dosei.v. dosep.o.−1) × 100%。\n

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\n\n[14C]SQ109 在大鼠体内的组织分布和消除[3]
\n\n将 [14C]SQ109 (5.8 mg ml−1) 用 0.9% 无菌生理盐水稀释 4.4 倍，得到含有 1.3 mg ml−1 SQ109 (225 μCi ml−1) 的制剂。雄性Fischer大鼠（271–289 g）被单独饲养于代谢笼中，并累积收集尿液和粪便以测定[14C]SQ109的排泄率。大鼠经灌胃给予13 mg kg⁻¹的[14C]SQ109。分别于给药后0.5、5、10和24小时处死大鼠（每个时间点n=3），以收集血液、组织和器官进行定量分析。将组织、肠道内容物和粪便在10倍体积的水中匀浆。取两份全血、组织匀浆、肠道内容物和粪便匀浆，用组织溶解剂Soluene 350消化，并用30%过氧化氢脱色以消除化学发光。将样品与冰醋酸和闪烁液混合后进行放射性测定。将尿液和笼子冲洗液的两份等分试样与闪烁液混合后进行放射性测定。\n[3]
\n\n将胴体碎片用650毫升10N氢氧化钠溶液消化，在37℃下保持3天，然后在室温下直至胴体完全溶解（约2周）。将每份溶解的胴体样品取四份等分试样，用水稀释（1:20，v/v⁻¹）；在加入适当的闪烁剂后，对每份稀释样品的一部分进行放射性测定。经稀释和测定体积校正后，测定了每个样品中[14C]SQ109的放射性，以每分钟衰变数（dpm）表示。\n\n体内疗效研究：雌性C57BL/6小鼠经尾静脉侧注射感染结核分枝杆菌H37Rv（每只小鼠约10⁵ CFU）。感染后20天开始口服SQ109（0.1、10和25 mg kg⁻¹）、异烟肼（INH，25 mg kg⁻¹）或乙胺丁醇（EMB，100 mg kg⁻¹）。每日给药，每周5天，持续4周。设置感染但未治疗的小鼠作为对照组。治疗结束后，对小鼠实施安乐死，无菌取出脾脏和肺脏，匀浆后接种于琼脂平板上，以测定细菌菌落形成单位（CFU）计数。[2]
\n药代动力学/组织分布研究：雄性 CD2F1 或 C57BL/6 小鼠分别接受单次静脉注射（3 mg kg⁻¹）或口服（25 mg kg⁻¹）SQ109，或连续口服（10 mg kg⁻¹ day⁻¹，持续 28 天）给药。在给药后特定时间点采集血液和组织（肺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏）。将组织匀浆后，采用经验证的 LC/MS/MS 方法测定血浆和组织匀浆中的药物浓度。[2]

单次静脉或口服给药后，SQ109进入小鼠体循环后，肺和脾脏中的浓度迅速达到峰值，远高于其对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC），且未出现注射部位刺激、活动受限、毛发蓬乱、共济失调、震颤、抽搐、呕吐、腹泻、呼吸困难和急性死亡等明显副作用。口服给药后，呼吸道中SQ109的浓度在10小时以上仍高于MIC（图5）。这种化合物从血液循环快速转移至肺部血管化组织可能与其化学结构中含有金刚烷三环片段有关（图1）。市售的含金刚烷的抗病毒药物（如金刚乙胺和金刚烷胺）通过抑制感染起始和病毒组装（Hay等，1985）以及阻断病毒脂质膜上的离子通道（Griffin等，2003）来对抗流感A等病毒性肺部病原体。这些药物特异性地分布于肺部，且具有较大的稳态分布容积（Vss）（Hoffman等，1988）。金刚烷结构很可能也是体内和体外抗结核活性的关键组成部分：在体外和体内活性最强的七种化合物中，有四种乙胺丁醇类似物分子中含有金刚烷基部分（未发表的观察结果）[2]。SQ109与其他乙胺丁醇类似物一样，具有较大的稳态分布容积（Vss）。其较大的稳态分布容积（Vss）可能也归因于化合物的疏水部分和二胺结构，这使得药物能够快速渗透到血管外间隙，并具有良好的组织动力学，尤其是在肺和脾脏中（图3和图5）。在每日给药过程中，SQ109在肺和脾脏中的浓度始终高于最低抑菌浓度（MIC）。这一发现表明，在动物模型和患者中，口服SQ109可能有利于药物在这些器官中富集，而分枝杆菌在疾病期间正是在这些器官中复制。在小鼠口服25 mg kg⁻¹剂量的SQ109后，很容易在小鼠器官中检测到该药物，这清楚地表明大部分剂量被组织吸收。[2]然而，药代动力学研究表明，SQ109的口服生物利用度低于其在分枝杆菌疾病中的体内疗效和组织分布所显示的水平（表2）。任何化合物口服生物利用度低的原因包括：[2]
口服吸收不良：相同剂量下，口服SQ109的Cmax值比静脉注射SQ109的Cmax值低约80倍，表明肠道吸收存在问题。许多候选药物因肠道吸收问题而失败，因为分子必须能够穿透由磷脂双分子层构成的细胞膜才能穿过肠道进入血液循环。此外，本研究的两项发现表明SQ109的肠道通透性问题并不严重：(i) 该药物能够穿过多种细胞膜，并在体外感染巨噬细胞的吞噬体中达到有效浓度（图2）；(ii) 即使在体内测试的最低剂量0.1 mg kg−1下，也有足够的药物穿过肠道并分布到肺和脾脏，使其浓度远高于体外MIC，从而产生有效的抗菌作用（表1）。[2]
首过效应：静脉注射后，SQ109在肝脏（药物代谢的主要器官）中的浓度低于大多数组织（包括脑）中的浓度（图5）。然而，相对于其他组织中的SQ109浓度，小鼠口服给药后肝脏中的SQ109浓度高于静脉注射给药后（图3和图5）。这些数据表明，口服给药后，SQ109 可能在肝脏经历首过代谢。目前，我们已在将 SQ109 与小鼠和人肝微粒体以及重组 CYP450 同工酶孵育后，鉴定出四种代谢物。[2]
SQ109 与血液蛋白的解离常数较高，导致其通过组织重分布迅速从体循环中消失。口服给药后，SQ109 的组织浓度变化过程与该物质首先在肝脏中滞留，随后重分布至肺、脾和肾脏的代谢过程相符（图 3 和图 5）。[2]
许多药物虽然生物利用度存在明显问题，但对靶病原体却具有良好甚至极佳的疗效。例如，卤夫酮是一种用于预防家禽球虫病、治疗牛隐孢子虫病和泰勒虫病以及治疗人类多种疾病的药物。该药物口服生物利用度极低（Stecklair等，2001）。与SQ109类似，口服给药后，哈洛夫吉酮在靶组织中的浓度比血浆浓度高50-2000倍。大多数抗生素药物并非在血浆中发挥作用，而是作用于特定的靶组织，这些药物必须从中心室分布到这些靶组织中（Muller等，2004）。近期研究进一步表明，靶部位的抗生素药物浓度可能与相应的血浆药物浓度存在显著差异，靶部位的药物浓度比血浆浓度更有助于临床试验的设计，并且是临床疗效的重要决定因素（Ryan，1993；Presant等，1994；Joukhadar等，2001）。在这方面，SQ109 与其抗结核活性相比，表现出良好的靶向组织分布特性。[2]
有趣的是，在连续给药 28 天后，SQ109 似乎优先在肺和脾脏中积聚。当我们比较单次给药后第 14 天和第 28 天稳态药物浓度与第 1 天的浓度时，发现 SQ109 在这两个组织中的积聚具有统计学意义，而在其他组织中 SQ109 的浓度略有增加（图 3）。当药物处置动力学为一级动力学时，多次给药后稳态组织浓度应该更高。这表明，SQ109 在组织中的上调或下调可能与酶促反应无关。这些结果也解释了SQ109浓度-时间曲线与其观察到的抗结核作用之间的复杂关系（图4和图5）。[2]总之，SQ109在体外对生长于宿主小鼠巨噬细胞内的结核分枝杆菌H37Rv菌株具有抗菌活性，在体内对接种H37Rv的小鼠模型也具有抗菌活性。连续28天口服SQ109可显著降低小鼠脾脏和肺部的结核分枝杆菌载量。在28天口服给药过程中监测小鼠重要组织中SQ109的水平，结果表明，潜在作用部位（例如肺和脾脏）的SQ109浓度至少是其最低抑菌浓度（MIC）的10倍。SQ109在各种组织中均表现出较大的分布容积。尽管SQ109的口服生物利用度较低，但其靶组织浓度至少比血浆浓度高120倍。本研究为将体外疗效参数整合到SQ109的体内药代动力学和药效学评价中提供了重要见解，并应有助于该化合物未来的临床试验。[2]

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SQ109具有亲脂性，水溶性低。由于不同物种肠道上皮细胞生物膜的性质相似，且吸收过程（简单扩散）本质上是特定药物与生物膜之间的相互作用（Lin，1995；Martinez等，2002），因此其在受试动物物种中的吸收时间应具有可比性。本研究结果支持了这一观点，结果表明，SQ109 的 Tmax（约 0.5 小时）在小鼠、大鼠和犬中相似（表 1 和表 2）。[3]SQ109 与其他乙胺丁醇类似物一样，在小鼠体内具有较大的稳态分布容积 (Vss)（Jia 等，2005b，2005c）。本研究在大鼠和犬中也观察到了相同的现象。尽管基于实验测定的理化参数预测 Vss 的方法可以预测接近实际值的 Vss，但必须记住，基于药物或血浆的模型将药物渗透到假想的均质隔室的过程称为“组织渗透”。这种概念具有误导性，因为它没有考虑到不同异质器官系统的独特性（Muller 等，2004）。因此，它很少对应于实际的体积，例如血浆容量、细胞外液或总体液量。药物分布可遍及体内任何一种或多种组织和体液。此外，药物与组织成分的结合可能非常强烈，以至于稳态分布容积（Vss）可达人体总体体积的数倍（Rowland & Tozer，1995）。最重要的是，必须考虑到抗感染药物的实际靶空间是组织间隙液（Ryan，1993）[3]。许多药物在从胃肠道吸收进入体循环时会受到“首过效应”的影响。负责产生这种效应的器官（例如，肠、肝和肺）依次排列，并可能降低药物的生物利用度。通过比较不同给药途径获得的AUC值，可以间接评估每个器官的贡献（Pang & Gillette，1978）。根据SQ109的组织浓度-时间数据（图3），可以得出结论：由于该药物的Tmax相对较快（约0.5小时），SQ109能够轻易穿透肠上皮细胞的生物膜。组织浓度-时间数据还表明，肝脏在SQ109的清除和代谢中发挥着重要作用。这一发现基于以下数据：（1）肝脏中[14C]SQ109的浓度最高（不包括胃肠道中的[14C]SQ109浓度）；（2）肝脏中[14C]SQ109的浓度至少比全血中的浓度高200倍；（3）采用LC/MS/MS方法直接测定SQ109本身，结果显示肝脏中SQ109的浓度显著低于肺、脾、肾和心脏中的浓度（Jia等，2005b）。然而，放射性测定结果表明肝脏中放射性物质含量最高。这种差异可以解释为：LC/MS/MS 方法的开发旨在高度特异性地检测药物的母体分子，而无法检测到任何代谢物。放射性测定可以检测所有含¹⁴C的成分，包括母体化合物和 SQ109 的任何相应代谢物。这些数据表明，SQ109 在进入体循环之前，会在肝脏经历首过代谢。[3]
多种因素可能影响特定药物的清除率 (CL)，包括血浆蛋白结合率、代谢和肝血流量。对于清除率高的药物，肝血流量会限制其清除率（Boxenbaum，1980）。这一规律或许可以解释 SQ109 清除率的种属差异。尽管不同物种间肝微粒体对SQ109的代谢存在轻微差异（图4），但犬体内SQ109的清除率（CL）是小鼠和大鼠的四倍，这可能是由于犬的肝血流量较高（Davies & Morris, 1993）。从动力学角度来看，药物分布通常定义为体内药物总量与血浆或血液浓度的比值。SQ109与血浆蛋白的结合率相对较低（表5），但与组织蛋白的结合率较高（Jia et al., 2005b），且具有较高的生物膜渗透性。因此，其在不同物种间的分布容积非常大（表3）。药物的半衰期与其分布容积成正比，但与其清除率成反比。本研究结果支持该理论，表明SQ109在犬体内的半衰期（t1/2）比在小鼠和大鼠体内更长（表3）[3]。
在本研究中，我们采用超速离心技术测定血浆蛋白结合率，与其他血浆蛋白结合技术相比，该技术避免了非特异性膜结合（Barre等，1985）。为了确定血浆蛋白对药物的结合能力和亲和力，建议至少使用三种药物浓度（例如，0.1、0.5和2.5 μg ml−1）进行测试（Kariv等，2001；Jia等，2003），以阐明结合程度随浓度的变化。如表5所示，总[14C]SQ109浓度增加5倍和25倍，仅导致[14C]SQ109结合分数略有增加。该结果表明，SQ109 的结合亲和力较低但结合容量较高，因为在 25 倍浓度范围内，结合的 SQ109 比例相对恒定，且与药物浓度无关。[3]
由于首过效应，SQ109 在所测试的动物物种中的口服生物利用度相对较低（4%–12%；表 3），这可能与 SQ109 的高肝清除率有关。利用来自不同物种的肝微粒体和 CYP 反应表型分析，我们发现 SQ109 与肝微粒体孵育后代谢迅速（图 4），尽管代谢速率因物种而异。当 SQ109 与单个 CYP2D6 或 CYP2C19 同工酶孵育时，再次观察到肝微粒体诱导的 SQ109 代谢。此外，CYP2D6 和 CYP2C19 的选择性抑制剂以剂量依赖的方式抑制了药物代谢（图 6 和图 7）。因此，CYP2D6 和 CYP2C19 均可被确定为催化 SQ109 代谢的主要 CYP 酶。CYP2D6 和 CYP2C 分别参与约 25% 和 15% 药物的生物转化（Parkinson，1996；Schlichting 等，2000；Tucker 等，2001）。尽管许多药物口服生物利用度低可归因于CYP3A4的广泛代谢，但本研究表明CYP3A4对SQ109的代谢影响甚微。[3]
基于P450反应表型研究，我们提出了SQ109的体外代谢途径，如图5所示。N-亚硝基-SQ109 (M1) 可通过CYP2D6和CYP2C19催化的代谢生成。SQ109分子中有两个氨基，已知最易受-NO亲电攻击的位点可能是第二个氨基，即香叶基取代的氨基。生物亚硝化作用的生物反应性和功能仍存在争议（Williams，1988；Jia等，1996）。 SQ109 的可能代谢途径还包括在其分子上添加一个氧原子，从而生成 m/z 为 347 的代谢物 M2。其中一种代谢物（M2-1，m/z 347）可能是通过金刚烷环的氧化产生的，类似于市售含金刚烷的抗病毒药物利曼他定的代谢途径。另一种单氧 SQ109 代谢物（M2-2，m/z 347）可能是通过香叶基部分中 N-烯丙基双键的环氧化反应形成的，生成相应的环氧化物，该环氧化物可能进一步发生热重排，最终生成酮二胺 SQ109（M2-2）。 N-(2-金刚烷基)乙二胺 (M3，m/z 195) 可能由母体化合物裂解形成，首先是香叶基片段中活性碳原子的羟基化，随后不稳定的中间体发生 N-脱烷基化。M3 的生成通过单一的质谱色谱峰（未显示）得到证实。由于添加到 SQ109 上的两个氧原子的位置不同，M4 的生成途径有多种，但其结构可能相同，m/z 均为 363。很可能发生后续的氧化反应，例如环氧化和N-羟基化（M4-1，m/z 363）和/或环氧化和环氧化（M4-2，m/z 363），这些反应最终生成相应的羟基代谢物。[3]
在SQ109发生的代谢事件中，例如C-氧化和N-羟基化（图5），CYP450的铁(FeO)3+中的氧可能被掺入SQ109中，而SQ109本身保持完整。在N-脱烷基化的情况下，SQ109的氧化之后可能发生热重排，导致剩余脂肪族结构中N-金刚烷胺结构(M3)的裂解，同时(FeO)3+复合物中的氧掺入脂肪族结构中。然而，代谢途径的实际情况以及最终代谢产物在体内的作用意义仍需使用真实代谢物进行进一步研究和验证。[3]总之，本研究系统地展示了SQ109的ADME特征在不同物种间的异同，以及其较大的稳态分布容积（Vss）和相对较低的口服生物利用度。口服[14C]SQ109后，肝脏中的放射性水平最高。这可能代表SQ109存在显著的首过效应，正如SQ109在肝微粒体中的快速代谢所证实的那样，该代谢主要由CYP2D6和CYP2C19催化。粪便和尿液排泄分别占[14C]SQ109总剂量的22.2%和5.6%。这些结果以及我们之前的研究结果均不能保证SQ109会成为一种成功的抗生素。与任何药物一样，长期使用SQ109也可能产生毒性。尽管如此，这显然是最有前景的新型抗结核药物，它已经通过了多项临床前试验（Lee et al., 2003; Jia et al., 2005a, 2005b, 2005c）。

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小鼠单次静脉注射（3 mg kg⁻¹）后，SQ109的血药浓度峰值（Cmax）为1038 ng mL⁻¹，消除半衰期（t₁/₂）为3.5 h，分布容积（Vd）为11,826 mL kg⁻¹。单次口服（25 mg kg⁻¹）后，Cmax为135 ng mL⁻¹，达峰时间（Tmax）为0.31 h，消除半衰期为5.2 h。口服生物利用度较低，约为4%。 [2]
SQ109 显示出广泛的组织分布。单次静脉注射或口服给药后，肺部药物浓度最高，其次是脾脏和肾脏。肺部药物浓度至少比相应的血浆浓度高 25 倍（静脉注射）和 120 倍（口服）。[2]
在 28 天的重复口服给药（10 mg kg⁻¹ day⁻¹）期间，SQ109 在靶组织中蓄积，尤其是在肺和脾脏中。第 28 天，肺和脾脏中的药物浓度分别约为 6108 ng g⁻¹ 和 7596 ng g⁻¹，至少比其体外 MIC 高 10 倍，并且至少比血浆浓度高 45 倍。[2]
未代谢的 SQ109 的排泄量极少。静脉给药后，32小时内，尿液中以原形排出的剂量不足0.04%，粪便中排出的剂量最多可达1%。口服给药后，尿液中以原形排出的剂量不足0.01%，粪便中排出的剂量约为2%。[2]

SQ109对LLC-MK2哺乳动物细胞的毒性有限，CC50约为9±2.5 μM。其对人红细胞的溶血活性较低，EC50>80 μM，因此相对于锥虫活性，其选择性指数>1600。[1]

[1]. SQ109, a new drug lead for Chagas disease. Antimicrob Agents Chemother. 2015 Apr;59(4):1950-61.

[2]. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of SQ109, a new diamine-based antitubercular drug. Br J Pharmacol. 2005 Jan;144(1):80-7

[3]. Interspecies pharmacokinetics and in vitro metabolism of SQ109. Br J Pharmacol. 2006 Mar;147(5):476-85.

SQ-109 是一种口服有效的小分子抗生素，用于治疗肺结核。目前正处于 I 期临床试验阶段，SQ-109 有望替代目前一线抗结核药物方案中的一种或多种药物，简化治疗方案，并缩短结核病疗程。
抗生素 SQ-109 是一种口服有效的耐酸二胺类抗生素，对包括幽门螺杆菌 (H. pylori) 和结核分枝杆菌 (M. Tuberculosis) 在内的多种细菌具有潜在的抗菌活性。作为一种具有不对称结构的乙胺丁醇类似物，SQ-109 的作用靶点与乙胺丁醇不同。然而，该药物会干扰细胞壁合成，从而导致细胞壁减弱，最终导致细胞裂解。

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药物适应症
已研究用于治疗细菌感染、传染病和寄生虫病（未具体说明）以及结核病。

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作用机制
SQ109 的作用机制与其他用于结核病治疗的抗生素不同，它抑制细胞壁合成，并作用于特定微生物群的多种细胞通路。

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抗菌药物的药理作用强度取决于体内药物的浓度，更具体地说，取决于细菌感染部位药物浓度的达到情况。在本研究中，我们通过药代动力学评估了SQ109浓度随时间的变化，并将这些结果与感染部位浓度与药效学分析量化的活性强度以及对增殖性结核分枝杆菌的疗效之间的静态关系进行了比较。
我们首先在体外巨噬细胞模型中验证了SQ109对结核分枝杆菌的疗效，随后在体内动物模型中进行了进一步测试。两种模型均感染了相同的结核分枝杆菌H37Rv菌株。SQ109能够穿透巨噬细胞吞噬体（结核分枝杆菌复制的场所），从而抑制通常在哺乳动物宿主巨噬细胞内寄生的细菌。在这方面，SQ109的活性与巨噬细胞测试系统中的异烟肼（INH）相当，但优于乙胺丁醇（EMB）（图2）。 SQ109 已证实具有体外活性，并且在体内也表现出剂量依赖性的抗结核活性，通过常规菌落形成单位 (CFU) 水平监测，在 28 天内使肝脏和脾脏匀浆中的细菌载量降低了 1-1.9 个对数单位。在降低脾脏和肺部的分枝杆菌载量方面，异烟肼 (INH，25 mg kg⁻¹ day⁻¹) 的效力均高于 SQ109 (0.1、10 和 25 mg kg⁻¹ day⁻¹) 和乙胺丁醇 (EMB，100 mg kg⁻¹ day⁻¹)（表 1）。目前尚不清楚 SQ109、INH 和 EMB 在体外和体内活性上的差异，但很可能反映了它们分子靶点和药代动力学特性的不同。[2] SQ109 是一种含有 N-香叶基和 N-金刚烷基的乙二胺衍生物。目前该药物正处于针对药物敏感性和耐药性结核病的II期临床试验阶段。其对抗克氏锥虫的主要作用机制被认为是解偶联线粒体膜电位和破坏pH梯度，这与它在细菌中的作用机制类似。该药物还能与角鲨烯合酶结合并抑制甾醇侧链还原，但这些作用不太可能解释其快速的抗寄生虫活性。该药物与泊沙康唑具有协同作用，这可能是通过对甾醇生物合成和阳离子稳态的联合作用实现的。[1]

C22H38N2

330.55

330.303

C, 79.94; H, 11.59; N, 8.47

502487-67-4

5274428

Light yellow to yellow oily liquid

0.97±0.1 g/cm3

5.464

24.06

2

2

9

24

431

0

C/C(C)=C/CC/C(C)=C/CNCCNC1[C@H]2C[C@H]3C[C@@H]1C[C@H](C3)C2

JFIBVDBTCDTBRH-WUROFCERSA-N

InChI=1S/C22H38N2/c1-16(2)5-4-6-17(3)7-8-23-9-10-24-22-20-12-18-11-19(14-20)15-21(22)13-18/h5,7,18-24H,4,6,8-15H2,1-3H3/b17-7+/t18-,19+,20-,21?,22?

N1-((1r,5R,7S)-adamantan-2-yl)-N2-((E)-3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl)ethane-1,2-diamine

SQ109; SQ-109; SQ 109; NSC 722041; 502487-67-4; N-Geranyl-N'-(2-adamantyl)ethane-1,2-diamine; N'-(2-adamantyl)-N-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]ethane-1,2-diamine; 9AU7XUV31A; CHEMBL561057; NSC-722041; NSC722041.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ ~25 mg/mL (~75.63 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。