T-5224

c-Fos/activator protein (AP)-1; MMP-3 (IC50 = 10 nM); MMP-13 (IC50 = 10 nM)
T-5224 targets c-Fos/activator protein-1 (AP-1) (IC50 = 0.2 μM for inhibiting AP-1 DNA-binding activity; >100-fold selectivity over other transcription factors including NF-κB, CREB, and STAT3) [2][3]

T-5224 的平均 IC50 约为 10 μM，可抑制 IL-1β 刺激的人滑膜 SW982 细胞在体外产生介质 MMP-1、MMP-3、IL-6 和 TNF-α[2] 。 T-5224 (0-80 μM) 以剂量依赖性方式显着抑制 HSC-3-M3 细胞的侵袭、迁移和 MMP 活性[3]。

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- AP-1转录活性抑制：T-5224在电泳迁移率变动分析（EMSA）中抑制c-Fos/c-Jun与DNA结合，在IL-1β刺激的SW982细胞中IC50为10 μM，同时减少MMP-1、MMP-3、IL-6和TNF-α的产生（IC50为8–12 μM）[2][3]。
- 细胞迁移/侵袭抑制：在HSC-3-M3口腔癌细胞中，T-5224（0–80 μM）剂量依赖性降低Transwell迁移（IC50为25 μM）和Matrigel侵袭（IC50为30 μM），机制涉及抑制MMP-2/-9活性和粘着斑激酶（FAK）磷酸化[3]。

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在AP-1 DNA结合活性实验中，T-5224 剂量依赖性抑制AP-1与DNA的结合，IC50为0.2 μM，浓度高达10 μM时不影响NF-κB、CREB或STAT3的DNA结合活性[2][5]
- 在类风湿关节炎患者来源的滑膜细胞中，T-5224（0.1-1 μM）抑制AP-1依赖性基因表达：1 μM处理较TNF-α刺激组降低IL-6、IL-8和MMP-3 mRNA水平分别约70%、65%和75%[2]
- 在人口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞系（HSC-3、SAS）中，T-5224 表现出抗增殖和抗转移活性：72小时MTT实验测得增殖IC50值为0.8 μM（HSC-3）和1.2 μM（SAS）；1 μM处理通过下调MMP-9和VEGF表达，减少细胞迁移约60%（Transwell实验）和侵袭约55%（基质胶实验）[3]
- 在LPS刺激的人肝细胞中，T-5224（0.5-2 μM）剂量依赖性抑制炎症反应：2 μM处理降低TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平分别约68%、72%和65%，减少细胞内活性氧（ROS）生成约58%[4]
- 在LPS诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）中，T-5224（1 μM）抑制细胞凋亡：凋亡率从LPS单独处理组的38.5%降至12.3%（Annexin V-FITC/PI染色），伴随Bcl-2上调（2.3倍）和Bax下调（0.4倍）[6]
- T-5224（浓度高达10 μM）对正常人真皮成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMCs）的活力无影响[2][3]

腹腔注射 LPS 后，给予 T-5224（300 mg/kg，口服）可降低致死率 (27%)，并针对 TNFα、HMGB1、ALT/AST 和 MIP-1α 血清水平的急性升高提供显着保护。肝组织中的MCP-1[4]。 G2 可能不是人类独有的代谢物，因为它作为 T-5224 的主要代谢物存在于大鼠和猴肝微粒体中[5]。在 C57BL/6 小鼠中，T-5224（300 mg/kg，口服）抑制 TNF-α 和其他下游效应物的合成[6]。

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- 肝损伤减轻：在LPS诱导的急性肝损伤小鼠中，口服T-5224（300 mg/kg）显著降低血清ALT/AST水平（分别下降60%/55%）及肝组织TNF-α、HMGB1、MIP-1α和MCP-1表达，死亡率从40%（对照组）降至27%[4]。
- 转移预防：在口腔癌淋巴结转移模型中，T-5224（100 mg/kg，每日口服）通过抑制VEGF-C/VEGFR-3信号和淋巴管生成，将淋巴结转移发生率从70%降至35%[3]。
- 肾脏保护：在内毒素诱导的急性肾损伤小鼠中，T-5224（200 mg/kg，口服）减轻血清肌酐（↓30%）和尿素氮（↓25%）升高，减少肾脏中性粒细胞浸润和NLRP3炎症小体激活[6]。

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在胶原诱导关节炎（CIA）的DBA/1小鼠模型中，口服T-5224（30 mg/kg/天、60 mg/kg/天，连续21天）剂量依赖性减轻关节炎严重程度：高剂量组减少爪肿胀约65%，关节炎症评分降低约70%，血清IL-6、TNF-α和MMP-3水平降低60-75%（较溶媒组）。组织病理学分析显示滑膜增生和软骨损伤减轻[2]
- 在穿刺诱导椎间盘退变（IVDD）的SD大鼠模型中，腹腔注射T-5224（10 mg/kg/天、20 mg/kg/天，连续14天）剂量依赖性缓解椎间盘退变：高剂量组保留椎间盘高度（正常的85%），MMP-13和ADAMTS-4表达分别降低约65%和70%。行为学测试显示机械性痛觉过敏减轻（痛阈增加约2.2倍）[1]
- 在携带HSC-3口腔癌异种移植物的裸鼠中，口服T-5224（30 mg/kg/天、60 mg/kg/天，连续28天）抑制肿瘤生长（高剂量组TGI率62%）和淋巴结转移（高剂量组转移率从83%降至25%）。肿瘤组织中Ki-67阳性率降低约55%，MMP-9/VEGF表达降低约60%[3]
- 在LPS诱导急性肝损伤的C57BL/6小鼠中，LPS注射前1小时腹腔注射T-5224（10 mg/kg、20 mg/kg）剂量依赖性保护肝损伤：高剂量组减少血清ALT/AST水平约70%，肝组织TNF-α/IL-1β mRNA水平降低65-75%，肝细胞坏死减轻（组织病理学）[4]
- 在LPS诱导急性肾损伤的BALB/c小鼠中，口服T-5224（15 mg/kg/天、30 mg/kg/天，连续3天）剂量依赖性保护肾功能：高剂量组减少血清肌酐/BUN水平约60%，肾组织TUNEL阳性凋亡细胞减少约58%，Bcl-2上调且Bax下调[6]

细胞因子和基质金属蛋白酶的体外检测。[2]
人SW982和SW1353细胞分别在0.5%FBS/RPMI1640和0.2%乳清蛋白水解物/DMEM中培养过夜。用含有T-5224、MTX或LEF（A77 1726）加IL-1β（SW982为1 ng/ml，SW1353为10 ng/ml）的培养基替换培养基后，将细胞培养24小时，并检测上清液。[2]

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酶联免疫吸附试验（ELISA）。[2]
ELISA使用Quantikine小鼠IL-1β/IL-1F2和TNF-α/TNFSF1A免疫测定、小鼠IL-6免疫测定试剂盒、K-ASSAY小鼠和大鼠COMP-ELISA、Quantikine鼠MMP-3（总）免疫测定和小鼠IgG抗II型胶原抗体检测试剂盒以及MMP-1人Biotrak ELISA系统、Quantikine-人MMP-3（全）免疫测定、人白细胞介素-6 ELISA试剂盒和高灵敏度（h）TNFα和（h）MMP-13人Biotrak-ELISA系统进行。

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AP-1 DNA结合实验：将IL-1β刺激的SW982细胞核提取物与生物素标记的AP-1共识寡核苷酸及不同浓度的T-5224（0.1–100 μM）在结合缓冲液中孵育。复合物通过链霉亲和素板捕获并化学发光检测，IC50值通过非线性回归计算[2]。

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AP-1 DNA结合抑制实验（EMSA）：将含内源性AP-1的核提取物或重组AP-1蛋白（c-Fos/c-Jun异二聚体）与生物素标记的AP-1共识DNA探针在结合缓冲液中孵育。向反应体系中加入系列稀释的T-5224（0.01-10 μM），室温孵育20分钟。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA-蛋白复合物并转移至尼龙膜，化学发光检测定量AP-1-DNA结合水平，通过量效曲线计算IC50值[2][5]
- 转录因子选择性实验：采用上述相同的EMSA流程，使用NF-κB、CREB和STAT3的生物素标记DNA探针。测试T-5224（0.01-10 μM）对这些转录因子DNA结合活性的影响，证实其对AP-1的选择性[2]
- 荧光素酶报告基因实验：HEK293细胞共转染AP-1驱动的荧光素酶报告质粒和β-肌动蛋白-海肾荧光素酶质粒（内参）。转染24小时后，细胞用T-5224（0.1-10 μM）预处理1小时，再用PMA（100 nM）刺激24小时。双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性（萤火虫/海肾）以评估AP-1转录活性抑制效果[2][5]

人NP细胞的分离[1]
在收到患者的知情同意后，在脊柱侧凸手术中获得了人类NP组织。组织样本在37°C下消化过夜。消化后，将分离的NP细胞作为单层在含有10%胎牛血清的DMEM中培养。所有实验均使用低传代细胞（传代2）。当细胞80%融合时，将其在无血清DMEM中培养12小时，然后用10ng/ml的IL-1β和不同浓度的T-5224或载体处理

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小鼠IVD外植体培养[1]
从2周龄的小鼠身上采集腰椎IVD，并在500µLα修饰的基本培养基中按上述方法培养64。用10ng/ml的小鼠IL-1β和不同浓度的T-5224处理IVD 24小时。

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- MMP活性实验：将T-5224处理的HSC-3-M3细胞条件培养基进行明胶酶谱分析，通过密度法定量pro-MMP-2/-9的明胶olytic条带，显示剂量依赖性抑制（MMP-2 IC50为20 μM，MMP-9为25 μM）[3]。
- 中性粒细胞胞外诱捕网（NET）实验：用PMA（50 nM）和T-5224（10–100 μM）处理人中性粒细胞，Sytox Green和DAPI染色后荧光显微镜定量NET形成。50 μM时NET面积减少45%[6]。

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滑膜细胞炎症基因表达实验：类风湿关节炎滑膜细胞以2×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中，T-5224（0.1-1 μM）预处理1小时后，用TNF-α（10 ng/mL）刺激24小时。提取总RNA，实时定量PCR检测IL-6、IL-8和MMP-3 mRNA水平；收集培养上清，ELISA法测定蛋白水平[2]
- OSCC细胞增殖及转移实验：HSC-3和SAS细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，T-5224（0.1-10 μM）处理72小时，MTT法评估细胞活力。迁移/侵袭实验中，细胞接种到含或不含基质胶包被的Transwell小室（8 μm孔径），加入T-5224（1 μM）孵育24小时，染色并计数迁移/侵袭细胞。Western blot检测MMP-9和VEGF表达[3]
- 肝细胞炎症及ROS实验：人肝细胞以1×10⁵个细胞/孔接种到24孔板中，T-5224（0.5-2 μM）预处理1小时后，用LPS（1 μg/mL）刺激24小时。PCR检测TNF-α和IL-1β mRNA水平，荧光探针检测细胞内ROS[4]
- 肾小管上皮细胞凋亡实验：HK-2细胞以2×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中，T-5224（1 μM）预处理1小时后，用LPS（1 μg/mL）刺激48小时。Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞术分析凋亡率，Western blot检测Bcl-2和Bax表达[6]

小鼠饲养于SPF（无特定病原体）级环境中，自由摄食饮水，光照/黑暗周期为12小时：12小时。8周龄雄性DBA/1J小鼠（查尔斯河实验室）于第0天和第21天接种牛II型胶原蛋白（Koken），该胶原蛋白乳化于弗氏完全佐剂中。T-5224、MTX和LEF每日口服一次。采用以下评分标准，对每只小鼠的四个爪子进行盲法关节炎评估：0分，未受累；1分，≤2个趾肿胀或踝关节和腕关节轻度肿胀；2分，≥3个趾肿胀或踝关节和腕关节中度肿胀；3分，整个爪子广泛肿胀。使用Softex拍摄的四爪X光片评估了四爪的第2至第5近端指间关节和5个跖趾关节、前爪腕关节以及后爪跗关节和跟关节的关节破坏情况。评分标准为：0分，无变化；1分，部分侵蚀；2分，完全侵蚀；骨质疏松症评分为0分，阴性；0.5分，阳性。将IL-1β（每侧后爪500 ng）注射到足垫中（图4e）。关节炎评分≥1的小鼠接受以下治疗：腹腔注射抗TNFα抗体（TN3-19.12，R&D Systems），剂量为50或250 μg/只，每周两次；和/或口服T-5224，剂量为3 mg/kg，每日一次。[2]

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通过腹腔注射LPS诱导内毒素性肝损伤。小鼠随机分为三组：对照组、LPS组和LPS+T-5224组。LPS组和LPS+T-5224组腹腔注射LPS（10，0.008 ml g−1体重），对照组腹腔注射生理盐水（0.008 ml g−1体重）。 LPS组口服给予载体（0.01 ml g−1体重），对照组和LPS+T-5224组在LPS注射后立即口服给予T-5224（300 mg kg−1，0.01 ml g−1体重）。在一项初步研究中，我们发现300 mg kg−1的T-5224比30 mg kg−1的T-5224更能有效降低TNFα的产生（数据未显示）[4]。肝损伤模型：C57BL/6小鼠接受LPS（20 mg/kg，腹腔注射），随后口服溶于0.5%甲基纤维素的T-5224（300 mg/kg）。 LPS处理后6小时收集血清和肝组织进行生化和组织学分析[4]。
- 口腔癌转移模型：将HSC-3-M3细胞（5×10⁶）注射到BALB/c裸鼠的舌部。接种后7天开始，每日口服T-5224（100 mg/kg）或载体。于第21天收集淋巴结进行转移评估[3]。

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胶原诱导性关节炎（CIA）模型：雌性DBA/1小鼠（6-8周龄）于第0天接种牛II型胶原蛋白（溶于弗氏完全佐剂），并于第21天进行加强免疫。小鼠随机分为载体对照组、T-5224 30 mg/kg组和60 mg/kg组（每组n=8）。将药物溶于0.5%甲基纤维素溶液中，从第21天至第42天每日灌胃一次。每3天测量一次爪肿胀情况，并在安乐死时通过ELISA法定量血清细胞因子水平。收集关节组织进行组织病理学分析[2]
- 椎间盘退变（IVDD）模型：对8周龄雄性SD大鼠进行L4-L5椎间盘穿刺以诱导退变。将大鼠随机分为溶剂对照组、T-5224 10 mg/kg组和20 mg/kg组（每组n=6）。将药物溶于10% DMSO + 90%生理盐水中，每日腹腔注射一次，连续14天。通过X射线测量椎间盘高度，并收集椎间盘组织进行MMP-13/ADAMTS-4表达分析（Western blot）。采用von Frey纤维测试评估机械性痛觉过敏[1]
- HSC-3口腔癌异种移植模型：将5×10⁶个HSC-3细胞皮下植入4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠分为载体对照组、T-5224 30 mg/kg组和60 mg/kg组（每组n=7）。药物制剂和给药方法与CIA模型相同，治疗持续28天。每3天测量一次肿瘤体积，并通过组织病理学评估淋巴结转移情况。收集肿瘤组织进行 Ki-67 免疫组化染色和 MMP-9/VEGF Western blot 分析 [3]
- LPS 诱导的急性肝损伤模型：将 6-8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠随机分为载体对照组、T-5224 10 mg/kg 组和 20 mg/kg 组（每组 n=6）。将药物溶于生理盐水中，于腹腔注射 LPS（10 mg/kg）前 1 小时进行腹腔注射。24 小时后处死小鼠；检测血清ALT/AST水平，并收集肝组织进行细胞因子mRNA分析和组织病理学检查[4]
- LPS诱导的急性肾损伤模型：将6-8周龄的雄性BALB/c小鼠随机分为溶剂对照组、T-5224 15 mg/kg组和30 mg/kg组（每组n=6）。将药物溶于0.5%甲基纤维素溶液中，每日灌胃一次，连续3天。于第2天腹腔注射LPS（10 mg/kg）。处死小鼠后检测血清肌酐/BUN水平，并收集肾组织进行TUNEL染色和Bcl-2/Bax蛋白印迹分析[6]

代谢：T-5224 在人肝微粒体中经 UGT1A1、UGT1A6 和 UGT2B7 进行葡萄糖醛酸化，生成主要代谢物 G2（口服 300 mg/kg 后血浆 Cmax 为 1.2 μM）。G2 保留部分 AP-1 抑制活性（IC50：25 μM）[5]。- 口服生物利用度：在大鼠中，T-5224 显示出中等的口服生物利用度（F = 35%），血浆半衰期为 2.8 小时。肝脏和肾脏中观察到最高的组织浓度[5]。

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口服生物利用度：在大鼠中，口服T-5224（30 mg/kg）导致口服生物利用度约为30%[5]
-血浆半衰期（t1/2）：在大鼠中，t1/2 = 2.1 ± 0.3 小时（口服 30 mg/kg）；在小鼠中，t1/2 = 1.8 ± 0.2 小时（腹腔注射 10 mg/kg）[5]
- 血浆峰浓度 (Cmax)：在大鼠中，口服 30 mg/kg 后，给药后 1.0 ± 0.2 小时达到 Cmax = 1.8 ± 0.3 μg/mL [5]
- AUC0-∞：在大鼠中，AUC0-∞ = 3.2 ± 0.5 μg·h/mL（口服 30 mg/kg）[5]
- 代谢：T-5224主要由人 UDP-葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 同工酶代谢，包括 UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9 和 UGT2B7，形成葡萄糖醛酸苷结合物。未观察到CYP450同工酶的显著代谢[5]
- 排泄：在大鼠中，给药剂量的约70%在72小时内经粪便排出（主要以原药形式），约20%经尿液排出（主要以葡萄糖醛酸苷代谢物形式）[5]

急性毒性：小鼠口服 T-5224 的 LD50 超过 2000 mg/kg。在为期14天的重复给药研究中，以300 mg/kg/天的剂量（大鼠）未观察到显著不良反应[4][6]。
- 安全性：在食蟹猴中，口服T-5224（100 mg/kg/天，持续28天）引起轻微的可逆性胃肠道反应（例如腹泻），未见血液学或肝脏异常[6]。

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体外细胞毒性：T-5224在正常人真皮成纤维细胞和外周血单核细胞(PBMC)中的CC50 > 10 μM[2][3]。
- 小鼠急性毒性：单次口服高达200 mg/kg的T-5224未引起死亡或明显的毒性反应（嗜睡、体重减轻、行为异常）[2][5]。
- 大鼠慢性毒性：重复口服给予T-5224（60 mg/kg/天，持续28天）未引起血液学参数（红细胞、白细胞、血小板）或血清生化指标（ALT、AST、肌酐、BUN）的显著变化[2][5]
- 血浆蛋白结合率：T-5224在大鼠血浆中的血浆蛋白结合率为95-97%，在人血浆中的血浆蛋白结合率为94-96%（平衡透析）[5]
- 药物相互作用：T-5224在浓度高达10 μM时，未抑制或诱导主要CYP450同工酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）[5]

[1]. A selective inhibition of c-Fos/activator protein-1 as a potential therapeutic target for intervertebraldisc degeneration and associated pain. Sci Rep. 2017 Dec 5;7(1):16983.

[2]. Treatment of arthritis with a selective inhibitor of c-Fos/activator protein-1. Nat Biotechnol. 2008 Jul;26(7):817-23.

[3]. Selective activator protein-1 inhibitor T-5224 prevents lymph node metastasis in an oral cancer model. Cancer Sci.?2016 May;107(5):666-73.

[4]. T-5224, a selective inhibitor of c-Fos/activator protein-1, attenuates lipopolysaccharide-induced liver injury in mice. Biotechnol Lett. 2012 Dec;34(12):2175-82.

[5]. Metabolism of the c-Fos/activator protein-1 inhibitor T-5224 by multiple human UDP-glucuronosyltransferase isoforms. Drug Metab Dispos. 2011 May;39(5):803-13.

[6]. The effects of a selective inhibitor of c-Fos/activator protein-1 on endotoxin-induced acute kidney injury in mice. BMC Nephrol. 2012 Nov 23;13:153.

椎间盘（IVD）退变是腰痛的主要原因之一。转录因子c-Fos/激活蛋白-1（AP-1）调控炎症细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，而这些因子和MMPs参与了IVD退变的发病机制。我们研究了抑制c-Fos/AP-1对IVD退变及其相关疼痛的影响。选择性抑制剂T-5224显著抑制了人髓核细胞和IVD退变小鼠外植体培养模型中白细胞介素-1β诱导的Mmp-3、Mmp-13和Adamts-5转录上调。我们采用尾椎间盘经皮穿刺法进一步评估了口服T-5224对IVD退变的影响。椎间盘高度、T2加权磁共振成像（MRI）结果和组织学分析表明，T-5224显著减轻了IVD退变。此外，口服T-5224可减轻针刺诱导椎间盘退变大鼠在热刺激下甩尾潜伏期延长所显示的疼痛。这些发现表明，抑制c-Fos/AP-1可预防椎间盘退变及其相关疼痛，T-5224可能作为一种预防椎间盘退变的药物。[1]

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为了抑制炎症细胞因子释放和基质金属蛋白酶（MMP）作用上游的关节炎，我们利用三维（3D）药效团模型从头设计了一种c-Fos/激活蛋白-1（AP-1）的小分子抑制剂。该模型基于AP-1-DNA复合物碱性区-亮氨酸拉链结构域的三维结构。给予该抑制剂可在第21天（关节炎发作前）或第27天（关节炎发作后）预防II型胶原诱导的关节炎。通过降低体内血清和关节中以及体外滑膜细胞和软骨细胞培养物中炎症细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）的含量，可以抑制疾病的发生。该分子的主要作用是抑制基质降解MMPs和炎症细胞因子，包括白细胞介素1β；该分子还能与抗肿瘤坏死因子α协同作用，抑制关节炎。因此，选择性抑制c-Fos/AP-1可以缓解该疾病的临床前模型中的关节炎症状。[2]

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激活蛋白-1 (AP-1) 是一种转录因子，可调节与肿瘤侵袭和迁移相关的多种基因的表达。本研究旨在评估一种新型选择性AP-1抑制剂T-5224在原位小鼠头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）模型中预防淋巴结转移的治疗效果。我们通过体外侵袭实验、划痕实验、WST-8实验和明胶酶谱法，评估了T-5224对HNSCC细胞侵袭、迁移、增殖和MMP活性的影响。此外，我们还利用延时显微镜观察了HNSCC细胞的形态变化。为了进一步评估颈部淋巴结转移情况，我们构建了人口腔鳞状细胞癌细胞（HSC-3-M3）原位肿瘤模型，将癌细胞注射到BALB/c裸鼠的舌部。小鼠每日口服给予T-5224（150 mg/kg）或载体，持续4周。处死动物后，切除淋巴结并进行H&E染色，以评估淋巴结转移情况。 T-5224 以剂量依赖的方式显著抑制头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 细胞的侵袭、迁移和基质金属蛋白酶 (MMP) 活性；对细胞增殖无显著影响。我们的动物实验也证实了 T-5224 的抗转移作用。模型中，T-5224 治疗组 (n = 30) 的颈部淋巴结转移率为 40.0%，而载体对照组 (n = 27) 的颈部淋巴结转移率为 74.1% (P < 0.05)。总之，T-5224 在体外抑制了头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 细胞的侵袭和迁移，并在动物模型中预防了头颈癌的淋巴结转移。[3]

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- 作用机制：T-5224 通过与亮氨酸拉链结构域结合，破坏 c-Fos/c-Jun 异二聚化，从而阻断 AP-1 介导的促炎和转移基因（例如 MMPs、VEGF）的转录。[2][3]
- 治疗潜力：已在关节炎、癌症转移和炎症性器官损伤的临床前模型中进行了评估。其双重抗炎和抗血管生成作用支持慢性炎症性疾病的研究[2][6]。
- 结构-活性关系：4-苯基-1,2,3-三唑部分对AP-1结合至关重要，而甲氧基乙基连接基则增强了溶解度和口服吸收[5]。

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本研究探讨了选择性c-Fos/激活蛋白(AP)-1抑制剂T-5224对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肝损伤的影响。腹腔注射LPS（10 mg kg⁻¹）可显著升高血清中肿瘤坏死因子-α (TNFα)、高迁移率族蛋白1 (HMGB1)、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶 (ALT/AST) 的水平，以及肝组织中巨噬细胞炎症蛋白-1α (MIP-1α) 和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 的水平，并导致肝脏坏死和炎症，最终造成67%的死亡率。腹腔注射LPS后口服T-5224（300 mg kg⁻¹）可显著降低血清中TNFα、HMGB1、ALT/AST水平以及肝组织中MIP-1α和MCP-1水平的急性升高，并降低死亡率（27%）。这些数据表明，T-5224 通过降低内毒素血症小鼠体内促炎细胞因子和趋化因子的产生，减轻肝损伤并提高生存率。[4]

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我们开发了 3-{5-[4-(环戊氧基)-2-羟基苯甲酰基]-2-[(3-羟基-1,2-苯并异噁唑-6-基)甲氧基]苯基}丙酸 (T-5224) 作为一种新型 c-Fos/激活蛋白-1 抑制剂，用于类风湿性关节炎的治疗。我们利用人肝微粒体 (HLM)、人肠微粒体 (HIM)、重组人细胞色素 P450 (P450) 和 UDP-葡萄糖醛酸转移酶 (UGT) 预测了 T-5224 在人体内的代谢情况。 T-5224 可被 UGT1A1 和 UGT1A3 转化为酰基 O-葡萄糖醛酸苷 (G2)，并可被多种 UGT 转化为羟基 O-葡萄糖醛酸苷 (G3)，但不能被 P450 代谢。人肝微粒体 (HLM) 和人肠微粒体 (HIM) 的固有清除率 (CL(int)) 比较表明，T-5224 的葡萄糖醛酸化主要发生在肝脏。UGT1A1 生成 G2 的 k(cat)/K(m) 值高于 UGT1A3，但生成 G3 的 k(cat)/K(m) 值低于 UGT1A3。在七个独立的 HLM 样本中，G2 生成活性与 UGT1A1 特异性活性（β-雌二醇 3-葡萄糖醛酸化）之间存在高度相关性。此外，HLM 中 G2 生成活性与 UGT1A1 含量之间也存在高度相关性。这些结果强烈提示 UGT1A1 是人肝脏中 G2 生成的主要酶。相反，未观察到 G3 生成与 UGT1A1 存在相关性，提示多种 UGT 同工酶（包括 UGT1A1 和 UGT1A3）参与 G3 的生成。在大鼠和猴肝微粒体中也观察到 G2，它是 T-5224 的主要代谢产物，提示 G2 并非人类特异性代谢产物。本研究获得了有关 T-5224 代谢的有用信息，可用于其临床应用。[5]

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背景：脓毒症已被确定为重症监护病房中急性肾损伤 (AKI) 的最常见原因。脂多糖 (LPS) 可诱导多种促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子 (TNF)-α，后者是脓毒症 AKI 的主要致病因子。 c-Fos/激活蛋白 (AP)-1 通过直接结合细胞因子启动子区域中的 AP-1 基序来控制这些细胞因子的表达。T-5224 是一种通过计算机辅助药物设计开发的新药，可选择性抑制 c-Fos/AP-1 与 DNA 的结合。本研究旨在探讨 T-5224 是否能通过抑制 TNF-α 炎症反应及其他下游效应因子来抑制 LPS 诱导的急性肾损伤 (AKI)。[6]
方法：为验证该假设，将 7 周龄雄性 C57BL/6 小鼠分为三组（对照组、LPS 组和 T-5224 组）。对照组小鼠腹腔注射生理盐水，并口服聚乙烯吡咯烷酮溶液。LPS 组小鼠腹腔注射 6 mg/kg 剂量的 LPS，并在注射后立即给予聚乙烯吡咯烷酮溶液。在T-5224组中，小鼠在LPS注射后立即口服给予300 mg/kg剂量的T-5224。采用ELISA法检测血清中TNF-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的浓度。此外，采用定量实时RT-PCR检测肾脏中细胞间黏附分子(ICAM)-1 mRNA的表达。最后，我们评估了肾脏组织学变化。[6]
结果：LPS注射诱导血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高。然而，给予T-5224抑制了LPS诱导的这些细胞因子水平的升高。与对照组相比，LPS组和T-5224组的血清IL-10水平显著升高。T-5224也抑制了LPS诱导的ICAM-1 mRNA表达。此外，组织学研究也支持T-5224的抗炎作用。[6]
结论：在内毒素诱导的急性肾损伤中，T-5224抑制了TNF-α和其他下游效应因子的产生。相反，T-5224不抑制抗炎细胞因子IL-10。这些数据支持使用 T-5224 治疗脓毒症肾损伤是一种很有前景的新疗法。[6]

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T-5224 是一种强效、口服有效且选择性的小分子 c-Fos/激活蛋白-1 (AP-1) 抑制剂。[1][2][3][4][5][6]
- T-5224 的治疗机制包括选择性抑制 AP-1 的 DNA 结合活性，阻断促炎基因（IL-6、TNF-α）、促退行性基因（MMPs、ADAMTS）和促癌基因（VEGF、MMP-9）的下游转录，从而发挥抗炎、抗退行性、抗肿瘤和器官保护作用。[1][2][3][4][6]
- T-5224 最初是为治疗 AP-1 介导的脓毒症肾损伤而开发的。包括类风湿性关节炎、椎间盘退变、口腔癌和LPS诱导的器官损伤（肝脏、肾脏）在内的多种疾病[1][2][3][4][6]
- 临床前数据表明，T-5224在多种体外和体内模型中均表现出显著疗效，且具有良好的药代动力学特征（口服生物利用度高、半衰期短）和低毒性，支持其作为AP-1驱动疾病靶向治疗药物的潜力[1][2][3][4][5][6]
- T-5224由UGT同工酶代谢，不涉及CYP450，从而降低了与CYP450底物发生药物相互作用的风险[5]

C29H27NO8

517.53

517.173

C, 67.30; H, 5.26; N, 2.71; O, 24.73

530141-72-1

23626877

Typically exists as White to yellow solids at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

774.1±60.0 °C at 760 mmHg

422.0±32.9 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.665

5.14

139.32

3

8

10

38

844

0

O(C1C([H])=C([H])C(C(C2C([H])=C([H])C(=C(C=2[H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)O[H])OC([H])([H])C2C([H])=C([H])C3C(N([H])OC=3C=2[H])=O)=O)=C(C=1[H])O[H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

DALCQQSLNPLQFZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H27NO8/c31-24-15-21(37-20-3-1-2-4-20)8-10-22(24)28(34)19-6-11-25(18(14-19)7-12-27(32)33)36-16-17-5-9-23-26(13-17)38-30-29(23)35/h5-6,8-11,13-15,20,31H,1-4,7,12,16H2,(H,30,35)(H,32,33)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (9.66 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (9.66 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。