T16Ainh-A01

TMEM16A/transmembrane protein 16A
T16Ainh-A01 is an inhibitor of the calcium-activated chloride channel TMEM16A (ANO1) (IC50 ~1.1 µM). It also inhibits the related isoform TMEM16B. [2]

在不显着影响 L 型 Ca2+ 电流的情况下，T16Ainh-A01 (0.3-30 μM) 大大降低了 IClCa 的内向和外向成分，并抑制 RUICC 中的 IClCa [1]。在所有电压下，TMEM16A 氯化物电流（由移液器中 275 nM 游离钙引起）几乎完全被 T16Ainh-A01 (10 μM) 抑制，表明存在电压无关的阻断机制 [2]。

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在跨上皮氯离子梯度下，T16Ainh-A01 (10 µM) 能完全抑制ATP激活的、表达TMEM16A的FRT细胞中的短路电流。 [2]
在原代培养的人支气管上皮细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 对毛喉素激活的CFTR氯离子电导影响很小（抑制率 <10%）。 [2]
在FRT细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 不改变由ATP或离子霉素刺激引起的胞质钙升高。 [2]
在全细胞膜片钳记录中，T16Ainh-A01 (10 µM) 在所有的电压下几乎完全抑制了TMEM16A氯离子电流（由电极液内275 nM游离Ca²⁺诱导），表明其阻断机制不依赖于电压。 [2]
在人唾液腺A253细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 强烈抑制了特征性的外向整流CaCC电流（由电极液内275 nM游离Ca²⁺诱导）。 [2]
在人肠道T84细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 对ATP诱导的总的、持续的CaCC电流影响甚微，但选择性抑制（约50%）了激动剂刺激后的初始瞬时峰值电流。在HT-29肠道细胞和用UTP刺激的CF患者原代支气管上皮细胞中也观察到对初始峰值电流的部分抑制。 [2]
在气道上皮细胞中，如果在UTP刺激后较晚的时间点加入T16Ainh-A01，其对CaCC电流的抑制作用会减弱，这支持了其主要作用于瞬时电流成分的结论。 [2]
在用IL-4（10 ng/ml，处理24小时）上调TMEM16A表达的人支气管上皮细胞中，UTP诱导的初始峰值电流和T16Ainh-A01敏感的电流成分显著增加。 [2]
在T84细胞中，siRNA敲低TMEM16A在表型上模拟了T16Ainh-A01的作用，减少了早期的瞬时电流，但不影响持续的CaCC电流。 [2]

从兔尿道分离的Cajal间质细胞（ICC）表现出Ca2+激活的Cl-电流（I ClCa），这对尿道张力的发展很重要。在这里，我们通过检查“新一代”TMEM16A抑制剂CACCinh-A01和T16Ainh-A01对从新鲜分离的兔尿道ICC（RUICC）记录的I ClCa和对完整兔尿道平滑肌条收缩的影响，来检查TMEM16A（ANO1）是否对此活动有贡献。实时定量PCR实验表明，与TMEM16B和TMEM16F相比，TMEM16A在兔尿道平滑肌中高度表达。单细胞RT-PCR实验表明，新鲜分离的RUICC中仅表达TMEM16A。CACCinh-A01和T16Ainh-A01抑制了用电压钳记录的离体RUICC中去极化诱发的I ClCa，IC50值分别为1.2和3.4μM。同样，CACCinh-A01和T16Ainh-A01也抑制了从-60 mV箝位的RUICC电压中记录的自发瞬态内向电流（STIC）和电流钳中记录的自发性瞬态去极化（STD）。相比之下，CACCinh-A01和T16Ainh-A01仅部分降低了孤立的RUICC中的自发Ca2+波。最后，CACCinh-A01和T16Ainh-A01也显著减少了电场刺激（EFS）引起的兔尿道平滑肌条（RUSM）的神经源性收缩。这些数据与TMEM16A参与RUICC和兔尿道平滑肌收缩的CACCs的观点一致[1]。

筛选过程[2]
如所述，使用配备FluoStar荧光板阅读器的自动筛选平台（Beckman）进行高通量筛选。96孔板的每个孔用PBS（200μl/次洗涤）洗涤三次，留下50μl PBS。将试验化合物（0.5μl）以25μm的终浓度加入每个孔中。10分钟后，将96孔板转移到读板器上进行荧光测定。通过连续记录荧光（400 ms/点）2 s（基线），分别测定每个孔的TMEM16A介导的I-内流，然后加入50μl含有200μm ATP的140 mm I-溶液。I−流入的初始速率是通过非线性回归从荧光数据中计算出来的。[2]

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短路电流[2]
将含有表达TMEM16A的FRT细胞、T84细胞或人支气管上皮细胞的Snapwell插入物安装在Ussing室中。将阿米洛利、CFTRinh-172、UTP、ATP和TMEM16A抑制剂加入根尖溶液中，同时将等体积的载体加入基底外侧溶液中。对称的HCO3-缓冲溶液用于T84细胞和人支气管上皮细胞。对于FRT细胞，半腔充满了半Cl-溶液（顶端）和HCO3-缓冲溶液（基底外侧）。将细胞浸泡10分钟稳定期，并在37°C或室温下用95%O2/5%CO2充气。在一些实验中，为了测量根尖氯离子电导率，用制霉菌素（360μg/ml）渗透基底侧膜，并施加氯离子梯度，其中基底侧膜用HCO3-缓冲溶液浸泡，在根尖溶液中用葡萄糖酸钠代替120mm NaCl。使用EVC4000多通道V/I箝位器（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）测量短路电流，并使用PowerLab/8sp记录。[2]

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贴片夹[2]
在室温下对表达TMEM16A的FRT细胞和人颌下腺A253细胞进行全细胞记录。移液管溶液含有130 mm CsCl、0.5 mm EGTA、1 mm MgCl2、1 mm Tris-ATP和10 mm HEPES（pH 7.2）。浴溶液含有140毫米N-甲基-d-葡糖胺-Cl、1毫米CaCl2、1毫米MgCl2、10毫米葡萄糖和10毫米HEPES（pH 7.4）。移液管由硼硅酸盐玻璃制成，经过火抛光后电阻为3-5兆欧。密封电阻在3到10千欧姆之间。在建立全细胞结构后，TMEM16A被100μm ATP或移液管溶液中275nm游离钙（向移液管液中加入1mm CaCl2）激活。通过施加超极化和去极化电压脉冲，从0 mV的保持电位到-100 mV至+100 mV的电位，以20 mV的步幅，引发全细胞电流。在室温下使用Axopatch-200B进行记录。电流用Digidata 1440A转换器数字化，以5kHz滤波，以1kHz采样。[2]

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细胞质钙测量[2]
按照制造商的方案，在镀覆后48小时，将96孔黑壁微孔板中的FRT细胞装载Fluo-4 NW。使用配备注射泵和定制激发/发射滤光片（485/538nm）的FLUOstar Optima荧光板阅读器测量Fluo-4荧光。

全细胞膜片钳记录[1]
采用全细胞膜片钳技术的穿孔贴片配置记录电流。这避免了使用传统全电池配置时遇到的电流耗尽问题。使用抗生素两性霉素B（600μg/ml）穿孔细胞膜。贴片移液管最初通过浸入移液管溶液进行前填充，然后用含两性霉素B的溶液进行后填充。移液管从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径1.17 mm）中拔出，尖端直径约为1-1.5μm，电阻为2-4 mΩ。电压钳位命令通过Axopatch 1D膜片钳放大器传递，该放大器连接到与运行pClamp软件的计算机连接的Digidata 1440A AD/DA转换器。在实验过程中，通过一个由移液管（尖端直径200μm）组成的紧密输送系统，将Hanks溶液持续地注入所研究的细胞，该移液管放置在约300μm远的地方。这可以在死区时间约为5秒的情况下切换到含有药物的溶液。所有实验均在35-37°C下进行。[1]

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钙显像[1]
将细胞置于含有100μM Ca2+的Hanks溶液中，并让其在玻璃底培养皿中沉淀，直到它们粘在一起。然后将它们在室温下在黑暗中在0.4μM fluo-4/AM中孵育6-8分钟，然后在37°C下进行研究。如前所述，使用iXon 887 EMCCD相机（512×512像素，像素尺寸16×16μm）与Nipkow旋转盘共聚焦头连接对细胞进行成像。使用488nm的氪氩激光器激发fluo-4，在波长>510nm处检测到发射的光。使用×60物镜（奥林巴斯）进行实验，得到像素尺寸为0.266×0.266μm的图像。以每秒15帧的速度采集图像。从每一帧中减去使用零帧获得的相机背景荧光，以获得“F”。F 0被确定为在控制条件下振荡之间测量的最小荧光。为了获得用于在图形中显示的事后行扫描图像，在整个单元格的中心绘制了一条一像素厚的线，并调用了ImageJ中的“reslice”命令。图8a显示了一个例子，其中显示了在自发Ca2+波期间拍摄的RUCC电影堆栈中的选定帧。第一帧中显示的白线表示获得图8b所示伪线扫描的区域。因此，重要的是要认识到，伪线扫描图像仅表示沿线长度发生的事件，而不包括发生在该区域之外的事件。∆F/F 0是指测量Ca2+水平从基础到峰值的变化。

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高通量筛选实验： 使用稳定转染了人TMEM16A和卤化物敏感荧光蛋白YFP-H148Q/I152L/F46L的FRT细胞进行TMEM16A抑制剂的筛选。将细胞接种于96孔板，在生理性含氯溶液中与测试化合物（终浓度25 µM）孵育10分钟。然后通过添加含有140 mM I⁻ 和 200 µM ATP的细胞外溶液来触发TMEM16A介导的碘离子内流。通过测量由碘离子内流引起的YFP荧光下降的初始速率来量化抑制效果。 [2]
上皮细胞单层短路电流测量： 将含有细胞单层（表达TMEM16A的FRT细胞、T84细胞或人支气管上皮细胞）的Snapwell小室安装在尤斯灌流室中。细胞浸没在对称的HCO₃⁻缓冲溶液中（对FRT细胞使用半氯溶液），并通以95% O₂/5% CO₂混合气。为了直接测量FRT细胞顶膜TMEM16A电导，使用制霉菌素通透基底膜，并施加跨上皮氯离子梯度。测试化合物添加到顶膜溶液。通过顶膜添加ATP或UTP（100 µM）激活TMEM16A/CaCC。使用电压/电流钳系统测量短路电流。 [2]
全细胞膜片钳记录： 在室温下对表达TMEM16A的FRT细胞或人唾液腺A253细胞进行记录。电极液包含130 mM CsCl， 0.5 mM EGTA， 1 mM MgCl₂， 1 mM Tris-ATP， 10 mM HEPES (pH 7.2)，并添加CaCl₂使游离Ca²⁺浓度达到275 nM以激活通道。浴液包含140 mM N-甲基-D-葡糖胺-Cl， 1 mM CaCl₂， 1 mM MgCl₂， 10 mM 葡萄糖， 10 mM HEPES (pH 7.4)。通过从0 mV的保持电位阶跃到-100 mV至+100 mV之间的电压来诱发全细胞电流。通过比较化合物应用前后的电流来评估抑制效果。 [2]
胞质钙测量： 将FRT细胞接种于96孔板并加载Fluo-4 NW染料。使用酶标仪测量荧光。细胞先用化合物或载体预处理5分钟，然后加入钙激动剂（100 µM ATP 或 1 µM 离子霉素）。通过监测荧光变化来评估化合物是否影响钙信号。 [2]
免疫印迹分析： 裂解细胞，蛋白质通过SDS-PAGE分离，转膜，并用TMEM16A一抗进行孵育。使用二抗和增强化学发光法进行检测。此方法用于确认TMEM16A蛋白表达以及siRNA敲低或IL-4处理的效果。 [2]
RNA干扰敲低实验： 使用脂质体转染试剂，将靶向TMEM16A的siRNA混合物或非靶向对照siRNA转染到T84细胞中。在24小时重复转染一次。在第二次转染后48小时进行功能实验（短路电流）和免疫印迹分析，以评估TMEM16A敲低的效果。 [2]

雄性和雌性新西兰白兔（16-20周龄，体重2.5-4 kg）经戊巴比妥钠（静脉注射）安乐死。取其尿道近端1.5 cm，置于克氏液中，并按照先前描述的方法（Sergeant等，2000）[2]酶法分离单个间质细胞（ICC）。
解剖的兔尿道平滑肌条保存在RNAlater中，于-20 °C保存备用。在提取RNA之前，将组织样本转移至1.5 ml离心管中，液氮速冻，研磨成干粉。使用RNeasy Mini试剂盒从这些样本中提取RNA。所有样本均经DNase处理，纯化的RNA用无RNase水洗脱。使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度后，将纯化的RNA保存于-80 °C。在 cDNA 合成之前，RNA 在 70 °C 下变性 5 分钟，然后迅速置于冰上冷却。使用 Superscript VILO cDNA 合成试剂盒，按照制造商的说明进行 RNA 反转录。兔脑组织平行处理作为对照，并按照上述方法从脑组织 RNA 生成 cDNA。[2]
使用 SYBR Green PCR Master Mix 进行实时定量 PCR (qPCR)。设计了 TMEM16B 和 F 基因特异性引物，以覆盖已知 TMEM16 转录本中的外显子-外显子边界。TMEM16A 引物根据本实验室分离的 5′ 端序列设计。在 qPCR 中，β-肌动蛋白用作内源性参考基因进行样本标准化，并据此设计了 β-肌动蛋白引物。[2]

[1]. Effects of new-generation TMEM16A inhibitors on calcium-activated chloride currents in rabbit urethral interstitial cells of Cajal. Pflugers Arch. 2017 Nov;469(11):1443-1455.

[2]. TMEM16A inhibitors reveal TMEM16A as a minor component of calcium-activated chloride channel conductance in airway and intestinal epithelial cells. J Biol Chem. 2011 Jan 21;286(3):2365-74.

TMEM16A (ANO1) 是一种钙激活氯离子通道 (CaCC)。我们开发了药理学工具，用于研究 TMEM16A 对人呼吸道和肠道上皮细胞中 CaCC 电导的贡献。对约 11 万种化合物的筛选揭示了四类新型小分子 TMEM16A 抑制剂，它们能够完全阻断 TMEM16A 氯离子电流，IC50 < 10 μM，且不干扰钙信号传导。经构效关系分析，其中活性最强的抑制剂为氨基苯基噻唑类化合物 (T16A(inh)-A01)，其 IC50 约为 1 μM。我们鉴定了两种不同类型的抑制剂。一些化合物，例如鞣酸和芳基氨基噻吩类化合物 CaCC(inh)-A01，能够完全抑制人支气管和肠道细胞中的 CaCC 电流。其他化合物，包括T16A(inh)-A01和二没食子酸，对这些细胞中的总CaCC电流抑制作用较弱，但主要阻断了激动剂刺激产生的初始瞬时氯离子电流。TMEM16A RNAi敲低也主要抑制了瞬时氯离子电流。与气道和肠道细胞不同，所有TMEM16A抑制剂均能完全阻断唾液腺细胞中的CaCC电流。我们得出结论，TMEM16A几乎承担了唾液腺上皮细胞中所有的CaCC电流，但在气道和肠道上皮细胞中对总CaCC电流的贡献较小。本文鉴定的小分子抑制剂能够对TMEM16A/CaCC的功能进行药理学解析，并有望成为治疗高血压、疼痛、腹泻和黏液分泌过多等疾病的候选药物。[2]

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T16Ainh-A01是通过使用TMEM16A转染细胞对约11万个化合物进行基于靶点的高通量筛选而发现的。[2]
它属于2-氨基-4-苯基噻唑衍生物，这类化合物通过硫代乙酰基与第二个杂环（例如嘧啶）连接。构效关系（SAR）分析表明，嘧啶环3、4和5位上的取代基均可耐受，所得类似物的IC₅₀值低至约1 µM。 [2]
该研究得出结论，TMEM16A（可被T16Ainh-A01抑制）是人呼吸道和肠道上皮细胞中总CaCC电导的次要成分，主要负责激动剂刺激后产生的初始瞬时氯离子电流。相比之下，TMEM16A几乎承担了唾液腺上皮细胞中所有的CaCC电流。[2]
用IL-4处理呼吸道上皮细胞可显著上调TMEM16A的表达，并增加T16Ainh-A01敏感的电流成分。[2]
研究结果表明，由于TMEM16A在总呼吸道CaCC电导中的作用较小，因此直接激活TMEM16A可能对囊性纤维化治疗无效，但仍需进行基于表型的筛选来鉴定主要的呼吸道CaCC。[2]

C19H20N4O3S2

416.5171

416.098

C, 54.79; H, 4.84; N, 13.45; O, 11.52; S, 15.39

552309-42-9

135460621

White to off-white solid powder

4.565

154.26

2

7

7

28

660

0

CCC1=C(N=C(SCC(NC2=NC(C3=CC=C(OC)C=C3)=CS2)=O)N=C1O)C

QSIYTNYMBWYHAA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20N4O3S2/c1-4-14-11(2)20-18(23-17(14)25)28-10-16(24)22-19-21-15(9-27-19)12-5-7-13(26-3)8-6-12/h5-9H,4,10H2,1-3H3,(H,20,23,25)(H,21,22,24)

2-[(5-ethyl-4-methyl-6-oxo-1H-pyrimidin-2-yl)sulfanyl]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]acetamide

T16Ainh-A01; T16Ainh A01; T16AInh-A01; 2-((5-Ethyl-4-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)thio)-N-(4-(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl)acetamide; 2-[(5-Ethyl-1,6-dihydro-4-methyl-6-oxo-2-pyrimidinyl)thio]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-2-thiazolyl]acetamide; T16Ainh - A01; T16Ainh-A01;; t16a(inh)-a01; 2-[(5-ethyl-6-methyl-4-oxo-1H-pyrimidin-2-yl)sulfanyl]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]acetamide; T16Ainh-A-01

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~200.06 mM)
DMF :≥ 10 mg/mL (~24.01 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。