T16Ainh-A01

TMEM16A/transmembrane protein 16A
T16Ainh-A01 is an inhibitor of the calcium-activated chloride channel TMEM16A (ANO1) (IC50 ~1.1 µM). It also inhibits the related isoform TMEM16B. [2]

在不显着影响 L 型 Ca2+ 电流的情况下，T16Ainh-A01 (0.3-30 μM) 大大降低了 IClCa 的内向和外向成分，并抑制 RUICC 中的 IClCa [1]。在所有电压下，TMEM16A 氯化物电流（由移液器中 275 nM 游离钙引起）几乎完全被 T16Ainh-A01 (10 μM) 抑制，表明存在电压无关的阻断机制 [2]。

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在跨上皮氯离子梯度下，T16Ainh-A01 (10 µM) 能完全抑制ATP激活的、表达TMEM16A的FRT细胞中的短路电流。 [2]
在原代培养的人支气管上皮细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 对毛喉素激活的CFTR氯离子电导影响很小（抑制率 <10%）。 [2]
在FRT细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 不改变由ATP或离子霉素刺激引起的胞质钙升高。 [2]
在全细胞膜片钳记录中，T16Ainh-A01 (10 µM) 在所有的电压下几乎完全抑制了TMEM16A氯离子电流（由电极液内275 nM游离Ca²⁺诱导），表明其阻断机制不依赖于电压。 [2]
在人唾液腺A253细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 强烈抑制了特征性的外向整流CaCC电流（由电极液内275 nM游离Ca²⁺诱导）。 [2]
在人肠道T84细胞中，T16Ainh-A01 (10 µM) 对ATP诱导的总的、持续的CaCC电流影响甚微，但选择性抑制（约50%）了激动剂刺激后的初始瞬时峰值电流。在HT-29肠道细胞和用UTP刺激的CF患者原代支气管上皮细胞中也观察到对初始峰值电流的部分抑制。 [2]
在气道上皮细胞中，如果在UTP刺激后较晚的时间点加入T16Ainh-A01，其对CaCC电流的抑制作用会减弱，这支持了其主要作用于瞬时电流成分的结论。 [2]
在用IL-4（10 ng/ml，处理24小时）上调TMEM16A表达的人支气管上皮细胞中，UTP诱导的初始峰值电流和T16Ainh-A01敏感的电流成分显著增加。 [2]
在T84细胞中，siRNA敲低TMEM16A在表型上模拟了T16Ainh-A01的作用，减少了早期的瞬时电流，但不影响持续的CaCC电流。 [2]

从兔尿道分离的Cajal间质细胞（ICC）表现出Ca2+激活的Cl-电流（I ClCa），这对尿道张力的发展很重要。在这里，我们通过检查“新一代”TMEM16A抑制剂CACCinh-A01和T16Ainh-A01对从新鲜分离的兔尿道ICC（RUICC）记录的I ClCa和对完整兔尿道平滑肌条收缩的影响，来检查TMEM16A（ANO1）是否对此活动有贡献。实时定量PCR实验表明，与TMEM16B和TMEM16F相比，TMEM16A在兔尿道平滑肌中高度表达。单细胞RT-PCR实验表明，新鲜分离的RUICC中仅表达TMEM16A。CACCinh-A01和T16Ainh-A01抑制了用电压钳记录的离体RUICC中去极化诱发的I ClCa，IC50值分别为1.2和3.4μM。同样，CACCinh-A01和T16Ainh-A01也抑制了从-60 mV箝位的RUICC电压中记录的自发瞬态内向电流（STIC）和电流钳中记录的自发性瞬态去极化（STD）。相比之下，CACCinh-A01和T16Ainh-A01仅部分降低了孤立的RUICC中的自发Ca2+波。最后，CACCinh-A01和T16Ainh-A01也显著减少了电场刺激（EFS）引起的兔尿道平滑肌条（RUSM）的神经源性收缩。这些数据与TMEM16A参与RUICC和兔尿道平滑肌收缩的CACCs的观点一致[1]。

筛选过程[2]
如所述，使用配备FluoStar荧光板阅读器的自动筛选平台（Beckman）进行高通量筛选。96孔板的每个孔用PBS（200μl/次洗涤）洗涤三次，留下50μl PBS。将试验化合物（0.5μl）以25μm的终浓度加入每个孔中。10分钟后，将96孔板转移到读板器上进行荧光测定。通过连续记录荧光（400 ms/点）2 s（基线），分别测定每个孔的TMEM16A介导的I-内流，然后加入50μl含有200μm ATP的140 mm I-溶液。I−流入的初始速率是通过非线性回归从荧光数据中计算出来的。[2]

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短路电流[2]
将含有表达TMEM16A的FRT细胞、T84细胞或人支气管上皮细胞的Snapwell插入物安装在Ussing室中。将阿米洛利、CFTRinh-172、UTP、ATP和TMEM16A抑制剂加入根尖溶液中，同时将等体积的载体加入基底外侧溶液中。对称的HCO3-缓冲溶液用于T84细胞和人支气管上皮细胞。对于FRT细胞，半腔充满了半Cl-溶液（顶端）和HCO3-缓冲溶液（基底外侧）。将细胞浸泡10分钟稳定期，并在37°C或室温下用95%O2/5%CO2充气。在一些实验中，为了测量根尖氯离子电导率，用制霉菌素（360μg/ml）渗透基底侧膜，并施加氯离子梯度，其中基底侧膜用HCO3-缓冲溶液浸泡，在根尖溶液中用葡萄糖酸钠代替120mm NaCl。使用EVC4000多通道V/I箝位器（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）测量短路电流，并使用PowerLab/8sp记录。[2]

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贴片夹[2]
在室温下对表达TMEM16A的FRT细胞和人颌下腺A253细胞进行全细胞记录。移液管溶液含有130 mm CsCl、0.5 mm EGTA、1 mm MgCl2、1 mm Tris-ATP和10 mm HEPES（pH 7.2）。浴溶液含有140毫米N-甲基-d-葡糖胺-Cl、1毫米CaCl2、1毫米MgCl2、10毫米葡萄糖和10毫米HEPES（pH 7.4）。移液管由硼硅酸盐玻璃制成，经过火抛光后电阻为3-5兆欧。密封电阻在3到10千欧姆之间。在建立全细胞结构后，TMEM16A被100μm ATP或移液管溶液中275nm游离钙（向移液管液中加入1mm CaCl2）激活。通过施加超极化和去极化电压脉冲，从0 mV的保持电位到-100 mV至+100 mV的电位，以20 mV的步幅，引发全细胞电流。在室温下使用Axopatch-200B进行记录。电流用Digidata 1440A转换器数字化，以5kHz滤波，以1kHz采样。[2]

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细胞质钙测量[2]
按照制造商的方案，在镀覆后48小时，将96孔黑壁微孔板中的FRT细胞装载Fluo-4 NW。使用配备注射泵和定制激发/发射滤光片（485/538nm）的FLUOstar Optima荧光板阅读器测量Fluo-4荧光。

全细胞膜片钳记录[1]
采用全细胞膜片钳技术的穿孔贴片配置记录电流。这避免了使用传统全电池配置时遇到的电流耗尽问题。使用抗生素两性霉素B（600μg/ml）穿孔细胞膜。贴片移液管最初通过浸入移液管溶液进行前填充，然后用含两性霉素B的溶液进行后填充。移液管从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径1.17 mm）中拔出，尖端直径约为1-1.5μm，电阻为2-4 mΩ。电压钳位命令通过Axopatch 1D膜片钳放大器传递，该放大器连接到与运行pClamp软件的计算机连接的Digidata 1440A AD/DA转换器。在实验过程中，通过一个由移液管（尖端直径200μm）组成的紧密输送系统，将Hanks溶液持续地注入所研究的细胞，该移液管放置在约300μm远的地方。这可以在死区时间约为5秒的情况下切换到含有药物的溶液。所有实验均在35-37°C下进行。[1]

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钙显像[1]
将细胞置于含有100μM Ca2+的Hanks溶液中，并让其在玻璃底培养皿中沉淀，直到它们粘在一起。然后将它们在室温下在黑暗中在0.4μM fluo-4/AM中孵育6-8分钟，然后在37°C下进行研究。如前所述，使用iXon 887 EMCCD相机（512×512像素，像素尺寸16×16μm）与Nipkow旋转盘共聚焦头连接对细胞进行成像。使用488nm的氪氩激光器激发fluo-4，在波长>510nm处检测到发射的光。使用×60物镜（奥林巴斯）进行实验，得到像素尺寸为0.266×0.266μm的图像。以每秒15帧的速度采集图像。从每一帧中减去使用零帧获得的相机背景荧光，以获得“F”。F 0被确定为在控制条件下振荡之间测量的最小荧光。为了获得用于在图形中显示的事后行扫描图像，在整个单元格的中心绘制了一条一像素厚的线，并调用了ImageJ中的“reslice”命令。图8a显示了一个例子，其中显示了在自发Ca2+波期间拍摄的RUCC电影堆栈中的选定帧。第一帧中显示的白线表示获得图8b所示伪线扫描的区域。因此，重要的是要认识到，伪线扫描图像仅表示沿线长度发生的事件，而不包括发生在该区域之外的事件。∆F/F 0是指测量Ca2+水平从基础到峰值的变化。

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高通量筛选实验： 使用稳定转染了人TMEM16A和卤化物敏感荧光蛋白YFP-H148Q/I152L/F46L的FRT细胞进行TMEM16A抑制剂的筛选。将细胞接种于96孔板，在生理性含氯溶液中与测试化合物（终浓度25 µM）孵育10分钟。然后通过添加含有140 mM I⁻ 和 200 µM ATP的细胞外溶液来触发TMEM16A介导的碘离子内流。通过测量由碘离子内流引起的YFP荧光下降的初始速率来量化抑制效果。 [2]
上皮细胞单层短路电流测量： 将含有细胞单层（表达TMEM16A的FRT细胞、T84细胞或人支气管上皮细胞）的Snapwell小室安装在尤斯灌流室中。细胞浸没在对称的HCO₃⁻缓冲溶液中（对FRT细胞使用半氯溶液），并通以95% O₂/5% CO₂混合气。为了直接测量FRT细胞顶膜TMEM16A电导，使用制霉菌素通透基底膜，并施加跨上皮氯离子梯度。测试化合物添加到顶膜溶液。通过顶膜添加ATP或UTP（100 µM）激活TMEM16A/CaCC。使用电压/电流钳系统测量短路电流。 [2]
全细胞膜片钳记录： 在室温下对表达TMEM16A的FRT细胞或人唾液腺A253细胞进行记录。电极液包含130 mM CsCl， 0.5 mM EGTA， 1 mM MgCl₂， 1 mM Tris-ATP， 10 mM HEPES (pH 7.2)，并添加CaCl₂使游离Ca²⁺浓度达到275 nM以激活通道。浴液包含140 mM N-甲基-D-葡糖胺-Cl， 1 mM CaCl₂， 1 mM MgCl₂， 10 mM 葡萄糖， 10 mM HEPES (pH 7.4)。通过从0 mV的保持电位阶跃到-100 mV至+100 mV之间的电压来诱发全细胞电流。通过比较化合物应用前后的电流来评估抑制效果。 [2]
胞质钙测量： 将FRT细胞接种于96孔板并加载Fluo-4 NW染料。使用酶标仪测量荧光。细胞先用化合物或载体预处理5分钟，然后加入钙激动剂（100 µM ATP 或 1 µM 离子霉素）。通过监测荧光变化来评估化合物是否影响钙信号。 [2]
免疫印迹分析： 裂解细胞，蛋白质通过SDS-PAGE分离，转膜，并用TMEM16A一抗进行孵育。使用二抗和增强化学发光法进行检测。此方法用于确认TMEM16A蛋白表达以及siRNA敲低或IL-4处理的效果。 [2]
RNA干扰敲低实验： 使用脂质体转染试剂，将靶向TMEM16A的siRNA混合物或非靶向对照siRNA转染到T84细胞中。在24小时重复转染一次。在第二次转染后48小时进行功能实验（短路电流）和免疫印迹分析，以评估TMEM16A敲低的效果。 [2]

Male and female New Zealand white rabbits (16–20 weeks old, 2.5–4 kg weight) were humanely killed with a lethal injection of pentobarbitone (i.v.). The most proximal 1.5 cm of the urethra was removed and placed in Krebs’ solution and individual ICC were isolated enzymatically as described previously (Sergeant et al. 2000).[2]
Dissected strips of rabbit urethra smooth muscle were stored for subsequent use at −20 °C in RNAlater. Immediately prior to isolation of the RNA, tissue samples were transferred to a 1.5-ml tube, snap frozen in liquid nitrogen, and pulverized to yield a dry powder. RNA was isolated from these samples using the RNeasy mini kit. All samples were DNase treated and the purified RNA was eluted with RNase free water. After determination of the RNA concentration using a nanodrop spectrophotometer, the purified RNA was stored at −80 °C. Prior to cDNA synthesis, RNA was denatured for 5 min at 70 °C and then rapidly cooled on ice. RNA was reverse transcribed using the Superscript VILO cDNA synthesis kit according to the manufacturer’s instructions. Rabbit brain tissue was processed in parallel for use as a control, and cDNA was generated from brain-derived RNA as described above.[2]
Real-time quantitative PCR (qPCR) was performed using the SYBR Green PCR Master Mix. TMEM16B and F gene-specific primer sets were designed to span exon-exon boundaries present in the known TMEM16 transcripts. TMEM16A primers were designed from 5′ sequence isolated in our laboratory. β-actin was used in qPCR as an endogenous reference gene for sample normalization, and a β-actin primer set was designed accordingly. [2]

[1]. Effects of new-generation TMEM16A inhibitors on calcium-activated chloride currents in rabbit urethral interstitial cells of Cajal. Pflugers Arch. 2017 Nov;469(11):1443-1455.

[2]. TMEM16A inhibitors reveal TMEM16A as a minor component of calcium-activated chloride channel conductance in airway and intestinal epithelial cells. J Biol Chem. 2011 Jan 21;286(3):2365-74.

TMEM16A (ANO1) functions as a calcium-activated chloride channel (CaCC). We developed pharmacological tools to investigate the contribution of TMEM16A to CaCC conductance in human airway and intestinal epithelial cells. A screen of ∼110,000 compounds revealed four novel chemical classes of small molecule TMEM16A inhibitors that fully blocked TMEM16A chloride current with an IC(50) < 10 μM, without interfering with calcium signaling. Following structure-activity analysis, the most potent inhibitor, an aminophenylthiazole (T16A(inh)-A01), had an IC(50) of ∼1 μM. Two distinct types of inhibitors were identified. Some compounds, such as tannic acid and the arylaminothiophene CaCC(inh)-A01, fully inhibited CaCC current in human bronchial and intestinal cells. Other compounds, including T16A(inh)-A01 and digallic acid, inhibited total CaCC current in these cells poorly, but blocked mainly an initial, agonist-stimulated transient chloride current. TMEM16A RNAi knockdown also inhibited mainly the transient chloride current. In contrast to the airway and intestinal cells, all TMEM16A inhibitors fully blocked CaCC current in salivary gland cells. We conclude that TMEM16A carries nearly all CaCC current in salivary gland epithelium, but is a minor contributor to total CaCC current in airway and intestinal epithelia. The small molecule inhibitors identified here permit pharmacological dissection of TMEM16A/CaCC function and are potential development candidates for drug therapy of hypertension, pain, diarrhea, and excessive mucus production.[2]

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T16Ainh-A01 was identified through a target-based high-throughput screen of ~110,000 compounds using TMEM16A-transfected cells. [2]
It belongs to a chemical class of 2-amino,4-phenylthiazole derivatives linked via a thio-acetyl moiety to a second heterocycle (e.g., pyrimidine). Structure-activity relationship (SAR) analysis indicated that substitutions on the pyrimidine ring at the 3-, 4-, and 5-positions were tolerated, yielding analogs with IC₅₀ values as low as ~1 µM. [2]
The study concluded that TMEM16A, inhibited by T16Ainh-A01, is a minor component of the total CaCC conductance in human airway and intestinal epithelial cells, responsible primarily for an initial transient chloride current following agonist stimulation. In contrast, TMEM16A carries nearly all CaCC current in salivary gland epithelial cells. [2]
Treatment of airway epithelial cells with IL-4 significantly upregulated TMEM16A expression and increased the T16Ainh-A01-sensitive current component. [2]
The findings suggest that direct activators of TMEM16A may not be effective for cystic fibrosis therapy due to its minor role in total airway CaCC conductance, but phenotype-based screens are needed to identify major airway CaCC(s). [2]

C19H20N4O3S2

416.5171

416.098

C, 54.79; H, 4.84; N, 13.45; O, 11.52; S, 15.39

552309-42-9

135460621

White to off-white solid powder

4.565

154.26

2

7

7

28

660

0

CCC1=C(N=C(SCC(NC2=NC(C3=CC=C(OC)C=C3)=CS2)=O)N=C1O)C

QSIYTNYMBWYHAA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20N4O3S2/c1-4-14-11(2)20-18(23-17(14)25)28-10-16(24)22-19-21-15(9-27-19)12-5-7-13(26-3)8-6-12/h5-9H,4,10H2,1-3H3,(H,20,23,25)(H,21,22,24)

2-[(5-ethyl-4-methyl-6-oxo-1H-pyrimidin-2-yl)sulfanyl]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]acetamide

T16Ainh-A01; T16Ainh A01; T16AInh-A01; 2-((5-Ethyl-4-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)thio)-N-(4-(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl)acetamide; 2-[(5-Ethyl-1,6-dihydro-4-methyl-6-oxo-2-pyrimidinyl)thio]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-2-thiazolyl]acetamide; T16Ainh - A01; T16Ainh-A01;; t16a(inh)-a01; 2-[(5-ethyl-6-methyl-4-oxo-1H-pyrimidin-2-yl)sulfanyl]-N-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]acetamide; T16Ainh-A-01

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~200.06 mM)
DMF :≥ 10 mg/mL (~24.01 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。