Taselisib (GDC0032)   中文名称: 他塞利西

PI3Kδ (Ki = 0.12 nM); PI3Kα (Ki = 0.29 nM); PI3Kγ (Ki = 0.97 nM); PI3Kβ (Ki = 9.1 nM)

Taselisib (GDC0032)是一种口服生物可利用的强效选择性 I 类 PI3Kα、δ 和 γ 亚型抑制剂。它对 PI3K β 同工型的抑制作用是 PI3Kα 同工型的 30 倍。根据临床前数据，PI3Kα 同工型 (PIK3CA) 突变体和 HER2 扩增的癌细胞系对 GDC-0032 更具活性。 GDC-0032 的 IC50 值为 2.5 nM，限制 MCF7-neo/HER2 细胞的生长。[1]

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通过筛选Invitrogen的SelectScreen激酶组，也确定了对更广泛激酶的选择性。在用1μM的11l/Taselisib（GDC0032）筛选的235种激酶中，我们发现只有5种激酶的抑制率超过50%：PI3K-C2β、PI3Kα、PI3Kδ、PI3Kγ和hVPS34分别为80.4%、98.6%、97.9%、90.6%和69.9%。值得注意的是，PI3Kβ未被纳入筛选的激酶组。对强效抑制激酶的IC50值的测量表明，我们确实保持了对非I类PI3K的生化选择性，PI3K-C2β和hVPS34的IC50值分别为292和374 nM。与针对PI3Kα的290 pM活性相比，我们对这些潜在的脱靶点实现了1000倍的选择性。[1]

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Taselisib（GDC0032）在携带激活PIK3CA畸变和野生型PTEN的HNSCC细胞系中具有活性[2]
我们在26个HNSCC细胞系中测试了GDC-0032的抗增殖活性，包括大多数市售的HPV阳性HNSCC细胞株。正如预期的那样，HNSCC细胞系存在敏感性梯度。携带PIK3CA突变或扩增的细胞系往往对GDC-0032敏感，IC50值在纳摩尔范围内（图1A）。相比之下，6个对GDC-0032最耐药的细胞系中有4个具有PTEN突变或缺失，这与之前关于PTEN畸变通过上调PI3Kβ信号传导导致对PI3Kα抑制剂耐药的报道一致（33-35）。GDC-0032在活化的PI3KCA细胞中的优先抗增殖作用的观察也在其他肿瘤类型的其他同种型特异性PI3K抑制剂中观察到，这表明这种选择性在临床上可能很重要（36，37）。相比之下，PIK3CA和PTEN状态均与对GDC-0941的敏感性无关，GDC-0491是一种对所有IA类PI3K亚型具有相似效力的泛PI3K抑制剂（图1B）。因此，尽管PIK3CA和PTEN状态可能有助于识别对GDC-0032敏感的肿瘤，但这并不是所有类别的PI3K抑制剂所共有的特性。

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Taselisib（GDC0032）诱导PIK3CA改变的细胞系凋亡[2]
接下来，我们研究了GDC-0032在几种遗传背景下对下游PI3K信号传导的影响。在Cal-33细胞（携带PIK3CAH1047R突变）中用GDC-0032治疗可防止AKT的磷酸化，并抑制下游mTOR靶点，如核糖体蛋白S6激酶（S6K）、真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP-1）和S6（图2A）。这转化为诱导细胞凋亡，通过切割聚ADP核糖聚合酶（PARP）进行评估。在含有PIK3CA扩增的细胞系LB-771中也获得了类似的结果（补充图S1A）。在含有PTEN纯合缺失（UD-SCC-2）或突变（UPCI-SCC-90）的细胞系中，GDC-0032在下调AKT/mTOR信号传导和诱导细胞死亡方面的效果明显较差（图2A和补充图S1B）。这支持了下调PI3K信号传导对于GDC-0032在HNSCC中的促凋亡作用是必要的这一观点。

选择100 nmol/LTaselisib（GDC0032）的剂量用于后续的时间过程实验，该剂量抑制PIK3CA突变细胞系中的AKT/mTOR信号传导，但不抑制PTEN缺失或突变的细胞。该剂量的GDC-0032抑制了Cal-33（PIK3CA突变体）和LB-771（PIK3CA扩增）细胞中AKT和下游信号传导的磷酸化，但对UD-SCC-2（PTEN纯合缺失）或UPCI-SCC-90细胞（PTEN突变体；图2B）中的PI3K信号传导几乎没有影响，证实这是一种抑制PI3Kα但不抑制PI3Kβ依赖性信号传导的GDC-0033浓度。

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Taselisib（GDC0032）具有PIK3CA突变/扩增的放射增敏细胞[2]
鉴于抑制PI3K信号传导被认为会影响DNA损伤修复（DDR）蛋白的表达（19，20，38），并改变DDR信号传导对辐射的反应（15，17），我们接下来试图研究GDC-0032对用辐射处理的HNSCC细胞系的影响。在Cal-33细胞（PIK3CAH1047R）中，GDC-0032和辐射的组合导致比单独使用任何一种治疗都更多的凋亡（Annexin V阳性，PI阴性）和非凋亡（Annexin V阳性，P1阴性）细胞死亡（图3A）。GDC-0032和辐射在PIK3CA突变细胞系Cal-33和HSC-2中也比单独使用任何一种治疗更能减缓细胞生长速率，但在PTEN改变的细胞系UPCI-SCC-90和UD-SCC-2中几乎没有影响（图3B）。在另外三种携带活化PIK3CA改变的细胞系（LB-771、SNU-1076和HSC-2）中，使用Annexin染色证实了与单独使用任何一种治疗相比，联合辐射和GDC-0032的抗肿瘤作用增强，而在携带野生型PIK3CA和/或失活PTEN改变的细胞系（HSC-3、UD-SCC-2、HSC-4和FaDu；图3C）中没有观察到明显的额外活性。在结构上无关的p110α抑制剂BYL719（补充图S2）和A66（补充图S3）中也观察到了类似的结果，表明GDC-0032主要通过抑制p110α诱导辐射后的细胞死亡，而不是抑制其他PI3K亚型或脱靶酶。

使用变构AKT抑制剂MK-2206或变构mTORC1抑制剂RAD001抑制其他下游PI3K成分也会增加辐射诱导的细胞凋亡，尽管其程度小于Taselisib (GDC0032)（图3D）。PIK3CA突变的细胞系HSC-2也观察到了类似的结果，尽管RAD001没有增强该细胞系中辐射诱导的凋亡（补充图S4）。

评估放射增敏的金标准是克隆存活率。使用该试验，用Taselisib（GDC0032）预处理的Cal-33细胞在辐射后的细胞存活率显著降低（图3E）。在辐射前用GDC-0032处理LB-771细胞时，也观察到类似的放射增敏作用（补充图S5）。然而，GDC-0032对HSC-3的辐射反应没有影响，HSC-3是一种对单一药物GDC-0032具有抗性的PIK3CA野生型细胞系（图3D）。

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Taselisib（GDC0032）延迟了辐射后DNA双链断裂的分辨率[2]
PI3K信号传导是DNA损伤反应的关键调节因子（15，17-21，39）。因此，我们决定研究GDC-0032依赖性放射增敏是否至少部分归因于PI3Kα抑制状态下DDR受损。我们定量了Cal-33细胞中经和不经GDC-0032预处理的DNA双链断裂（DSB）的量，通过γH2AX焦点进行评估。用GDC-0032预处理的细胞在照射后24和48小时的γH2AX病灶明显多于对照处理的细胞（图4A）。辐射和GDC-0032结合后DNA损伤的增加伴随着p53结合蛋白1（53BP1）病灶的形成增加，p53结合蛋白是γH2AX下游DSB修复的介质（图4B；参考文献40），并诱导PARP切割（补充图S6A）。在LB-771细胞中也观察到一致的结果（补充图S6B），支持GDC-0032在辐射后损害这些细胞中DSB修复的观点。

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Taselisib（GDC0032）增强辐射后G2-M期阻滞[2]
电离辐射诱导两个分子上不同的G2-M检查点（41）。第一个被称为“早期”G2-M检查点，由一个短暂的、ATM依赖的有丝分裂阻滞组成，该阻滞在照射后几分钟内影响G2晚期的细胞，可以通过照射后组蛋白H3（HH3）磷酸化的细胞比例来评估（41）。第二个检查点更长，被称为“晚期”G2-M检查点，与ATM无关，导致4N DNA含量的细胞积累（41）。人们普遍认为，G2-M检查点的持续时间反映了未修复的DSB的数量（42）。因此，根据我们的研究结果，我们假设GDC-0032可能会改变辐射后发生的DNA损伤诱导的细胞周期阻滞。
作为单一药物，使用Taselisib（GDC0032）治疗导致72小时内G1期细胞比例轻度增加，同时细胞周期的G2期减少（图5A）。

正如预期的那样，辐射诱导了早期和晚期的G2-M检查点，pHH3阳性细胞明显减少（补充图S7），4N DNA含量的细胞积聚（图5B）。然而，在照射后48小时，细胞周期曲线几乎回到了基线。当我们在这种情况下检查PI3Kα抑制的影响时，我们观察到，虽然在照射前用Taselisib（GDC0032）治疗24小时没有显著改变Cal-33细胞的细胞周期特征（图5B），也没有影响pHH3阳性细胞评估的早期G2-M阻滞（补充图S7），但照射后24小时和48小时具有4N DNA含量的细胞比例明显高于对照组。这表明，PI3Kα的药理学抑制增强了辐射诱导的晚期G2-M期阻滞（图5B）。

由于已知晚期G2-M检查点与ATM无关，我们研究了通过抑制G2-M细胞周期进程的其他已知调节因子，如Wee1和ATR，是否可以消除由Taselisib (GDC0032)诱导的增强型晚期G2-M检测点。我们发现，尽管AZD-1775对Wee1的抑制和VE-821对ATR的抑制都消除了pHH3评估的照射后早期G2-M检查点（补充图S8和S9），但只有VE-821的ATR抑制逆转了GDC-0032和辐射联合诱导的晚期G2-M阻滞（图5C和补充图S10）。综上所述，这些结果表明GDC-0032以ATR依赖的方式增强了辐射诱导的晚期G2-M检查点，导致DNA损伤随时间增加。

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Taselisib（GDC0032）体外活性[3]
接下来，我们评估了taselisib在作为长期体外培养建立的所有9个原代细胞系中的抗肿瘤活性（即4个携带HER2/neu基因扩增的细胞系与5个HER2/neu阴性细胞系）。如图1所示，使用标量浓度的taselisib，我们发现与HER2/neu非扩增细胞系相比，所有PIK3CA突变细胞系和/或HER2/neu扩增细胞系都有很强的生长抑制作用（PIK3CA变异细胞系/FISH+的taselisib IC50平均值±SEM=0.042±0.006µM，而PIK3CA野生型/FISH-肿瘤为0.38±0.06µM，P<0.0001）。USPC-ARK-1细胞系对taselisib最敏感，平均抑制浓度（IC50）±标准误差（SEM）为0.014±0.002µM。发现USPC-ARK-4细胞系最不敏感，平均IC50为0.66±0.1µM。代表性剂量反应曲线如图2A所示。其余七种细胞系的剂量曲线反应如图S1所示。我们进一步比较了PIK3CA突变型/FISH+细胞系和PIK3CA野生型/FISH+细胞系的IC50值。与PIK3CA野生型HER2/neu扩增细胞系USPC-ARK-2和USPC-ARK-1相比，携带PIK3CA突变的HER2/neu放大的USC（即USPC-ARK1、USPC-ARK20）对taselisib更敏感（即平均抑制浓度（IC50）±标准误差（SEM）=0.029±0.006µM）（即平均IC50值为0.058±0.007µM，P=0.01）（图2B）。

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Taselisib (GDC0032)对细胞周期的影响 为了评估taselisib在PIK3CA突变/FISH+细胞系（USPC-ARK-1）中的潜在抗增殖作用，在暴露于药物后，通过流式细胞术评估了细胞周期G0/G1期的细胞百分比。如图3所示，与未经处理的对照组相比，用50 nM、100 nM和500 nM的塔斯利西伯处理24小时能够显著增加USC细胞系中处于G0/G1细胞周期期的细胞比例（分别为P=0.0002、P=0.0005、P<0.00001）。

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Taselisib（GDC0032）影响USC细胞系中pS6的表达水平[3]
接下来，我们评估了暴露于taselisib前后，携带PIK3CA突变的代表性HER2/neu扩增的USC细胞系（USPC-ARK-1）中pS6的表达水平。流式细胞术显示，在25 nM下处理4小时后，taselisib能够显著降低S6磷酸化（图4）。在FISH+/PIK3CA突变细胞系中，pS6在处理前的MFI范围为99.6±4.1（平均值±SEM），而在去雄胺处理后的MFI范围是32.3±4.6（P=0.0004）。

Taselisib (GDC0032)药代动力学大致与剂量成正比且与时间无关，平均 t1/2 为 40 小时。 GDC-0032 的添加增加了氟维司群的活性，导致肿瘤消退和肿瘤生长延迟 91%。当 GDC-0032 和他莫昔芬联合使用时，他莫昔芬的体内有效性也会增加（GDC-0032 为 102%TGI）。 [1]

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体内疗效和药效学[1]
在裸鼠体内生长的MCF7-neo/Her2异种移植物模型中，将化合物11l/Taselisib（GDC0032）的体内疗效与化合物1进行了比较。与赋形剂处理的小鼠相比，每天口服45mg/kg的化合物1导致69%的TGI（紫色曲线，图3）。与赋形剂治疗的小鼠相比，每天口服1.4、2.8、5.8、11.25或22.5mg/kg的化合物11l导致TGI剂量依赖性增加（分别为19%、76%、95%、103%和123%）和肿瘤消退。化合物11l的效力和未结合浓度的增加导致TGI（76%）与化合物1（69%）相当，剂量低约16倍（2.8mg/kg对45mg/kg）。与赋形剂对照组相比，化合物1和11l的治疗耐受性良好，观察到体重减轻不到10%（数据未显示）。[1]

在MCF7-neo/Her2异种移植物模型中，还研究了化合物11l/Taselisib（GDC0032）相对于化合物1的药代动力学（PK）和药效学（PD）之间的关系（图4）。在单次给药载体（MCT）1小时后，评估MCF7-neo/HER2肿瘤中Akt的磷酸化水平以及两种化合物的血浆药物浓度，化合物1为45mg/kg，化合物11l为1.4、2.8、5.8、11.25或22.5mg/kg。化合物1导致Akt磷酸化（pAktSer473）水平降低58%，而化合物11l的2.8mg/kg剂量降低16倍，导致Akt磷酸化类似降低（59%）。化合物11l和1的这些剂量之间pAkt的可比下降可能是由于给药1小时后小鼠体内达到了类似的未结合血浆药物浓度（图4）。

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Taselisib（GDC0032）增强体内放疗的抗肿瘤作用[2]
为了测试GDC-0032在体内抑制PI3K信号传导的能力，我们用5mg/kg的Taselisib (GDC0032)治疗植入皮下Cal-33异种移植物的裸鼠，并在治疗2、6和24小时后收获肿瘤。正如预期的那样，在给药后2小时，GDC-0032治疗导致AKT和PRAS40磷酸化几乎完全消除，4EBP-1和S6的磷酸化降低（图6A）。然而，在口服灌胃6小时后，检测到所有这些PI3K靶标的磷酸化反弹，这可能反映了该化合物的半衰期较短。

接下来，我们评估了PI3K抑制和辐射联合治疗的疗效。在整个实验过程中，小鼠每天接受Taselisib（GDC0032）治疗，在第2至6天每天分5次接受20 Gy治疗。尽管与载体治疗的小鼠相比，单独使用辐射或GDC-0032治疗会导致肿瘤生长延迟，但只有GDC-0032和辐射的组合才能导致持久的肿瘤消退（图6B）。事实上，在实验终点（治疗90天），与治疗开始时相比，放疗和GDC-0032联合治疗组的肿瘤均未进展。我们还观察到，在HPV+PIK3CAE545K患者衍生的异种移植物模型中，放疗期间短暂给予GDC-0032具有更优的活性（补充图S11）。这些数据还表明，这两种突变（螺旋结构域的E542K和激酶结构域的H1047R）在HNSCC中都具有功能活性。
此外，我们的体内研究结果表明，即使是对PI3K/AKT/mTOR通路的短暂抑制（图6A）也足以使肿瘤对辐射敏感，这一观察结果具有潜在的临床意义。

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Taselisib (GDC0032)体内活性[3]
我们使用异种移植物USC模型进一步评估了Taselisib（GDC0032）在体内的效果。将10只小鼠随机分为两组，对照组和taselisib组。在携带USC异种移植物的2个治疗组中，没有发现任何全身毒性的迹象，也没有动物在实验过程中死亡或因全身药物毒性的迹象而不得不提前处死。对照组中的一只小鼠必须在7天后处死，因为其肿瘤体积达到1cm3，而其余对照组动物必须在肿瘤体积后的2周内处死。与对照组相比，Taselisib组在治疗14天后显示出显著的肿瘤生长抑制作用（P=0.007；图5 a组），OS显著改善（P<0.0001；图5 B组）。taselisib处理的小鼠的平均存活期为45天。

类 PI3K 同种型的酶活性通过荧光偏振测定来测量，该测定可监测产物 3,4,5-肌醇三磷酸分子的形成，因为它与荧光标记的 PIP3 竞争结合 GRP-1 pleckstrin 同源结构域蛋白。随着 3-磷酸磷脂酰肌醇产物量的增加，标记的荧光团从 GRP-1 蛋白结合位点移位，荧光偏振信号减弱。作为异二聚体重组蛋白，I 类 PI3K 同工型得到表达和纯化。 PIP3 检测试剂、二-C8-PIP2 和四甲基罗丹明标记的 PIP3 (TAMRA-PIP3) 可从 Echelon Biosciences 获得。存在 10 mM Tris (pH 7.5)、25 μM ATP、9.75 mM PIP2、5% 甘油、4 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.05% (v/v) Chaps、1 mM 二硫苏糖醇和 2% (v /v) DMSO 浓度为 60 ng/mL，PI3K 在初始速率条件下测量。在 Envision 读板器上读取荧光偏振之前，在 25° 下运行 30 分钟后，用终浓度为 9 mM EDTA、4.5 nM TAMRA-PIP3 和 4.2 g/mL GRP-1 检测器蛋白停止反应C。剂量反应曲线与 4 参数方程的拟合得出 IC50 值。每个值都是三个实验的平均值，并且所有值的标准差均低于几何平均值。

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体外生化和细胞活性的表征[1]
使用荧光偏振测定法测量I类PI3K异构体的酶活性，该测定法监测产物3,4,5-肌醇三磷酸分子的形成，因为它与荧光标记的PIP3竞争结合GRP-1 pleckstrin同源结构域蛋白。磷脂酰肌醇-3-磷酸产物的增加导致荧光偏振信号的降低，因为标记的荧光团从GRP-1蛋白结合位点移位。I类PI3K亚型购自Perkin-Elmer，或作为异二聚体重组蛋白表达和纯化。四甲基罗丹明标记的PIP3（TAMRA-PIP3）、di-C8-PIP2和PIP3检测试剂购自Echelon Biosciences。PI3Kα在初始速率条件下，在10 mM Tris（pH 7.5）、25μM ATP、9.75μM PIP2、5%甘油、4 mM MgCl2、50 mM NaCl、0.05%（v/v）Chaps、1 mM二硫苏糖醇和2%（v/v。IC50值根据剂量-反应曲线与4参数方程的拟合计算得出。每个报告的值都是三个实验的平均值，并且所有实验的标准偏差都小于一个几何平均值。

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总Akt和磷酸化Akt的分析[1]
将含有150 mM NaCl、20 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1%Triton X-100、磷酸酶抑制剂1、磷酸酶抑制剂II、蛋白酶抑制剂、1 mM NaF和1 mM PMSF的Tris裂解缓冲液加入冷冻肿瘤活检中。用小杵分离肿瘤，在冰上短暂超声处理，并在4°C下以最大转速离心20分钟。使用5-20μg肿瘤裂解物中的蛋白质来确定磷酸化状态。按照制造商的pAkt/tAkt方案，对样品进行了两次分析。

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肝微粒体培养[1]
将LMs（0.5 mL，20 mg/mL）与溶解在甲醇（100μg/mg LMs）中的甲卡西星、G6P脱氢酶（2.88单位/mg LMs）和KPi缓冲液预混合至最终体积为5 mL。通过将NADP（3.33 mg/mL，4 mM）、UDPGA（12.92 mg/mL，20 mM）、G6P（6.8 mg/mL）和GSH（6.15 mg/mL，20mM）加入1 mL 100 mM KPi孵育缓冲液中制备辅因子混合物。加入等体积的辅因子溶液和LMs溶液（2 mg/mL），并在37°C下预孵育5分钟。通过在缓冲液中加入等体积的3（终浓度为5μM）LMs，使LMs的终浓度达到0.5mg/mL，从而引发反应。GSH和NADP的最终浓度分别为5 mM和1 mM。在37°C下孵育1小时后，通过加入乙腈淬灭反应，然后在3400g下离心10分钟。转移上清液并蒸发。样品在10%乙腈水溶液中复溶。

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体外肝细胞代谢产物鉴定试验[1]
使用雄性Sprague-Dawley大鼠（RH；批号MTN）和雄性比格犬（DH；批号OES）的冷冻保存肝细胞。使用冷冻保存的人肝细胞。流动相溶剂为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。将试管在80g下离心5分钟，丢弃上清液。轻轻翻转试管数次，用50 mL预热的DMEM培养基重新悬浮细胞。将试管在80g下离心5分钟，丢弃上清液。细胞在2.5mL预热的DMEM培养基中培养。通过台盼蓝排斥法测定总细胞计数和活细胞数。在含有0.5 mL肝细胞悬浮液（2.2-2.6×106个细胞/mL）和0.5 mL含供试品（20μM）的DMEM培养基的闪烁瓶中进行孵育。将闪烁瓶放置在37°C、5%CO2的加湿培养箱中，以16 rpm的速度旋转的轨道振荡器上。在0和3小时时，用4毫升乙腈淬灭反应。双氯芬酸（10μM）为阳性对照，在与Taselisib (GDC0032)相同的条件下与冷冻保存的肝细胞一起孵育。监测双氯芬酸在3小时内的消失情况，化合物的半衰期在每种物种的预期值范围内。

将细胞接种到 96 孔板中，每孔 500-5,000 个细胞，每孔重复六次，过夜后施用 Taselisib (GDC0032)。 4天后除去培养基后，用4%戊二醛固定细胞30分钟。洗涤并溶解于10%乙酸后，固定细胞用0.1%结晶紫染色2分钟。

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MCF7-neo/HER2细胞增殖分析[1]
细胞系购自美国典型培养物保藏中心。MCF7 neo/HER2在MCF7亲本细胞系中异位表达HER2。细胞系在RPMI中培养，RPMI补充了10%胎牛血清、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mM HEPES和2mM谷氨酰胺，在37°C和5%CO2下培养。将MCF7 neo/HER2细胞或PC3细胞分别以1000个细胞/孔或3000个细胞/孔接种在384孔培养基中，并在加入化合物前孵育过夜，使DMSO的最终浓度达到0.5%v/v。在加入CellTiter Glo试剂并使用Analyst平板读数器读取发光度之前，分别孵育MCF7 neo/HER2细胞3天和4天。对于抗增殖试验，包括细胞生长抑制剂如蚜虫灵和细胞毒性剂如星孢菌素作为对照。剂量-反应曲线拟合为4参数方程，并使用Assay Explorer软件计算相对IC50值。

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增殖试验[2]
将细胞在96孔板中以500至5000个细胞/孔的重复6次接种过夜，然后用Taselisib（GDC0032）处理。4天后，取出培养基，用4%戊二醛固定细胞30分钟。固定的细胞用0.1%结晶紫染色2分钟，然后洗涤，并溶解在10%乙酸中。使用Biotek Synergy H1平板阅读器定量光吸收。

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膜联蛋白V染色[2]
细胞用Taselisib（GDC0032）或DMSO处理24小时，照射或模拟照射，然后胰蛋白酶消化，并在72小时后与培养基中的细胞一起收获。将细胞重新悬浮在膜联蛋白V缓冲液中，根据制造商的说明用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，并用Fortessa流式细胞仪分析荧光。使用FlowJo软件分析结果数据。

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药物反应试验[3]
通过流式细胞术测定Taselisib（GDC0032）对细胞存活率和IC50的影响。来源于9个原代USC细胞系的肿瘤细胞在体外建立为长期培养物，将其铺在6孔组织培养板上，并在铺板后至少24小时用0.05、0.1、0.5、1.0、2.0µM浓度的taselisib处理。在额外孵育72小时后，完整收获孔内容物，离心，然后用碘化丙啶（2µL 500µg/mL PBS储备溶液）染色进行流式细胞术计数。然后使用流式细胞术定量活细胞，作为暴露于不同浓度的taselisib后活细胞相对于载体处理细胞的百分比（平均值±SEM）（即100%活细胞）。每个USC细胞系至少进行3次独立实验。

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原代USC细胞系细胞周期的流式细胞术分析[3]
将USC细胞接种在6孔组织培养板中，24小时后用Taselisib（GDC0032）处理。在暴露于50 nM、100 nM和500 nM药物24小时后，用冰冷的70%乙醇使处理过的细胞和对照细胞透化，并在4°C下固定30分钟。以2000 rpm旋转5分钟并丢弃上清液后，将细胞重新悬浮在1 ml PBS中。在2000 rpm下额外旋转5分钟后，加入100µl核糖核酸酶（100µg/ml），在室温下孵育5分钟，然后暴露于400µl碘化丙啶（PBS中的50µg/ml）。使用Cell Quest软件用FACSCalibur获取经Taselisib处理和未经处理的对照细胞。

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原代USC细胞系中磷酸化S6细胞内水平的流式细胞术分析[3]
接下来，我们通过流式细胞术评估了暴露于Taselisib（GDC0032）前后携带PIK3CA突变的代表性HER2/neu扩增的USC细胞系（即USPC-ARK-1）中pS6的表达水平。在暴露于25nM taselisib 4小时后，将细胞固定在4%甲醛中，并用冰冷的90%甲醇渗透。按照制造商提供的方案，将Taselisib处理和未处理的对照细胞与抗pS6的兔单克隆抗体一起孵育，并用异硫氰酸荧光素偶联的山羊抗兔F（ab'）2免疫球蛋白作为第二试剂进行染色。使用Cell Quest软件在FACSCalibur上分析细胞（即每个样本10000个事件）。

六周龄的Nu/Nu小鼠接受双侧注射，注射液为5×10⁵个细胞，悬浮于200 μL培养基和Matrigel（1:1比例）的混合物中。待肿瘤生长至约100–200 cm³后，将小鼠随机分配至各治疗组，每组8–10个肿瘤。每日灌胃给予溶于含0.5%甲基纤维素和0.2% Tween-80的溶剂中的Taselisib (GDC0032)（5 mg/kg）。[2] 体内实验中，Taselisib (GDC0032)溶于含0.5%甲基纤维素和0.2% Tween-80的无菌水中。 [2]
\n体内异种移植研究[2]
\n从Harlan Laboratories订购了6周龄的Nu/Nu小鼠。对于细胞系来源的异种移植研究，将5 × 10⁵个细胞悬浮于200 μL培养基和Matrigel（1:1比例混合）中，双侧注射到小鼠体内。当肿瘤体积达到约100至200 cm³时，将小鼠随机分为治疗组，每组8至10个肿瘤。Taselisib (GDC0032) (5 mg/kg)溶解于含0.5%甲基纤维素和0.2% TWEEN-80的溶剂中，每日灌胃给药。使用配备合适尺寸铅屏蔽的 X-RAD 320 X 射线系统对肿瘤进行照射。\n
\n对于患者肿瘤来源的异种移植研究，将取自口咽鳞状细胞癌患者的肿瘤植入小鼠体内。使用 CancerSelect-203 R 平台对肿瘤 DNA 进行测序，发现其存在 PIK3CAE542K 突变。当肿瘤体积达到约 100 至 250 cm³ 时，将小鼠随机分为治疗组，每组 5 至 6 个肿瘤。每日灌胃给予 Taselisib (GDC0032)（5 mg/kg），持续 14 天。在第 2 至 4 天，使用约翰·霍普金斯大学的小动物放射研究平台对肿瘤进行每日 2 Gy 的照射。肿瘤体积计算公式为 (π/6) × 长度 × 宽度²。\n

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\n\n药物效应的体内试验[3]
\n为了确定Taselisib (GDC0032)的体内活性，将具有代表性的PIK3CA突变/FISH+细胞系（USPC-ARK-1）注射到10只5-8周龄SCID小鼠的皮下。细胞植入后，监测肿瘤直至其体积达到0.1 cm³，然后开始治疗。随后将小鼠随机分为两组，分别为对照组和Taselisib (GDC0032)组，两组间平均肿瘤体积保持相近。每组包含5只小鼠。对照组给予载体（0.5%甲基纤维素-0.2%吐温80），而Taselisib（GDC0032）实验组给予11.25 mg/kg的Taselisib。两种药物均每日口服一次，每周5天。肿瘤体积按公式V=长度×（宽度）²×0.5计算。每周记录三次肿瘤大小和体重。两组小鼠均接受Taselisib或安慰剂治疗1个月后，观察其总生存期（OS）。当肿瘤体积达到 1 cm³ 或发生坏死时，将动物从研究中移除，并根据机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 制定的规章制度实施安乐死。\n

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\n\n体内异种移植研究 [1]
\n在 MCF7-neo/Her2 异种移植模型中评估了体内疗效。将每只小鼠 500 万个细胞重悬于 Hank's 缓冲盐溶液和 Matrigel 基底膜基质的 1:1 混合物中，并植入雌性无胸腺 (nu/nu) 裸鼠的第 2/3 乳腺脂肪垫。在细胞接种前，将 17-β-雌二醇（0.36 mg/粒，60 天缓释）植入每只裸鼠的背侧肩胛区域。细胞植入后，监测肿瘤直至其平均体积达到 250–350 mm³，然后开始给药。将试验药物如Taselisib (GDC0032)溶解于含0.2% Tween-80的0.5%甲基纤维素(MCT)溶液中，每日经口(PO)灌胃给药。
\n使用数字游标卡尺，根据公式(L × W × W)/2计算肿瘤体积。肿瘤生长指数(TGI)计算为各剂量组每日拟合曲线下面积(AUC)相对于赋形剂的百分比，公式为%TGI = 100(1 – (AUC处理组/天)/(AUC赋形剂组/天))。使用线性混合效应(LME)模型对经Log2转换的个体肿瘤体积数据进行曲线拟合。在研究期间，每周记录两次肿瘤大小和体重。肿瘤体积大于或等于 2000 mm3 或体重较治疗开始时下降 20% 的小鼠，按照 IACUC 指南实施安乐死。\n为了进行药效学标志物分析，将 MCF7-neo/HER2 异种移植瘤从动物体内切除，并立即用干冰速冻。

药代动力学特性[1] 根据目前收集的数据，选择化合物 11c、11k 和 11l/Taselisib (GDC0032) 进行体内药代动力学 (PK) 分析。将每种化合物以单剂量静脉注射（1 mg/kg）或口服（25 mg/kg）的方式给予成年雌性裸鼠。这三种化合物的数据汇总于表 3。与最初的噻唑并苯并氧杂环庚烷抑制剂 2 相比，咪唑并苯并氧杂环庚烷抑制剂（11c、11k 和 11l）在 MCF7-neo/HER2 细胞系中均显示出增强的抗增殖活性（分别为 138、81 和 25 nM）。此外，与它们较低的体外清除率一致，这些优化化合物的小鼠血浆清除率 (CLp) 值也很低。更重要的是，在所有情况下，与噻唑并苯并氧杂环庚烷 2 相比，化合物 11l 的游离清除率 (CLu) 和相应的游离口服暴露量 (AUCu) 均显著提高（>10 倍）。化合物 11l/Taselisib (GDC0032) 在所有测试化合物中具有最高的游离暴露量 (AUCu = 42 μM·h)。基于这些结果，我们选择化合物 11l 在体内肿瘤异种移植研究中与化合物 1 进行直接比较。

[1].Discovery of 2-{3-[2-(1-isopropyl-3-methyl-1H-1,2-4-triazol-5-yl)-5,6-dihydrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oxazepin-9-yl]-1H-pyrazol-1-yl}-2-methylpropanamide (GDC-0032): a β-sparing phosphoinositide 3-kinase inhibitor with high unbound exposure and robust in vivo antitumor activity. J Med Chem. 2013 Jun 13;56(11):4597-610.

[2]. Taselisib (GDC-0032), a Potent β-Sparing Small Molecule Inhibitor of PI3K, Radiosensitizes Head and Neck Squamous Carcinomas Containing Activating PIK3CA Alterations. Clin Cancer Res. 2016 Apr 15; 22(8): 2009–2019.

[3]. Taselisib, a selective inhibitor of PIK3CA, is highly effective on PIK3CA-mutated and HER2/neu amplified uterine serous carcinoma in vitro and in vivo. Gynecol Oncol. 2014 Aug 27;135(2):312–317.

Taselisib (GDC0032) 已用于淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、实体瘤和 HER2/Neu 阴性肿瘤等多种癌症的治疗和基础科学研究。
Taselisib 是一种口服生物利用度高的 I 类磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) α 亚型 (PIK3CA) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。Taselisib 选择性抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路中的 PIK3CA 及其突变体，这可能导致表达 PIK3CA 的肿瘤细胞凋亡和生长抑制。由于该药物特异性靶向 I 类 PI3K α，因此可能比泛 PI3K 抑制剂更有效且毒性更低。 PI3K/Akt/mTOR 通路失调常见于实体瘤，并导致肿瘤细胞增殖、存活率增加以及对化疗和放疗的耐药性增强。PIK3CA 编码 I 类 PI3K 的 p110-α 催化亚基，在多种癌细胞类型中发生突变，并在癌细胞的生长和侵袭中发挥关键作用。

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磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/AKT/mTOR 通路信号传导功能异常会导致肿瘤不受控制地增殖。在发现新型苯并氧杂环庚烷类 PI3K 抑制剂的过程中，我们观察到体内抗肿瘤活性与游离药物暴露量密切相关。通过降低药物的固有清除率，我们合成了一系列咪唑并苯并氧杂环庚烷类化合物，这些化合物在低剂量水平下即可提高游离药物暴露量，并在小鼠异种移植模型中有效抑制肿瘤生长。其中一种化合物Taselisib (GDC0032) (11l) 已进入临床试验阶段，目前正在进行I期临床试验，作为治疗人类恶性肿瘤的潜在疗法。[1]

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总之，我们发现了一类新型化合物，可用于抑制PI3K驱动的肿瘤。优化的关键在于通过降低cLogD作为设计参数来提高游离暴露量（AUCu）。这一改进对体内肿瘤生长抑制产生了显著影响。与所评估的密切相关的苯并氧杂环庚烷骨架相比，咪唑并苯并氧杂环庚烷即使在更低的药物剂量下也表现出更好的肿瘤生长抑制效果。与游离药物假说一致，降低固有血浆清除率（在本例中，这是由于消除了代谢软点）并提高游离暴露量可获得更有效的药物。这种方法至关重要，因为我们拥有大量数据，可用于比较几个密切相关骨架的直接类似物。因此，我们迅速确定了一个合适的支架进行优化，以获得所需的特性。我们的优化工作最终发现了化合物 11l（或 Taselisib (GDC0032)），目前该化合物正在进行临床开发，用于治疗 PI3K 相关癌症。[1]

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目的：PIK3C 激活基因改变在头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 中很常见，并且磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) 信号通路与放射抗性之间存在关联。因此，我们研究了使用对 p110α 具有强效活性的 PI3K 抑制剂 Taselisib (GDC0032) 抑制 PI3K 并联合放射治疗在头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 中的疗效。
实验设计：我们采用结晶紫增殖试验在 26 种 HNSCC 细胞系中体外评估了 Taselisib (GDC0032) 的疗效，并通过蛋白质印迹分析检测了 PI3K 信号通路的变化。细胞毒性和放射增敏作用分别通过流式细胞术 Annexin V 染色和克隆形成存活试验进行评估。采用免疫荧光法检测γH2AX灶来评估DNA损伤修复情况，并采用流式细胞术进行细胞周期分析。在裸鼠异种移植瘤模型中评估了GDC-0032和放射治疗的体内疗效。
结果：Taselisib (GDC0032)能有效抑制PI3K信号通路，并在PIK3CA突变或扩增的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系中表现出更强的抗增殖活性，而PTEN改变的细胞系对其作用相对耐受。GDC-0032预处理可增强PIK3CA突变型HNSCC细胞的放射敏感性，增强放射诱导的细胞凋亡，损害DNA损伤修复，并延长放射后G2/M期阻滞时间。此外，在皮下异种移植模型中，GDC-0032联合放射治疗比单独使用任何一种疗法都更有效。
结论：Taselisib (GDC0032)对携带PIK3CA激活异常的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系具有更高的疗效。此外，在体外和体内，GDC-0032联合放射治疗对PIK3CA改变的HNSCC的疗效均优于单独使用任何一种疗法。该策略值得进一步的临床研究。 [2]

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目的
评估PIK3CA选择性抑制剂Taselisib (GDC0032)对携带PIK3CA突变和HER2/neu基因扩增的原发性子宫浆液性癌(USC)的疗效。
方法
采用流式细胞术体外活力检测法评估Taselisib (GDC0032)对9株原发性USC细胞系的敏感性。通过流式细胞术检测细胞DNA含量和S6蛋白磷酸化水平来评估细胞周期分布和下游信号通路。此外，还在小鼠模型中评估了Taselisib的临床前疗效。
结果
FISH检测显示，4株USC细胞系携带HER2/neu基因扩增，其中2株携带致癌性PIK3CA突变。 Taselisib (GDC0032)在HER2/neu FISH阳性和HER2/neu FISH阳性/PIK3CA突变的USC细胞系中均表现出显著的差异性生长抑制作用，与FISH阴性且PIK3CA野生型的细胞系相比，差异性生长抑制作用更为显著（FISH阳性肿瘤中taselisib IC50平均值±标准误为0.042±0.006 µM，FISH阴性肿瘤中为0.38±0.06 µM，P <0.0001）。Taselisib的生长抑制作用与细胞周期G0/G1期细胞比例的显著剂量依赖性增加以及S6磷酸化水平的剂量依赖性下降相关。在携带PIK3CA突变且HER2/neu过表达的USC小鼠异种移植瘤模型中，Taselisib在体内能有效抑制肿瘤生长（P=0.007）。与对照组小鼠相比，接受 taselisib 治疗的小鼠生存期显著延长 (P<0.0001)。
结论
Taselisib (GDC0032) 为携带 PIK3CA 突变和/或 HER2/neu 基因扩增的患者提供了一种新的治疗选择。[3]

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总之，我们的研究首次在临床前研究中证实，新型 PIK3CA 抑制剂 Taselisib (GDC0032) 可能是一种针对 PIK3CA 突变和 HER2/neu 基因扩增的 USC 的新型、潜在有效的治疗策略。有必要开展 taselisib 在 USC 中的临床试验。[3]

C24H28N8O2

460.5315

460.233

C, 62.59; H, 6.13; N, 24.33; O, 6.95

1282512-48-4

1282512-48-4

51001932

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

783.3±70.0 °C at 760 mmHg

427.5±35.7 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.709

0.69

119.66

1

6

5

34

751

0

O1C([H])([H])C([H])([H])N2C([H])=C(C3=NC(C([H])([H])[H])=NN3C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N=C2C2C([H])=C([H])C(=C([H])C1=2)C1C([H])=NN(C=1[H])C(C(N([H])[H])=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H]

BEUQXVWXFDOSAQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H28N8O2/c1-14(2)32-22(27-15(3)29-32)19-13-30-8-9-34-20-10-16(6-7-18(20)21(30)28-19)17-11-26-31(12-17)24(4,5)23(25)33/h6-7,10-14H,8-9H2,1-5H3,(H2,25,33)

2-methyl-2-[4-[2-(5-methyl-2-propan-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)-5,6-dihydroimidazo[1,2-d][1,4]benzoxazepin-9-yl]pyrazol-1-yl]propanamide

RG7604; RG7604; Taselisib; 1282512-48-4; 2-(4-(2-(1-isopropyl-3-methyl-1H-1,2,4-triazol-5-yl)-5,6-dihydrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oxazepin-9-yl)-1H-pyrazol-1-yl)-2-methylpropanamide; Taselisib [INN]; GDC 0032; Taselisib [USAN:INN]; RG 7604; GDC0032; GDC0032; GDC 0032

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 25~70 mg/mL (54.3~152 mM)
Ethanol: ~7 mg/mL (~15.2 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。