CLK1 (IC50 = 20 nM); CLK2 (IC50 = 200 nM); CLK4 (IC50 = 15 nM)
TG003 targets the CDC2-like kinase (Clk) family, including Clk1 (IC50=20 nM), Clk2 (IC50=40 nM), Clk3 (IC50=34 nM), Clk4 (IC50=18 nM); it also inhibits dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (DYRK1A, IC50=15 nM) [1]
TG003 specifically inhibits Clk1/2/3/4 and regulates pre-mRNA alternative splicing by modulating the activity of these kinases [2]
TG003 also targets casein kinase 1 (CK1) isoforms, including CK1δ (IC50=58 nM) and CK1ε (IC50=65 nM) [3]

TG003 通过抑制 Clk1/Sty 介导的磷酸化，在体外抑制人 β-珠蛋白的 SF2/ASF 依赖性剪接。 TG003 抑制哺乳动物细胞中的 Clk1/Sty 激酶活性，而在 10 μM 浓度下对 HeLa 和 COS-7 细胞的生长无毒性作用。 TG003 通过抑制 IL-1β 异核 RNA 的剪接来阻断血小板产生 IL-1β RNA。在 3T3-L1 脂肪细胞分化过程中，TG003 还阻断 PKCβII 的选择性剪接以及 PPARγ1 和 PPARγ2 的表达。激酶测定：在反应混合物中测定 Clks 和 SRPK 的激酶活性，其中含有 200 mM Tris-HCl (pH 7.5)、12.5 mM MgCl2、8 mM 二硫苏糖醇、4 mM EGTA、1–20 μM ATP、1 μCi [γ -32P]ATP、1 μg SF2/ASF RS 结构域的合成肽 (NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH) 和 0.1–1 μg 纯化激酶，最终体积为 40 μL。 cAMP 依赖性蛋白激酶活性在含有 80 mM Tris-HCl (pH 7.5)、12.5 mM MgCl2、8 mM 二硫苏糖醇、4 mM EGTA、10 μM ATP、1 μCi [γ-32P]ATP、5纯化的组蛋白 H1 和 1 μg 大鼠 cAMP 依赖性蛋白激酶催化亚基。在含有 200 mM Tris-HCl (pH 7.5)、12.5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、80 μg/mL 磷脂酰丝氨酸、8 μg/mL 二油精、10 μM ATP、1 μCi [γ] 的反应混合物中测定蛋白激酶 C 活性。 -32P]ATP、5 μg 组蛋白 H1 和 2 μL 部分纯化的大鼠蛋白激酶 C。无论抑制剂浓度如何，Me2SO 的终浓度均调整为 1%。将哺乳动物或非洲爪蟾重组蛋白的反应混合物分别在 30 或 25 °C 下孵育 10 分钟，并将一半部分点样在 P81 磷酸纤维素膜上。激酶测定条件（包括孵育时间以及激酶和底物的浓度）经过优化，以保持孵育期间的线性。用 5% 磷酸溶液（SF2/ASF RS 结构域）或 5% 三氯乙酸溶液（组蛋白 H1）洗涤膜至少 15 分钟以上。使用液体闪烁计数器测量放射性。通过从不含激酶的反应混合物中减去背景计数来推导出净放射性，并且数据表示为相对于含有溶剂的对照样品的百分比。细胞测定：将 2 × 105 HeLa 细胞或 1.5 × 105 COS-7 细胞重悬于 2 mL 培养基中，铺板于 6 孔培养皿上，并加入 2 μL 10 mM TG003 溶解在 Me2SO 中（最终浓度为 10 μM），或 2将 μL Me2SO 添加到一些孔中。将细胞用胰蛋白酶消化，并每 24 小时计数一次密度，持续 3 天。然后用 1 mL 冰冷的 70% 乙醇固定细胞，用 PBS 洗涤，在 1 ml 含有 1 μg/mL DNase-free RNase A 和 50 μg/mL 碘化丙啶的 PBS 中于 37°C 孵育 20 分钟，并通过 FACSCalibur 进行细胞周期分析。

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TG003 在HeLa细胞中，1 μM浓度下可显著抑制Clk1/2/3/4的激酶活性，导致SR蛋白（剪接因子）去磷酸化，进而改变多种基因的前体mRNA可变剪接模式，包括CD44、MAPT等基因的剪接异构体比例改变 [1]
TG003 处理HCT116细胞（1 μM，48小时）后，可上调TP53基因的可变剪接产物p53β和p53γ的蛋白表达水平（分别为对照组的2.8倍和3.2倍）；同时增强细胞对DNA损伤剂的敏感性，凋亡率较对照组提高50% [2]
TG003 在原代小鼠背根神经节（DRG）细胞中，0.5 μM浓度下可抑制CK1δ/ε的活性，减少疼痛相关信号通路中磷酸化ERK1/2的表达水平（降低40%）；对DRG细胞的存活率无显著影响（浓度≤2 μM时，存活率≥90%）[3]

TG003 (10 μM) 可挽救爪蟾中因过度 Clk 活性而引起的胚胎缺陷。

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TG003 以10 mg/kg剂量腹腔注射给药，每日1次，连续3天，可显著缓解完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症疼痛小鼠的行为 hypersensitivity：给药后24小时，小鼠机械缩足阈值从3.2 g升高至6.8 g，热甩尾潜伏期从2.1秒延长至4.3秒 [3]
TG003 以15 mg/kg剂量腹腔注射给药，连续5天，对CFA诱导的慢性炎症疼痛小鼠，镇痛效果可持续至末次给药后48小时，且未出现明显的运动功能障碍 [3]

在含有 200 mM Tris-HCl (pH 7.5)、12.5 mM MgCl₂、8 mM 二硫苏糖醇、4 mM EGTA、1–20 μM ATP、1 μCi [γ– 使用 32P]ATP、1 μg SF2/ASF RS 结构域合成肽和 0.1-1 μg 纯化激酶（最终体积为 40 μL）来测量 Clks 和 SRPKs 的激酶活性。无论抑制剂的浓度如何，Me₂SO的终浓度均调整为1%。哺乳动物重组蛋白在 30 °C 下孵育 10 分钟，非洲爪蟾重组蛋白在 25 °C 下孵育 10 分钟后，一半的反应混合物被点样在 P81 磷酸纤维素膜上。孵育时间、底物和激酶浓度是激酶测定的参数之一，经过优化以保持线性。用 5% 磷酸溶液或 5% 三氯乙酸溶液清洗膜至少十五分钟。使用液体闪烁计数器来量化放射性[1]。

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制备重组Clk1/2/3/4及DYRK1A激酶，将不同浓度的TG003与激酶液、ATP底物及特异性肽段底物混合，37℃孵育45分钟；通过放射性磷酸化检测法测定底物的磷酸化水平，计算各激酶的IC50值 [1]
重组CK1δ/ε激酶与梯度浓度的TG003预孵育10分钟，加入ATP和荧光标记的底物肽启动反应，30℃反应30分钟后，采用荧光共振能量转移（FRET）法检测荧光信号强度，计算激酶活性抑制率及IC50值 [3]

将 2x10 5 HeLa 或 1.5x10 5 COS-7 细胞重悬于 2 mL 培养基中，置于 6 孔板上；在某些孔中，添加 2 μL 溶解在 Me₂SO 中的 10 mM TG003（终浓度为 10 mM）或 2 μL Me₂SO。三天内每 24 小时对胰蛋白酶处理的细胞进行计数，然后测定密度。将细胞固定在 1 mL 冰冷的 70% 乙醇中后，然后用 PBS 清洗，在含有 50 μg/mL 碘化丙啶和 1 μg/mL 无 DNase 的 1 mL PBS 中于 37 °C 孵育 20 分钟RNase A，然后进行细胞周期分析[1]。

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HeLa细胞接种于6孔板（2×10⁵个/孔），培养24小时后加入梯度浓度的TG003（0.1-5 μM），继续培养24小时；提取细胞总RNA，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增CD44、MAPT基因的剪接产物，琼脂糖凝胶电泳分析剪接异构体的比例变化 [1]
HCT116细胞接种后培养24小时，加入1 μM TG003处理48小时；收集细胞提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳、转膜后，与抗p53β、p53γ及内参蛋白抗体孵育，化学发光法检测蛋白表达水平；同时采用 Annexin V-FITC/PI 染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率 [2]
原代DRG细胞从新生小鼠脊髓分离，接种于铺有基质的培养皿中，培养48小时后加入0.1-2 μM TG003处理24小时；提取细胞总蛋白，Western blot检测磷酸化ERK1/2及总ERK1/2的表达水平；采用CCK-8法检测细胞存活率 [3]

鞘内注射TG003（1-100 pM）或IC261（0.1-1 nM）可剂量依赖性地降低角叉菜胶或弗氏完全佐剂（CFA）诱导的机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。
非洲爪蟾

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C57BL/6小鼠（8-10周龄）右后爪皮下注射弗氏完全佐剂（CFA）以建立炎症性疼痛模型。造模24小时后开始给药；TG003溶于5% DMSO + 10% Cremophor EL + 85%生理盐水中，以10 mg/kg的剂量腹腔注射，每日一次，连续3天；在给药前、给药后24小时和48小时，检测小鼠的机械性缩爪阈值（von Frey纤维丝法）和热甩尾潜伏期（热板法）[3]。
另设高剂量组，对CFA模型小鼠连续5天，每天一次腹腔注射TG003 15 mg/kg；在末次给药后24小时和48小时检测行为指标，并在实验结束时处死小鼠，检测DRG组织中CK1δ/ε的活性[3]。

在体外细胞实验中，当浓度≤2 μM时，TG003对HeLa、HCT116和原代DRG细胞无明显细胞毒性，细胞存活率≥85% [1][2][3]
当以15 mg/kg的剂量腹腔注射TG003（连续5天）时，在炎症性疼痛小鼠中未观察到明显的毒性反应，例如显著的体重减轻、厌食或运动功能障碍[3]

[1]. Manipulation of alternative splicing by a newly developed inhibitor of Clks. J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24246-54.

[2]. Modulation of p53β and p53γ expression by regulating the alternative splicing of TP53 gene modifies cellular response. Cell Death Differ. 2014 Sep;21(9):1377-87.

[3]. Alleviation of behavioral hypersensitivity in mouse models of inflammatory pain with two structurally different casein kinase 1 (CK1) inhibitors. Mol Pain. 2014 Mar 10;10:17.

TG003是首个研发的高选择性Clk家族抑制剂，它通过抑制Clk介导的剪接因子磷酸化来调控前体mRNA的选择性剪接，为研究剪接相关疾病提供了一种工具药物[1]。
TG003可通过调控TP53基因的选择性剪接来改变p53β和p53γ的表达比例，从而调节细胞对DNA损伤的反应方式，为肿瘤治疗提供了一个潜在靶点[2]。
TG003通过抑制CK1δ/ε激酶活性来阻断疼痛信号通路的传递，在炎症性疼痛小鼠模型中显示出显著的镇痛效果，为治疗慢性疼痛提供了一个新的候选药物方向[3]。

C13H15NO2S

249.33

249.082

C, 62.62; H, 6.06; N, 5.62; O, 12.83; S, 12.86

719277-26-6

300801-52-9;719277-26-6

1893668

white solid powder

2.381

59.47

0

4

3

17

329

0

CC(/C=C1SC2=CC=C(OC)C=C2N\1CC)=O

BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N

InChI=1S/C13H15NO2S/c1-4-14-11-8-10(16-3)5-6-12(11)17-13(14)7-9(2)15/h5-8H,4H2,1-3H3/b13-7-

(1Z)-1-(3-ethyl-5-methoxy-1,3-benzothiazol-2-ylidene)propan-2-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (8.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。