JAK2 (IC50=3 nM)
JAK2 (V617F) (IC50=3 nM)
Flt3 (IC50=15 nM)
Ret (IC50=48 nM)
Fedratinib is a potent and selective inhibitor of Janus kinase 2 (JAK2), a member of the JAK family of non-receptor tyrosine kinases. JAK2 plays a critical role in cytokine signaling pathways that regulate hematopoiesis, immune function, and inflammation. The compound inhibits both wild-type JAK2 and the JAK2V617F mutant kinase with IC50 values of 3 nM. The JAK2V617F mutation is a common driver of myeloproliferative neoplasms (MPNs), including myelofibrosis, polycythemia vera, and essential thrombocythemia. By inhibiting JAK2, Fedratinib blocks the phosphorylation and activation of signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins, which are downstream mediators of JAK signaling. This leads to the inhibition of cell proliferation and the induction of apoptosis in JAK2-dependent cells. Fedratinib shows 35-fold selectivity over JAK1 and 334-fold selectivity over JAK3, which is important for minimizing off-target effects. The compound also inhibits FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a receptor tyrosine kinase that is often mutated in acute myeloid leukemia (AML). This additional activity may contribute to its efficacy in certain hematological malignancies. The compound's ATP-competitive nature means it binds to the ATP-binding site of JAK2, preventing ATP from binding and thereby blocking kinase activity. Fedratinib's selectivity and potency make it a valuable tool for studying JAK2 signaling and for treating JAK2-driven diseases.

Fedratinib 盐酸盐水合物 (TG101348) 染色显示，在表达人 JAK2V617F 突变的乳腺癌前期 B 细胞系 (Ba/F3 JAK2V617F) 和 JAK2V617F 突变的人类成红细胞白血病 (HEL) 细胞系中，水肿情况有所改善；亲代 Ba 细胞的 IC50 值为 300 nM。/F3 细胞增殖受到显著抑制，IC50 值约为 420 nM[1]。将 Fedratinib 盐酸盐水合物 (TG101348) (0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM 和 10 μM) 应用于细胞。该化合物在与细胞凋亡所需浓度相似的浓度下可降低 STAT5 磷酸化水平，并以剂量递增的方式诱导 HEL 的发生[1]。 Ba/F3 JAK2V617F 细胞的消毒 [1]。

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Fedratinib (TG-101348) 的体外特性 [1]
TG101348 是一种小分子 ATP 竞争性抑制剂，采用基于结构的药物设计方法设计和合成，可抑制 JAK2，但不抑制其他密切相关的激酶（在线提供的图 S1；表 1；表 S1）。TG101348 对 JAK2 具有高度的激酶选择性。例如，TG101348 对密切相关的 JAK3 的 IC50 值高约 300 倍，并且对 JAK1 和 TYK2 家族成员的抑制作用较弱。TG101348 的活性已在多种基于细胞的检测中进行了评估。 TG101348抑制了携带JAK2V617F突变的人类成红细胞白血病（HEL）细胞系以及表达人JAK2V617F的鼠前B细胞系（Ba/F3 JAK2V617F）的增殖，两种细胞系的IC50值均约为300 nM（图1A；表S2）。亲代Ba/F3细胞的增殖也受到类似程度的抑制，IC50值约为420 nM，这与IL-3依赖性信号通路在亲代细胞系中的关键作用相一致（图S2A）。将这些细胞暴露于TG101348后，在与抑制细胞增殖所需浓度相近的浓度下，STAT5磷酸化水平降低（图1B）。根据上述结果以及这些细胞增殖和存活均需JAK2活性的前提，TG101348以剂量依赖的方式诱导HEL和Ba/F3 JAK2V617F细胞凋亡（图1C）。相反，TG101348在浓度高达10 μM时，对对照正常人真皮成纤维细胞未显示出促凋亡活性，且其对成纤维细胞的抗增殖IC50值大于5000 nM（图S2B）。这些数据表明，在基于细胞的转化实验中，TG101348 是一种强效且高选择性的 JAK2 激酶抑制剂。

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通过流式细胞术和造血集落形成评估 Fedratinib (TG-101348) 的疗效 [1]
对接受 TG101348 或安慰剂治疗的小鼠的脾细胞或骨髓进行了比较流式细胞术分析。与载体组相比，120 mg/kg 剂量组小鼠骨髓中 JAK2V617F 阳性 CD71 单阳性早期红系祖细胞减少了约 2 倍 (p < 0.01)。在该药物剂量下，小鼠骨髓或脾脏中表达 Gr1 和 Mac1 标记的中性粒细胞/单核细胞谱系细胞数量也观察到类似的减少。与对照组相比，成熟 B 细胞受到的影响较小（图 3A）。

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体外 Fedratinib (TG-101348) 对真性红细胞增多症 (PV) 祖细胞红系分化的抑制作用 [2]
TG101348（图 1A）由 TargeGen 公司采用基于结构的药物设计方法设计和合成，用于抑制 JAK2 和 JAK2V617F 激酶（两者 IC50 均为 3 nM；数据未显示）。与其他现有抑制剂不同，TG101348 不抑制其他密切相关的激酶，例如 JAK3（IC50 = 1040 nM；数据未显示）。在五项独立实验中，从三名 JAK2V617F+ PV 患者（表 1）中分离出造血干细胞（HSC；CD34+CD38−CD90+Lin−）和髓系祖细胞（CMP；CD34+CD38+CD123+CD45RA−Lin−），并采用 FACS 分选法（Jamieson 等，2006；Manz 等，2002）将其分选到添加了人类细胞因子和递增浓度 TG101348 的甲基纤维素中。在第14天进行菌落计数。这些实验表明，300 nM 的 TG101348 显著抑制了真性红细胞增多症 (PV) 祖细胞向红系分化的倾向（BFU-E；p = 0.02），混合菌落 (CFU-Mix；p = 0.05) 的形成也受到抑制（图1B）。在此剂量下，未观察到对其他菌落类型的显著抑制，尽管 CFU-GM 有抑制的趋势（p = 0.17），但未达到统计学意义。三个实验揭示了红系菌落对 TG101348 抑制作用的剂量依赖性敏感性（图1C），而其他菌落类型则不然（在线提供的图S1A和S1B）。采用直接半定量测序方法分析集落中 JAK2V617F+ 的表达，结果显示突变等位基因频率降低，但检测到个体对 TG101348 的敏感性存在差异（图 1C）。

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体外用Fedratinib (TG-101348)抑制 JAK2V617F 驱动的红系分化 [2]
通过在造血祖细胞测定中，利用慢病毒强制表达（Naldini 等，1996）正常脐带血祖细胞中的 JAK2V617F 或野生型 JAK2，研究了 JAK2V617F 在偏向分化潜能中的作用。表达JAK2V617F的脐带血祖细胞主要形成红系集落（BFU-E），而野生型JAK2诱导的混合型集落（CFU-Mix）形成量高于骨架载体对照组（图2A；n = 4次实验）。使用针对慢病毒载体导入的JAK2（mJAK2）的特异性引物进行PCR，然后进行测序，以验证慢病毒载体对集落的转导（图2B）。在随后的体外实验（n = 4）中，将慢病毒骨架、JAK2V617F或野生型JAK2（WT JAK2）转导的人脐带血造血干细胞（HSC）用或不用300 nM的TG101348处理，然后接种到添加了人细胞因子的甲基纤维素培养基上。这些实验表明，TG101348 可选择性抑制 JAK2V617F 偏向的红系集落形成（图 2C）。

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JAK2 驱动的红系信号转导通路被Fedratinib (TG-101348)抑制[2]
通过 Q-PCR 检测 PV 祖细胞中红系 (GATA-1) 和髓系 (PU.1) 转录因子转录本的变化，研究了 JAK2V617F 增强红系分化的机制（图 5A）（Galloway 等，2005；Hsu 等，2004）。尽管真性红细胞增多症（PV）和正常祖细胞之间PU.1转录水平没有显著差异（p = 0.44），但PV祖细胞中GATA-1的表达显著升高（p = 0.049），这与其增强的红系分化潜能相符（图5A）。同样，JAK2V617F慢病毒转导增强了GATA-1的表达，但抑制了巨核细胞转录因子FOG-1的表达，进一步使转录组谱向增强的红系分化方向偏移（数据未显示）（Deconinck等人，2000；Galloway等人，2005；Hsu等人，2004）。 TG101348 处理逆转了 JAK2V617F 对 GATA-1 与 PU.1 转录本的增强作用以及对 FOG-1 表达的抑制作用（图 5B）。在经 TG101348 处理的 JAK2V617F 转导细胞中，GATA-1/PU.1 转录本比率显著下降至 25%（p = 0.017）（图 5B，左图），但在骨架转导细胞中则没有下降（p = 0.47）。同样，在经TG101348处理的JAK2V617F转导细胞中，FOG-1转录水平增加了30%（数据未显示），GATA-1/FOG-1转录水平比值显著降低了52%（p = 0.05）（图5B，右图）（InStat分析，双尾t检验），逆转了增强的红系分化。
体外实验表明，Fedratinib能有效抑制JAK2激酶活性，对野生型和JAK2V617F突变型激酶的IC50均为3 nM。这种抑制作用导致JAK2介导的信号通路（包括JAK-STAT通路）被阻断。在JAK2依赖性细胞系（例如表达JAK2V617F的Ba/F3细胞、HEL细胞和SET-2细胞）中，Fedratinib抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。该化合物对STAT5磷酸化（JAK2激活的下游标志物）的影响可用于验证其靶点抑制作用。Fedratinib还显示出对FLT3的活性，可抑制FLT3激酶活性和FLT3依赖性细胞的增殖。该化合物的体外活性已得到充分表征，并成为其用于治疗骨髓增生性肿瘤（MPN）和急性髓系白血病（AML）的基础。该化合物的效力和选择性已在多种基于细胞的检测中得到证实，从而验证了其作为JAK2抑制剂的作用机制。

在C57Bl/6小鼠中，Fedratinib盐酸盐水合物（TG101348；每日两次；42天；灌胃给药；60-120 mg/kg）治疗显著减轻了脾肿大，并以剂量依赖的方式降低了红细胞增多症[1]。

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Fedratinib (TG-101348) 在JAK2V617F诱导的真性红细胞增多症小鼠模型中的疗效[1]
研究设计[1]
我们测试了TG101348在已建立的真性红细胞增多症小鼠骨髓移植模型中的疗效，该模型重现了人类疾病的许多特征。简而言之，将携带突变型JAK2V617F等位基因的鼠嗜性逆转录病毒转导至原代造血细胞，并在骨髓移植到致死剂量照射的同基因受体小鼠后第26天，通过外周血细胞分类计数评估红细胞增多症的发展情况。所有小鼠在第27天开始治疗前均出现红细胞增多症，平均血细胞比容≥70%。将动物分为治疗组和载体对照组（每组约20只小鼠）。由于鼠红细胞的半衰期约为40-50天，因此对动物进行为期42天的治疗试验，以评估治疗对红细胞增多症的影响，以及评估潜在的血液学毒性，包括T细胞免疫抑制和其他毒性。 TG101348 以 60 mg/kg 或 120 mg/kg 的剂量，每日两次，连续 42 天通过灌胃给药，而对照组仅接受赋形剂。试验期间处死濒死小鼠，试验结束时处死所有剩余小鼠。共进行了三项独立试验，分别用 TG101348 或赋形剂治疗小鼠，共纳入 56 只安慰剂组小鼠和 112 只药物治疗组小鼠，这些小鼠均患有 JAK2V617F 诱导的红细胞增多症。
治疗动物的存活率和反应 [1]
在研究过程中，安慰剂组有 6 只动物死亡，60 mg/kg 药物组有 1 只动物在第 18 天死亡，而所有接受 120 mg/kg Fedratinib (TG-101348) 治疗的动物在研究结束时均存活（图 2A）。眼眶后静脉丛取样外周血显示，与安慰剂组（hct 86%）相比，接受 60 mg/kg 治疗的动物的血细胞比容平均降低了约 5.1%（hct 80.9%）（p < 0.05），接受 120 mg/kg 治疗的动物的血细胞比容平均降低了约 17.9%（hct 68.1%）（p < 0.0001），研究终点为第 42 天。因此，红细胞增多症呈剂量依赖性降低（图 2C）。此外，与载体对照组相比，治疗组动物的脾肿大程度显著降低，且呈剂量依赖性（图 2B 和 2C）。

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Fedratinib (TG-101348) 对人真性红细胞增生祖细胞移植的抑制作用 [2]
在生物发光异种移植模型中，我们评估了真性红细胞增生干细胞和祖细胞与正常对应细胞相比产生人红细胞的能力。该模型涉及将荧光素酶转导的（Breckpot 等，2003）人祖细胞肝内移植到新生高度免疫缺陷（RAG2−/−γc−/−）小鼠（Traggiai 等，2004）中（图 3A）。生物发光成像显示正常祖细胞和PV祖细胞的移植率相当（图3B），但对移植的造血器官进行FACS分析发现，移植小鼠造血器官中的PV祖细胞具有体内红系分化的倾向（图3C）。在四项独立的实验中，灌胃给予TG101348（120 mg/kg）显著抑制了PV祖细胞在体内的红系分化（p = 0.02）（图3D）。此外，对移植了PV祖细胞的小鼠的造血组织进行测序分析显示，TG101348治疗后JAK2V617F表达相应降低。

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选择性抑制JAK2V617F驱动的红系移植[2]
我们研究了PV祖细胞红系移植的增强是否依赖于JAK2V617F或野生型JAK2的表达，以及这种移植是否易受Fedratinib (TG-101348)抑制。在这些实验中，将正常脐带血祖细胞用骨架基因、JAK2V617F或野生型JAK2进行转导，然后肝内移植到新生RAG2−/−γc−/−（Traggiai等人，2004）受体小鼠体内（图S3）。经12天灌胃给予Fedratinib (TG-101348) (120 mg/kg)治疗后，定量生物发光成像分析显示，与移植骨架细胞（p = 0.61）和野生型JAK2（p = 0.67）祖细胞的小鼠相比，表达JAK2V617F的祖细胞的植入率降低（p = 0.08）（图4A）。FACS分析显示，在TG101348治疗的移植受体中，JAK2V617F驱动的红系植入显著受到抑制（p = 0.037），而野生型JAK2（p = 0.077）和骨架细胞（p = 0.27）来源的人红系植入率未见显著降低（图4B）。这些体内研究表明，JAK2V617F转导的脐带血祖细胞增强的红系植入潜能对TG101348的抑制作用比野生型JAK2转导的祖细胞更为敏感。虽然TG101348降低了人类骨髓中的植入，但它并不抑制JAK2V617F表达的祖细胞在胸腺中的T细胞植入（图S4A和S4B）。由于JAK3是T细胞发育所必需的，这些观察结果进一步强调了TG101348对JAK2的选择性。
Fedratinib在骨髓增生性疾病的小鼠模型中显示出体内抗肿瘤疗效。口服该化合物可抑制肿瘤生长、减轻脾肿大并改善疾病相关的血液学指标。在JAK2V617F驱动的骨髓增生性肿瘤（MPN）小鼠异种移植模型中，Fedratinib可抑制恶性细胞增殖并恢复正常造血功能。该化合物的口服生物利用度是其体内疗效的关键因素，使其在临床前研究和临床实践中均可方便地给药。Fedratinib已在关键的II期和III期临床试验中进行了评估，包括JAKARTA研究，该研究证实了其对骨髓纤维化患者的临床疗效，包括既往接受过鲁索替尼治疗的患者。该化合物的体内活性归因于其对JAK2的强效选择性抑制，从而阻断了驱动MPN的异常信号通路。

通过无细胞激酶活性测定法测定IC50值
TG101348的IC50值采用商业方法测定：使用Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）激酶谱分析服务，对包括JAK2和JAK2V617F在内的223种激酶进行筛选；或使用Carna Biosciences（日本神户）服务，对所有Janus激酶家族成员（包括JAK1和Tyk2）进行筛选。ATP浓度设定为每种激酶的Km值附近。[1]
无细胞激酶活性测定采用纯化的重组JAK2、JAK1和JAK3酶进行。将化合物与不同浓度的ATP和合适的肽底物一起孵育。通过检测放射性磷酸盐[γ-32P]ATP掺入底物的情况或使用发光ADP检测方法来测定激酶活性。 IC50值代表抑制50%激酶活性所需的化合物浓度，由剂量反应曲线确定。这些无细胞检测对于表征Fedratinib作为JAK2抑制剂的效力和选择性至关重要。通过在不同ATP浓度下进行激酶活性测定并分析抑制模式，可以证实该化合物的ATP竞争性。除了JAK2、JAK1和JAK3之外，还可以评估该化合物对其他激酶（包括FLT3）的活性，以确定其选择性。这通常使用一组重组激酶，并采用类似的检测方法进行。无细胞检测数据提供了化合物抑制活性的定量指标，并用于将其效力与其他JAK2抑制剂进行比较。这些数据对于理解化合物的构效关系（SAR）以及指导设计更有效、更具选择性的抑制剂也至关重要。无细胞检测的结果与细胞和体内研究相辅相成，从而全面展现了该化合物的生物活性。

XTT 法用于细胞增殖、凋亡和 DNA 片段化检测 [1]
将约 2 × 10³ 个细胞接种于微孔板孔中，每孔加入 100 μl RPMI-1640 培养基，并加入指定浓度的抑制剂。与 Fedratinib (TG-101348) 孵育 72 小时后，向每孔加入 50 μl XTT 染料，并在 CO₂ 培养箱中孵育 4 小时。使用分光光度计在 450 nm 处测定生成的甲臜产物的吸光度，并在 650 nm 处进行校正。使用 GraphPad Prism 4.0 软件确定抑制细胞增殖 50% 所需的浓度 (IC50)。所有实验均重复三次，结果以未处理细胞的生长量进行标准化。采用DMSO和递增浓度的抑制剂诱导DNA片段化，检测EpoBa/F3 JAK2V617F、Ba/F3p210、HEL和K562细胞的凋亡情况。

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蛋白质印迹分析[1]
将细胞在RPMI-1640培养基中用DMSO和递增浓度的抑制剂处理4小时，然后收集于含1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物片剂的1×细胞裂解缓冲液中。使用Pierce Biotechnology BCA法定量蛋白裂解液。取等量蛋白与Laemmli上样缓冲液和β-巯基乙醇混合，煮沸5分钟，然后在4%–15% Tris-HCl梯度凝胶上进行电泳分离。将凝胶转移至 0.45 μm 硝酸纤维素膜（Bio-Rad），用 5% 脱脂奶粉封闭，然后与一抗在封闭液或 5% BSA 中孵育。随后，将膜与驴抗兔 IgG 红外荧光标记二抗（700 nm 发射，LICOR）和山羊抗鼠 IgG 红外荧光标记二抗（800 nm 发射）的混合物孵育。用 PBS 洗涤后，使用 LICOR Odyssey 扫描仪扫描膜，以检测总 STAT5 蛋白（红色）和磷酸化 STAT5 蛋白（绿色）。

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PV 祖细胞集落 JAK2 突变分析 [2]
对用载体或 Fedratinib (TG-101348) 处理的 PV 祖细胞集落进行 JAK2V617F 表达的测序分析。将菌落挑取后重悬于200 μl添加了β-巯基乙醇的RLT缓冲液中，并立即置于−80°C冷冻保存。解冻样品后提取RNA，随后进行cDNA合成，并使用JAK2特异性引物进行PCR扩增（Jamieson等，2006）。采用荧光变性高效液相色谱（DHPLC）技术和SURVEYOR错配切割分析（均使用WAVE-HS系统）对JAK2 cDNA PCR产物进行突变分析。取所有样品的PCR产物（3–15 μl）进行DHPLC突变扫描，并通过Surveyor错配切割进行确认，最后使用BigDye V3.1终止子化学试剂在ABI 3100测序仪上进行双向序列分析鉴定突变。此外，为了半定量测定突变等位基因和正常等位基因的频率，使用WAVE Navigator软件，在标准化并与参考对照进行比较后，测定了DHPLC洗脱曲线和Surveyor错配切割产物的相对峰面积。
在细胞实验中，用不同浓度的Fedratinib处理JAK2依赖性细胞系（例如，表达JAK2V617F的Ba/F3细胞、HEL细胞、SET-2细胞）。使用MTT或CellTiter-Glo法评估细胞活力。通过Western blot或磷酸化流式细胞术检测STAT5磷酸化水平，以确认靶点抑制。评估该化合物对细胞增殖、凋亡和细胞周期进程的影响。在FLT3依赖性细胞系中，评估该化合物对FLT3磷酸化和细胞增殖的影响。这些细胞实验对于理解JAK2抑制的功能后果以及验证该化合物作为JAK2抑制剂的活性至关重要。该化合物在细胞系统中的效力和选择性与其在无细胞实验中的活性一致。这些实验结果为该化合物的临床应用和耐药性监测提供了宝贵信息。

动物/疾病模型： JAK2V617F 突变诱导的 C57Bl/6 小鼠 [1]
剂量： 60 mg/kg，120 mg/kg
给药途径： 口服（po）；[1] 每日两次；持续 42 天
实验结果： 显示出血细胞比容和白细胞计数的统计学显著降低，以及髓外造血的剂量依赖性降低/消除。

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Fedratinib (TG-101348) 在 C57Bl/6 小鼠中的药代动力学特性 [1]
54 只 C57Bl/6 小鼠被分为 3 组，每组 18 只小鼠。分别给予动物单次口服剂量 30、100 和 200 mg/kg 的药物。动物可自由摄取食物和水。采用复合采样法生成 Fedratinib (TG-101348) 在以下时间点（每个时间点 n = 3）的血浆浓度-时间曲线：给药后 0.5、1、3、5、7 和 24 小时。血浆样本的处理方法为：加入 2 倍过量的含内标的乙腈，然后离心。分离上清液进行分析。采用 LC/MS/MS 对处理后的血浆样本进行定量，并使用在未处理的小鼠血浆中制备的外部校准标准品进行校准。基质校准标准品和质量控制 (QC) 样本的制备方法是将 Fedratinib (TG-101348) 储备液加入空白小鼠血浆中。外部校准曲线的浓度范围为 1.9 至 190 nM。将高于校准上限的样品用空白小鼠血浆稀释至校准范围内，然后重新分析。LC/MS/MS系统由Sciex API3000三重四极杆质谱仪、Agilent 1100高效液相色谱系统和CTC自动进样器组成。液相色谱分离在Zorbax SB 75 × 2.1 mm和3.5 μm反相色谱柱上进行。柱温保持在40°C。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。流速保持在0.40 mL/min。进样20 μL后，流动相B的比例保持在10% 0.5 min，然后在1.5 min内线性增加至90%。采用正离子模式下的电喷雾电离质谱法检测Fedratinib (TG-101348)及其内标。在多反应监测(MRM)模式下监测Fedratinib (TG-101348)及其内标的分子离子跃迁。

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小鼠模型及Fedratinib (TG-101348)治疗后小鼠的分析[1]
小鼠骨髓移植模型的构建和分析方法与之前描述的方法完全相同（Wernig等，2006）。简而言之，将1 × 10⁶个表达JAK2V617F的全骨髓细胞静脉注射到C57BL/6小鼠体内。在骨髓移植后第26天进行外周血细胞计数，以评估疾病的完全发展情况。从第28天开始，每天两次（bid）通过灌胃给予Fedratinib (TG-101348)，剂量分别为60 mg/kg、120 mg/kg或安慰剂，持续42天。在研究开始前、研究期间和研究终点，使用EDTA玻璃毛细管进行眼眶后非致死性眼出血，以评估血细胞分类计数。C57/Bl6小鼠在研究终点或根据IUCAC批准的方案指定的时间处死，该方案包括通过评估发病率来判断是否存在以下情况：体重减轻超过10%、毛发蓬乱、嗜睡和/或脾肿大超过中线。组织病理学方面，组织用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，并用苏木精-伊红染色，或用网状纤维染色评估纤维化。组织切片图像使用配备 SPOT RT 彩色数码相机 2.1.1 型的尼康 Eclipse E400 显微镜获取。图像分析使用 Adobe Photoshop 6.0 软件。流式细胞术中，细胞先用 PBS 洗涤，再用 2% 胎牛血清洗涤，冰上用 Fc 受体阻断剂封闭 10 分钟，然后在冰上用含 2% 胎牛血清的 PBS 中的单克隆抗体染色 30 分钟。所用抗体包括：别藻蓝蛋白 (APC) 标记的 ter119、Gr-1、CD4 和 B220，以及藻红蛋白 (PE) 标记的 Mac1、CD8（均为 1:200）和 CD71（1:100）大鼠抗小鼠抗体。洗涤后，将细胞重悬于含 0.5 μg/ml 7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 的含 2% 胎牛血清的 PBS 中，以便区分死细胞。使用 FACS Calibur 流式细胞仪进行流式细胞术分析，至少采集 10,000 个事件，并使用 FloJo 软件进行数据分析。结果以图表和基于散点图和 7-AAD 染色选择的活细胞的代表性散点图的形式呈现。

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人类真性红细胞增多症 (PV) 的生物发光异种移植模型 [2]
免疫缺陷的 RAG2−/−γc−/− 小鼠由 Irving Weissman 博士惠赠。小鼠在加州大学圣地亚哥分校摩尔斯癌症中心的动物饲养设施中饲养，并喂以磺胺甲噁唑水。为了评估移植潜能和体内分化能力，将JAK2V617F+ PV CD34富集细胞、造血干细胞或祖细胞（CD34+CD38+Lin−）用慢病毒荧光素酶GFP（Breckpot等人，2003）转导48小时，然后肝内移植到新生未照射的RAG2−/−γc−/−小鼠（Traggiai等人，2004）体内。通过非侵入性生物发光成像和造血组织流式细胞术分析来评估移植情况。在另一项实验中，将正常脐带血祖细胞与慢病毒荧光素酶GFP以及JAK2野生型、突变型和骨架慢病毒载体共转导，然后按照先前发表的方法将其肝内移植到RAG2−/−γc−/−小鼠体内，并通过非侵入性生物发光成像和FACS分析人源化细胞的植入情况（Traggiai等人，2004）。移植后的RAG2−/−γc−/−小鼠还接受了选择性JAK2抑制剂（Fedratinib (TG-101348)，120 mg/kg）或载体（DMSO）的灌胃治疗，每日两次，持续12天，并分析了其对植入的影响。在另一系列实验中，将造血干细胞（HSC）用JAK2V617F或骨架慢病毒载体转导，并分别添加（+）或不添加（−）TG101348（IN）或载体（DMSO），然后在骨髓培养基中培养7天，并通过定量PCR（Q-PCR）定量红系转录因子的转录水平（Jamieson等人，2006）。
在JAK2V617F驱动的骨髓增生性肿瘤小鼠异种移植模型中评估了Fedratinib的体内疗效。在这些模型中，将表达JAK2V617F的细胞植入小鼠体内，并每日口服一次Fedratinib。监测肿瘤生长、脾脏大小、血细胞计数和组织中STAT磷酸化水平以评估治疗反应。该化合物减轻脾肿大和改善血液学参数的能力是其在MPN模型中疗效的关键指标。 Fedratinib 也已在多项临床试验中进行评估，其中包括关键的 II 期 JAKARTA-2 试验。该试验表明，Fedratinib 对既往接受过鲁索替尼治疗的骨髓纤维化患者具有临床疗效。在这些试验中，Fedratinib 以每日一次口服 400 或 500 mg 的剂量给药。主要目标是评估 Fedratinib 对缩小脾脏体积的影响。该化合物还能改善全身症状，包括早饱、疲劳、盗汗、咳嗽和瘙痒。来自临床前和临床研究的体内疗效数据对于验证 JAK2 作为治疗靶点以及指导 Fedratinib 在临床实践中的应用至关重要。

吸收
口服400 mg后，Fedratinib的血浆峰浓度（Cmax）为1804 ng/mL，AUC为26,870 ng/hr/mL。Fedratinib的达峰时间（Tmax）为1.75-3小时。高脂早餐对Fedratinib的吸收无显著影响。
排泄
口服后，77%的Fedratinib经粪便排泄，其中23%为原药； 5%经尿液排泄，其中3%为原药。
分布容积
表观分布容积为1770 L。
清除率
Fedratinib的清除率为13 L/h。
代谢/代谢物
Fedratinib主要通过CYP3A4、CYP2C19和含黄素单加氧酶3代谢。关于Fedratinib代谢的其他数据尚不明确。

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生物半衰期
Fedratinib的半衰期为41小时，末端半衰期为114小时。

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TG101348 在 C57Bl/6 小鼠中的药代动力学特征[1]
在 C57Bl/6 小鼠中，单次口服 30 mg/kg 至 200 mg/kg 剂量的 Fedratinib (TG-101348) 后，评估了其药代动力学参数。口服 30、100 和 200 mg/kg 剂量 3 小时后，观察到血浆药物峰浓度 (Cmax) 分别为 0.68、3.58 和 4.28 μM（图 1D）。口服 TG101348 后，总血浆暴露量 (AUC) 随剂量呈线性增加。给药后7小时和24小时，100 mg/kg组的平均血浆药物浓度分别为0.483 μM和0.02 μM，表明每日两次（bid）给药可使血浆药物浓度持续高于细胞IC50。bid给药后未观察到稳态血浆药物浓度的显著累积。基于TG101348在30至200 mg/kg剂量范围内的口服药代动力学线性和可预测性，选择60 mg/kg和120 mg/kg的每日两次剂量在真性红细胞增多症小鼠模型中进行评估。
Fedratinib具有良好的口服生物利用度，口服吸收良好。它主要通过CYP3A4代谢。包括Cmax、Tmax、半衰期和生物利用度在内的药代动力学参数在临床前和临床研究中测定。在临床试验中，Fedratinib 每日口服一次，剂量为 400 或 500 mg。该化合物的药代动力学特征表现为半衰期支持每日一次给药。该化合物的生物利用度可能受多种因素影响，例如食物摄入和影响 CYP3A4 活性的合并用药。从这些研究中获得的药代动力学数据对于设计合适的给药方案以及解读疗效和毒性研究结果至关重要。此外，还需对该化合物的代谢和清除途径进行表征，以了解其在体内的消除情况。治疗药物监测可用于优化个体患者的给药方案。

肝毒性
在fedratinib治疗骨髓纤维化患者的上市前临床试验中，肝功能异常较为常见，但安慰剂组或对照组中也有部分患者出现肝功能异常。fedratinib治疗组中ALT升高的患者比例高达58%，而安慰剂组为14%至17%。然而，ALT超过正常值上限5倍的患者比例为9%或更低，且这些病例通常无症状或无黄疸。但在fedratinib的一项早期研究中，至少报告了一例伴有肝功能衰竭的严重急性肝炎病例。随后，随着监测的加强，未再报告具有临床意义的肝损伤病例。fedratinib获批后的临床经验有限。
此外，长期使用fedratinib和其他Janus激酶抑制剂与罕见的乙型肝炎病毒再激活病例相关，这些病例可能病情严重甚至致命。停用JAK抑制剂后，免疫重建会导致对病毒复制的免疫反应增强，此时病毒再激活通常会表现出临床症状。
概率评分：D（可能是易感患者出现临床可见肝损伤（包括乙型肝炎病毒再激活）的罕见原因）。

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妊娠和哺乳期影响
◉哺乳期用药概述
目前尚无关于哺乳期使用fedratinib的信息。大多数资料建议母亲在服用fedratinib期间不要哺乳。建议使用其他药物，尤其是在哺乳新生儿或早产儿时。制造商建议在最后一次给药后至少1个月停止哺乳。
◉对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到已发表的信息。
◉对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到已发表的信息。

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蛋白结合率
Fedratinib在血浆中的蛋白结合率≥92%。
Fedratinib的毒理学评价包括对胃肠道、血液学和肝脏影响的评估。临床应用中，曾有报道出现韦尼克脑病（一种由硫胺素缺乏引起的严重神经系统疾病），因此接受该药物治疗的患者需要进行硫胺素监测。动物临床前毒理学研究评估了该药物的安全范围和器官毒性。该药物的毒性可能包括胃肠道紊乱、贫血、血小板减少和肝酶升高。该药物的安全性已通过广泛的临床试验得到证实，并且在治疗剂量下通常耐受性良好。然而，包括韦尼克脑病在内的严重不良反应风险，使得对患者进行密切监测成为必要。该药物禁用于患有某些疾病的患者以及正在服用可能与Fedratinib发生相互作用的药物的患者。临床前和临床研究的毒理学数据对于指导该化合物在临床实践中的安全使用至关重要。

[1]. Efficacy of TG101348, a selective JAK2 inhibitor, in treatment of a murine model of JAK2V617F-induced polycythemia vera. Cancer Cell. 2008 Apr;13(4):311-20.

[2]. Selective inhibition of JAK2-driven erythroid differentiation of polycythemia vera progenitors. Cancer Cell. 2008 Apr;13(4):321-30.

盐酸菲拉替尼是菲拉替尼一水合物的二盐酸盐形式。菲拉替尼是一种小分子ATP竞争性抑制剂，具有较高的口服生物利用度，可抑制Janus激酶2 (JAK2) 和FMS样酪氨酸激酶3 (FLT3；CD135；STK1；FLK2)，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，菲拉替尼与野生型JAK2及其突变体竞争ATP结合位点，从而抑制JAK2活化，抑制JAK-STAT信号通路，抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。JAK2是bcr-abl阴性骨髓增生性疾病(MPD)中最常见的突变基因。此外，菲拉替尼还靶向FLT3，与其结合并抑制其活性。这可抑制FLT3的过度激活，从而抑制FLT3过表达肿瘤细胞的增殖。 FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶 (RTK)，在大多数 B 细胞肿瘤和急性髓系白血病中过度表达或发生突变，在肿瘤细胞增殖中起着至关重要的作用。另见：Fedratinib（含活性成分）。

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药物适应症
Inrebic 适用于治疗原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症后骨髓纤维化或原发性血小板增多症后骨髓纤维化成人患者的疾病相关脾肿大或症状，这些患者既往未接受过 Janus 激酶 (JAK) 抑制剂治疗或既往接受过鲁索替尼治疗。

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N-叔丁基-3-[[5-甲基-2-[4-[2-(1-吡咯基)乙氧基]苯胺基]-4-嘧啶基]氨基]苯磺酰胺是一种磺酰胺。
Fedratinib，也称为 SAR302503 和 TG101348，是一种酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗中危-2 和高危原发性或继发性骨髓纤维化。它是一种苯胺嘧啶衍生物。Fedratinib 于 2019 年 8 月 16 日获得 FDA 批准。Fedratinib 是一种口服选择性 Janus 激酶 2 (JAK-2) 和 FMS 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 抑制剂，用于治疗中危或高危原发性或继发性骨髓纤维化。Fedratinib 治疗期间血清酶水平升高较为常见，但临床上显著的急性肝损伤较为罕见。 Fedratinib 是一种口服生物利用度高的小分子 ATP 竞争性抑制剂，可抑制 Janus 激酶 2 (JAK2) 和 FMS 样酪氨酸激酶 3 (FLT3；CD135；STK1；FLK2)，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，Fedratinib 与野生型 JAK2 及其突变体竞争 ATP 结合位点，从而抑制 JAK2 的激活和 JAK-STAT 信号通路，抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。JAK2 是 bcr-abl 阴性骨髓增生性疾病 (MPD) 中最常见的突变基因。此外，Fedratinib 还可以靶向 FLT3 并抑制其活性。这可以抑制 FLT3 的过度激活，从而抑制 FLT3 过表达肿瘤细胞的增殖。 FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶 (RTK)，在大多数 B 细胞肿瘤和急性髓系白血病中过度表达或发生突变，并在肿瘤细胞增殖中发挥关键作用。
另见：盐酸菲拉替尼（活性成分）。
药物适应症

菲拉替尼适用于治疗中危-2 或高危原发性或继发性（真性红细胞增多症后或原发性血小板增多症后）骨髓纤维化的成年患者。
英特拉利尼适用于治疗既往未接受过 Janus 激酶 (JAK) 抑制剂治疗或既往接受过鲁索替尼治疗的原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症后骨髓纤维化或原发性血小板增多症后骨髓纤维化的成年患者的疾病相关脾肿大或相关症状。
作用机制：Fedratinib 是一种 Janus 激酶 2 (JAK2) 和 FMS 样酪氨酸激酶 3 的抑制剂。JAK2 在骨髓增生性肿瘤（例如骨髓纤维化）中高度活跃。Fedratinib 通过抑制 JAK2，从而抑制信号转导和转录激活因子 (STAT) 3 和 5 的磷酸化，进而阻止细胞分裂并诱导细胞凋亡。药效学：Fedratinib 是一种激酶抑制剂，可抑制细胞分裂并诱导细胞凋亡。服用 Fedratinib 的患者可能会出现贫血、血小板减少症、胃肠道毒性、肝毒性或淀粉酶和脂肪酶水平升高。这些不良反应应根据具体情况进行处理，例如减少剂量、暂时停药或输血。据报道，TG101348 是一种选择性小分子 JAK2 抑制剂，其体外 IC50 值约为 3 nM，在 JAK2V617F 突变诱导的骨髓增生性疾病小鼠模型中显示出治疗效果。在接受治疗的动物中，观察到血细胞比容和白细胞计数显著降低，髓外造血以剂量依赖的方式减少/消除，并且至少在某些情况下，骨髓纤维化症状得到缓解。未观察到明显的毒性，且对 T 细胞计数无影响。体内反应与替代终点相关，包括通过定量基因组PCR评估的JAK2V617F疾病负荷的降低/消除、内源性红系集落形成的抑制以及通过流式细胞术测量磷酸化Stat5评估的体内JAK-STAT信号转导的抑制。 [1] 真性红细胞增多症（PV）是一种骨髓增生性疾病（MPD），其特征是JAK2（JAK2V617F）信号突变、红细胞过度生成以及易患血栓形成、进展为骨髓纤维化或急性白血病。在本研究中，人工造血祖细胞中JAK2V617F的表达促进了红系集落的形成，并在免疫缺陷小鼠的生物发光异种移植模型中实现了移植。选择性JAK2抑制剂TG101348（300 nM）显著抑制了JAK2V617F+祖细胞（120 mg/kg）来源的异种移植瘤的集落形成和植入。TG101348处理降低了GATA-1的表达，而GATA-1的表达与JAK2V617F+祖细胞分化中的红系偏向相关。此外，TG101348还抑制了STAT5和GATA S310的磷酸化。因此，TG101348可能是一种有效的JAK2V617F+骨髓增生性疾病（MPD）抑制剂，并可用于临床试验。[2]
Fedratinib二盐酸盐水合物（CAS 1374744-69-0）是Fedratinib的盐形式，Fedratinib是一种强效、选择性、口服生物利用度高的ATP竞争性JAK2抑制剂。 Fedratinib 已获 FDA 批准用于治疗中危-2 或高危骨髓纤维化。该化合物对 JAK2 具有抑制作用，对野生型和 JAK2V617F 突变型激酶的 IC50 值均为 3 nM，且对 JAK1 和 JAK3 具有选择性。它还能抑制 FLT3。Fedratinib 主要用于治疗骨髓纤维化，并在临床试验中显示出显著疗效，可改善患者的预后和生活质量。该化合物以研究级化合物的形式提供，可用于体外和体内研究。它也被称为 TG-101348 和 SAR302503。该化合物不适用于已批准适应症以外的人类治疗用途，且必须在合格的医疗专业人员的指导下使用。研究人员在处理 Fedratinib 时，应遵循处理化学试剂的标准安全规程，包括使用适当的个人防护装备并遵守机构安全指南。

C27H40CL2N6O4S

615.615303039551

614.22

C, 52.68; H, 6.55; Cl, 11.52; N, 13.65; O, 10.40; S, 5.21

1374744-69-0

936091-26-8; 2468204-70-6 (HCl); 1374744-69-0 (HCl hydrate)

67517580

White to yellow solid

118Ų

6

10

11

40

787

0

Cl.Cl.S(C1C=CC=C(C=1)NC1C(C)=CN=C(N=1)NC1C=CC(=CC=1)OCCN1CCCC1)(NC(C)(C)C)(=O)=O.O

QAFZLTVOFJHYDF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H36N6O3S.2ClH.H2O/c1-20-19-28-26(30-21-10-12-23(13-11-21)36-17-16-33-14-5-6-15-33)31-25(20)29-22-8-7-9-24(18-22)37(34,35)32-27(2,3)4/h7-13,18-19,32H,5-6,14-17H2,1-4H3,(H2,28,29,30,31)2*1H1H2

N-tert-Butyl-3-{5-methyl-2-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-ethoxy)-phenylamino]-pyrimidin-4-ylamino}-benzenesulfonamide dihydrochloride monohydrate

SAR302503; SAR-302503; SAR 302503; TG101348; TG-101348; 1374744-69-0; fedratinib hydrochloride; Fedratinib dihydrochloride monohydrate; Fedratinib HCl hydrate; Fedratinib hydrochloride hydrate; UH9J2HBQWJ; Fedratinib (hydrochloride hydrate); SAR302503A; TG 101348

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~162.44 mM)
DMSO : ~100 mg/mL (~162.44 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。