| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 1mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
CDK12 (IC50 = 158 nM); CDK13 (IC50 = 69 nM); CDK7 (IC50 = 8.5 μM); CDK9 (IC50 = 10.5 μM)
THZ531 covalently and selectively inhibits cyclin-dependent kinase 12 (CDK12) and cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). In vitro IC₅₀ for CDK12 is 158 nM, and for CDK13 is 69 nM. Inhibition of CDK7 (IC₅₀ = 8.5 µM) and CDK9 (IC₅₀ = 10.5 µM) is >50-fold weaker. It covalently targets cysteine residues Cys-1039 in CDK12 and Cys-1017 in CDK13, located outside the kinase domain near the ATP-binding pocket. [1] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
激酶测定结果表明，THZ531 有效抑制 CDK12 和 CDK13，IC50 分别为 158 nM 和 69 nM；而 CDK7 和 CDK9 的抑制作用较弱 50 倍以上，IC50 分别为 8.5 和 10.5 µM。 THZ531 治疗导致 Jurkat 细胞增殖急剧且不可逆地减少，IC50 为 50 nM。用递增剂量的 THZ531 处理后的 FACS 细胞周期分析显示，表现出亚 G1 含量的细胞数量呈剂量和时间依赖性增加。在实验过程中，在 50 nM THZ531 下，与 DMSO 对照相比，未观察到凋亡细胞百分比增加。较高剂量的 THZ531 会导致明显的膜联蛋白 V 信号，72 小时内有 30% 至 40% 的膜联蛋白 V 阳性细胞被染色。还观察到 THZ531 处理后 Pol II 伸长显着减少[1]。
THZ531 在Jurkat T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞中表现出强效的抗增殖活性，处理72小时的IC₅₀为50 nM。它以剂量和时间依赖性方式诱导细胞凋亡，证据包括亚G1期细胞比例增加、Annexin V/PI染色以及PARP切割。在500 nM浓度下，它导致显著的转录下调（46%的转录本表达量降低≥1.5 log2倍）。处理降低了RNA聚合酶II C末端结构域（CTD）的Ser2磷酸化（pSer2），并减少了靶基因处的延伸Pol II，尤其影响DNA损伤反应（DDR）基因和超级增强子相关的转录因子基因（如RUNX1、MYB、TAL1、GATA3）。[1] 通过CRISPR/Cas9将CDK12的Cys-1039突变为丝氨酸（C1039S），可在HAP1细胞中部分恢复细胞增殖并减少凋亡，证实了靶点特异性。[1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
此外，THZ531与奥拉帕尼的联合治疗显著降低了动物模型中的肿瘤负担。[2]
接下来，在免疫缺陷的NSG小鼠体内测试了该组合。对KMS28皮下肿瘤测试了奥拉帕尼（30mg/kg，每天口服一次，每周五天）和/或THZ 531（10mg/kg，每天腹腔注射一次，每周五天）的效果（图4B）。在治疗的第三周，对肿瘤进行称重（图4C），肿瘤图像已在补充图S3中提供。在联合治疗组中观察到显著的协同作用。用THZ531治疗的小鼠体重略有减轻，但所有小鼠都健康活跃，没有出现毒性迹象。[2] 这些分子与PARP抑制剂的组合在体外细胞活力和DNA损伤检测中以及在包括PDX在内的多种尤文肉瘤模型中显示出显著的协同作用，在体内没有造血毒性。[3] 由于THZ531未针对体内研究进行优化，我们使用了母体化合物THZ1。我们首先证实了亲代分子和奥拉帕尼在体外的协同作用（图S5A）。然后，我们建立了尤文肉瘤的A673异种移植物小鼠模型，并进行了一项4臂研究，每天两次（BID）治疗赋形剂、10mg/kg THZ1、50mg/kg奥拉帕尼和奥拉帕尼+THZ1的组合，持续40天。奥拉帕尼和THZ1作为单一药物均显著降低了肿瘤生长率并延长了小鼠的存活期（奥拉帕尼组的中位存活率=18天载体、32天THZ1和28天）（图6A、B）。当两种药物联合使用时，观察到肿瘤生长率显著降低（图6A），与载体对照或单一药物相比，联合治疗显著延长了生存期（图6B）。当治疗结束时，联合组中70%的小鼠在第40天仍然存活（图6B）。将小鼠随访至第150天，无需进一步治疗。在第60天，联合组中40%（4/10）的小鼠仍然存活，而载体和单剂组中的所有小鼠都已被处死。此外，联合治疗组中20%的肿瘤已经退化到无法触及的位置（图6B）。为了测试这种治疗策略在尤文肉瘤中的普遍性，我们在使用TC71细胞的第二个异种移植物小鼠模型以及该疾病的患者衍生异种移植物（PDX）小鼠模型中进行了联合体内研究。在TC71异种移植物研究中，THZ1和奥拉帕尼作为单一药物均显著降低了肿瘤生长率并延长了生存期（图6C，D），与单独使用任何一种药物相比，THZ1与奥拉帕尼的联合使用显著降低了癌症生长率（图6C）。与奥拉帕尼组42天、THZ1组38.5天和联合治疗组66.5天相比，赋形剂治疗组小鼠的中位生存期为30.5天（图6D）。此外，我们建立了一种尤文肉瘤的PDX小鼠模型，该模型具有I型EWS/FLI融合，来自诊断时从12岁患者腓骨切除的肿瘤（HSJD-ES-002）。在该模型中，THZ1作为单一药物没有显著减少肿瘤进展（图6E），但显著提高了总体生存率（图6F）。重要的是，THZ1和奥拉帕尼的联合使用显著减少了肿瘤进展，提高了PDX的存活率（图6E，F）：载体，23天；奥拉帕尼，42天；THZ1，44天；联合用药56天。总的来说，这种药物组合比单独使用任何一种药物都能产生更深刻、更持久的反应。 [3] |
| 酶活实验 |
将 THZ531 或 DMSO 应用于细胞六小时。处理细胞，然后在冷 PBS 中洗涤两次，然后在下面提供的裂解缓冲液中裂解：50 mM Hepes pH 7.4、150 mM NaCl、1% Nonidet P40 替代品、5 mM EDTA、1 mM DTT 和蛋白酶/磷酸酶混合物。澄清后，使用 bio-THZ1 或 bio-TH531 在 4°C 下对裂解物进行过夜下拉。将裂解物在室温下进一步孵育三个小时，以最大限度地形成共价键。之后，将裂解物与链霉亲和素琼脂糖一起在 4°C 下再孵育两到三个小时以进行 Pulldown[1]。
将重组的CDK12-cyclin K和CDK13-cyclin K复合物与 THZ531 在含有Hepes、NaCl、KCl、MgCl₂、甘油和磷酸酶抑制剂的激酶缓冲液中孵育。通过加入冷ATP、[³²P]-γ-ATP和Pol II CTD肽底物启动反应，在30°C下振荡孵育30分钟。反应通过加入EDTA终止，并通过闪烁计数测量放射性。IC₅₀值通过三次重复实验确定。[1] 进行了时间依赖性预孵育实验，即在加入ATP和底物前，将 THZ531 与激酶复合物孵育不同时间（1–540分钟），证实了其共价结合动力学。[1] 使用Ambit结合技术和KiNativ细胞内分析进行了选择性分析，确认CDK12和CDK13是主要靶点，脱靶活性极低。[1] |
| 细胞实验 |
将 Jurkat 细胞以 20,000 个细胞/孔的新鲜培养基接种在 96 孔板中，并用指定浓度的 THZ531 或 DMSO 处理 72 小时。 HAP1 细胞以 12,000 个细胞/孔的新鲜培养基接种在 96 孔板中，24 小时后用指定浓度的 THZ531 处理 72 小时。评估 THZ531 的抗增殖作用。为了评估抑制剂冲洗对 Jurkat 细胞抗增殖的影响，用 THZ531 或 DMSO 处理细胞 6 小时。然后除去含有抑制剂的培养基并与或不与THZ531一起孵育66小时。评估 THZ531 的抗增殖作用。所有增殖测定均以生物学一式三份进行。 IC50 使用非线性回归曲线拟合来确定[1]。
对于抗增殖实验，将Jurkat或HAP1细胞接种于96孔板，用 THZ531 或对照化合物处理72小时。使用Cell Titer Glo发光法评估细胞活力。[1] 对于细胞凋亡分析，用 THZ531 处理细胞，用Annexin V和碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析。通过Western blot检测PARP切割。[1] 对于洗脱实验，用 THZ531 处理细胞6小时，然后更换为无药培养基，66小时后评估增殖情况。[1] 对于ChIP-seq实验，用甲醛交联Jurkat细胞，超声破碎染色质，使用针对CDK12、Pol II、pSer2或H3K27Ac的抗体进行免疫沉淀并测序。分析基因组区域的结合和信号密度。[1] 对于基因表达分析，用 THZ531 处理Jurkat细胞6小时，提取总RNA，加入ERCC RNA作为内参，使用微阵列或RT-qPCR进行分析。[1] |
| 动物实验 |
所有动物实验均遵循新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的方案。NSG 小鼠购自新加坡 InVivos 公司。小鼠饲养于新加坡国立大学动物研究设施内，保持无菌环境，温度 20–26 °C，湿度 50%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。小鼠可自由摄取食物和水。训练有素的比较医学工作人员每日监测小鼠的健康状况。在异种移植实验中，将 MM 细胞系 KMS-28（3 × 10⁶ 个细胞）皮下注射到 6 周龄 NSG 小鼠体内。小鼠随机分为四组：（1）口服奥拉帕尼（30 mg/kg）；（2）腹腔注射 THZ 531（10 mg/kg）；（3）同时接受奥拉帕尼和 THZ 531 治疗；（4）溶剂对照组。小鼠每周接受五次药物/稀释剂对照，持续三周。[2]
在体内研究中，THZ1 溶解于 10% DMSO 和 90% D5W 的混合溶液中，奥拉帕尼溶解于 10% DMSO 和 90% HPBCD 的混合溶液中。[3] THZ1 和奥拉帕尼联合用药研究：将 300 万个 A673 或 TC71 细胞皮下植入 7-8 周龄裸鼠雌性小鼠的右侧腹部。在 PDX 研究中，将 1 mm³ 的冷冻肿瘤组织块浸入基质胶中，并通过小手术植入小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠分为四组：载体对照组、THZ1 组、奥拉帕尼组以及 THZ1 和奥拉帕尼联合用药组。 THZ1 以 10 mg/kg 的剂量腹腔注射，每日两次；奥拉帕尼以 50 mg/kg 的剂量口服，每日两次。每周测量两次肿瘤大小，并观察小鼠的生存情况。采用对数秩检验分析生存曲线，确定统计学意义。[3] |
| 参考文献 |
[2]. THZ531 Induces a State of BRCAness in Multiple Myeloma Cells: Synthetic Lethality with Combination Treatment of THZ 531 with DNA Repair Inhibitors. Int J Mol Sci. 2022 Feb; 23(3): 1207.
[3]. EWS/FLI Confers Tumor Cell Synthetic Lethality to CDK12 Inhibition in Ewing Sarcoma. Cancer Cell . 2018 Feb 12;33(2):202-216.e6. |
| 其他信息 |
THZ531 属于吲哚类化合物，其化学名称为 5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-N-[(3R)-哌啶-3-基]嘧啶-2-胺，其中哌啶 NH 基团被 4-{[(2E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基]氨基}苯甲酰基取代。它是一种首创的 CDK12 和 CDK13 共价激酶抑制剂，IC50 值分别为 158 nM 和 69 nM。它具有诱导细胞凋亡、抗肿瘤和抑制 EC 2.7.11.22（细胞周期蛋白依赖性激酶）的作用。它属于吲哚类化合物、有机氯化合物、N-酰基哌啶类化合物、氨基嘧啶类化合物、烯酰胺类化合物、仲羧酰胺类化合物和仲氨基化合物。
THZ531是一种首创的CDK12和CDK13共价抑制剂，其设计基于THZ1（一种CDK7抑制剂）的结构。它与CDK12/13 C端延伸区的一个半胱氨酸残基不可逆地结合，从而能够选择性地靶向其他CDK。[1] 它能下调DNA损伤反应（DDR）基因（例如BRCA1、FANCF）和由超级增强子驱动的关键转录因子的表达，从而导致癌细胞的转录应激和凋亡。 [1] 它可能对依赖 CDK12/13 活性的癌症（例如 T 细胞急性淋巴细胞白血病和 BRCA 突变型癌症）具有治疗潜力，可能与 PARP 抑制剂联合使用。[1] |
| 分子式 |
C30H32CLN7O2
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|---|---|
| 分子量 |
558.0738
|
| 精确质量 |
557.23
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| 元素分析 |
C, 64.57; H, 5.78; Cl, 6.35; N, 17.57; O, 5.73
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| CAS号 |
1702809-17-3
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| 相关CAS号 |
1702809-17-3
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| PubChem CID |
118025540
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| 外观&性状 |
White to light yellow solid powder
|
| LogP |
4.1
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| tPSA |
106
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
6
|
| 可旋转键数目(RBC) |
8
|
| 重原子数目 |
40
|
| 分子复杂度/Complexity |
880
|
| 定义原子立体中心数目 |
1
|
| SMILES |
CN(C)C/C=C/C(=O)NC1=CC=C(C=C1)C(=O)N2CCC[C@H](C2)NC3=NC=C(C(=N3)C4=CNC5=CC=CC=C54)Cl
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| InChi Key |
RUBYHLPRZRMTJO-MOVYNIQHSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C30H32ClN7O2/c1-37(2)15-6-10-27(39)34-21-13-11-20(12-14-21)29(40)38-16-5-7-22(19-38)35-30-33-18-25(31)28(36-30)24-17-32-26-9-4-3-8-23(24)26/h3-4,6,8-14,17-18,22,32H,5,7,15-16,19H2,1-2H3,(H,34,39)(H,33,35,36)/b10-6+/t22-/m1/s1
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| 化学名 |
(E)-N-[4-[(3R)-3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]piperidine-1-carbonyl]phenyl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide
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| 别名 |
THZ-531; THZ531; THZ 53; (R,E)-N-(4-(3-((5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)piperidine-1-carbonyl)phenyl)-4-(dimethylamino)but-2-enamide; CHEMBL4163879; THZ 531; THZ-531; (E)-N-[4-[(3R)-3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]piperidine-1-carbonyl]phenyl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide; THZ531 HCl;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO: 100~250 mg/mL (179.2~448 mM)
Ethanol: ~4 mg/mL (~7.2 mM) |
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: 1.43 mg/mL (2.56 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (2.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 1.7919 mL | 8.9594 mL | 17.9189 mL | |
| 5 mM | 0.3584 mL | 1.7919 mL | 3.5838 mL | |
| 10 mM | 0.1792 mL | 0.8959 mL | 1.7919 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
 THZ531 covalently inhibits CDK12 and 13.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
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 THZ531 co-crystal structure with CDK12-cyclin K.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
 THZ531 induces apoptosis in Jurkat cells.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
 CDK12 binds regulatory and coding regions of active genes.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
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 THZ531 inhibits transcription elongation and gene expression.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
 THZ531 inhibits DDR and transcription factor gene expression.Nat Chem Biol.2016Oct;12(10):876-84. |
M1-20
CDK12-Cyclin K Ligand-Linker Conjugates 1
CGP-74514 dihydrochloride
(S)-CDK2 degrader 6
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